Summary
Et 3D-system med dyrkning menneskelige artikulær chondrocytter i høje niveauer af synovialvæsken er beskrevet. Synovialvæske afspejler den mest naturlige mikromiljø for ledbrusken, og kan let udtages og opbevares. Dette system kan derfor bruges til at studere brusk regenerering og til screening af lægemidler til behandling af gigt.
Abstract
Bruskdestruktionen er et centralt patologisk træk ved slidgigt, en førende årsag til invaliditet i USA. Brusk i den voksne ikke regenerere meget effektivt in vivo, og som et resultat, fører slidgigt til uoprettelige brusk tab og er ledsaget af kroniske smerter og immobilitet 1,2. Brusk tissue engineering tilbyder lovende potentiale til at regenerere og genoprette væv funktion. Denne teknologi involverer typisk såning chondrocytter i naturlige eller syntetiske stilladser og dyrkning den resulterende 3D konstruere på en afbalanceret medium over en periode på tiden med et mål om Engineering A biokemisk og biomekanisk modne væv, der kan transplanteres ind i en defekt websted in vivo 3-6 . At opnå en optimal betingelse for chondrocytter vækst og matrix deposition er afgørende for succesen af brusk tissue engineering.
I den indfødte fælles hulrum, brusken på Articular overfladen af knoglen er badet i synovialvæske. Denne klare og tyktflydende væske giver næringsstoffer til avascular ledbrusken og indeholder vækstfaktorer, cytokiner og enzymer, der er vigtige for chondrocytter stofskifte 7,8. Desuden synovialvæske letter lav friktion bevægelse mellem bruskspidserne overflader hovedsagelig gennem secernerende to centrale komponenter, hyaluronan og lubricin 9 10. I modsætning hertil er manipuleret væv brusk oftest dyrket i kunstige medier. Mens disse medier er sandsynligvis i stand til at yde mere definerede betingelser for at studere chondrocytter metabolisme, synovialvæske mest præcist afspejler den naturlige miljø, som artikulær chondrocytter bor i.
Faktisk synovialvæske har den fordel af at være let at indhente og opbevare, og kan ofte regelmæssigt fornys af kroppen. Flere grupper har suppleret dyrkningsmediet med ledvæske i voksende menneskelige, kvæg, kaniner og hunde chondrocytes, men mest bruges kun lave niveauer af synovialvæske (under 20%) 25/11. Mens kylling, hest og menneske chondrocytter har været dyrket i medium med højere procentdel af synovialvæske, disse kultur systemer var to-dimensionelle 26-28. Her kan vi præsentere vores metode til dyrkning menneskelige artikulær chondrocytter i et 3D-system med en høj procentdel af synovialvæske (op til 100%) over en periode på 21 dage. Dermed overvandt vi en stor forhindring forelagt af høj viskositet synovialvæsken. Dette system giver mulighed for at studere menneskets chondrocytter i synovialvæske i et 3D-indstilling, som kan yderligere kombineres med to andre vigtige faktorer (oxygenspændingen og mekaniske belastning) 29,30, som udgør det naturlige miljø for brusk til at efterligne det naturlige miljø for brusk vækst. Desuden kan dette system også anvendes til analysering synovialvæske aktivitet på chondrocytter og skabe en platform for udviklingbrusk regeneration teknologier og terapeutiske muligheder for gigt.
Protocol
En 3D-system til dyrkning menneskelige artikulær chondrocytter i synovialvæske
I dette arbejde, indkapslet vi menneskelige artikulær chondrocytter i alginat perler ved hjælp af en modificeret fremstilling-foreslået indkapsling protokol (Lonza, og 31). Ved hjælp af disse 3D-konstruktioner, har vi udviklet et system til dyrkning af celler i en kultur, medium, der indeholder forskellige procenter af menneskelige synovialvæske og har vurderet disse 3D-konstruktioner for brusk genekspression.
1. Forbered menneskelige artikulær chondrocytter (HAC) til tredimensionel (3D) med indkapsling
- Tø et hætteglas (1 ml) fra mennesker artikulær chondrocytter (HAC) (Lonza) (Passage 2) i 37 ° C vandbad i 1 min.
- Bland med 1 ml chondrocytter vækstmedier (Lonza) og centrifugeres ved 3000 rpm i 3-5 minutter til at indsamle cellerne. Supernatanten fjernes.
- Resuspender cellepelleten i chondrocytter vækstmedier (Lonza).
- Plate celler i en 10 cm vævagarplade (BD Biosciences), og kultur i chondrocytter vækstmedier (Lonza), indtil cellerne er sammenflydende. HACs bør anvendes på en passage tal ikke er højere end 3 eller 4 (P3 eller P4).
- Vask HACs på pladen med 155mm NaCl i stedet for standarden PBS, efterfulgt af trypsinzation til at indsamle celler til alginat perle indkapsling. Når cellerne er fritliggende, spin ned cellerne på 3000rpm 5min. Cellerne er nu klar til 3D indkapsling.
2. Indkapsle HACs til 3D perler
Resuspendér HACs i 1,2% alginat opløsning (Sigma) ved en massefylde på 8x10 5 celler / ml. Cell-numre blev bestemt forud for indkapsling, ved hjælp af en standard celletæller. Det er meget vigtigt at blande godt for at sikre en ensartet fordeling af cellerne i perlerne.
- Pipette den HAC / Alginatbandager løsning blandingen i en 12 ml sprøjte fastgjort til en 22-gauge kanyle (Tyco Healthcare, Inc.).
- I mellemtiden forbereder et 50 mL bægerglas med 102 mM CaCl 2 ved et volumen 5 gange, at af HAC / aginate løsning. Placer en røre bar inde i bægerglasset og rør de 102 mM CaCl 2-opløsning langsomt (ca. 150 rpm).
- Hold sprøjtens spids omkring 6 inches over overfladen af CaCl 2-opløsning og tilsæt HAC / alginat blandingen i CaCl 2-opløsning dråbevis. Generelt er den resulterende alginat perler 2 mm i diameter med en indkapsling tæthed på ca 10 4 celler / perle. Note: Højden af sprøjten over CaCl 2-opløsning er vigtig. Kortere afstand vil resultere i dråbeformede formede i stedet for kugleformede perler, der forårsager ujævn mekaniske integritet og celle indkapsling.
- Lad perlerne røre i CaCl 2-opløsning i 20-25 min. Mens andre alginat indkapsling protokoller tyder på en meget kortere inkubationstid på 10min, fandt vi, at længere inkubationstid med CaCl 2-opløsning øget integritet bliveannoncer.
- Fjern de CaCl 2-opløsning, vaske perler 2-3 gange i 2-3 mængder af NaCl, og derefter en gang i chondrocytter differentiering medium (Lonza). Mens andre alginat perle indkapsling protokoller indebærer hjælp af et filter for ovenstående vaskeprocedurer, fandt vi, at alginat perlerne bliver ofte fanget i filteret og tørre ud, og dermed reducere effektiviteten af indkapsling. Vi fandt det mest effektivt at lade perlerne til at bilægge til bunden af glasset før de kasserer løsningen.
- Brug en standard-spatel til at overføre perlerne i kultur retter. Vi plejer at kultur 12 perler pr 3 cm godt for 2 dage i chondrocytter vækstmedie for at tillade chondrocytter at tilpasse sig den indkapsling proces på mellemlang de blev voksne, før du skifter til chondrocytter differentiering medium (Lonza) med synovialvæske.
3. Kultur chondrocytter i synovialvæske dyrkningsmedium
- Frisk synovialvæske kan fås fra en outpatient klinikken (Vi fik synovialvæsken fra Tufts Medical Center). Synovialvæsken kan overføres på 15ml falk rør til laboratoriet, og straks centrifugeres ved 3000 rpm i 15min for at fjerne celle debris. Alikvot celle-fri synovialvæske til 1,5 ml mikrocentrifugerør, at undgå at gentagne fryse-optøning. Supernatanten kan opbevares ved -80 ° C indtil brug.
- Forud for dyrkning, bland synovialvæsken med chondrocytter differentiering medium (CDM, Lonza) med forskellige volumetriske nøgletal, med en konstant koncentration af 100mm ascorbinsyre og 9 mM CaCl 2 (dette spor mængde CaCl 2 er at sikre integriteten af alginat perler).
- Hold pladen på en vuggende platform i et 37 ° C inkubator (rokkende frekvens: ca 75 gange / min) for at hjælpe næringsstof fordeling inden for alginat perler, og for at mindske sammenklumpning af perlerne. Dette er især vigtigt, da vi kulturen disse chondrocytter i en længere periode (op til 4 uger). Bemærk: Mens chondrocytter vækst og differentiering medier (Lonza) indeholder to almindeligt anvendte antibiotika gentamycin og amphotericin, har vi ikke supplere ethvert antibiotika, når vi har brugt forskellige procentdel af synovialvæske for chondrocytter dyrkning. Ingen forurening blev aldrig observeret.
- Skift medier blandinger hver 2-3 dage. Viskositeten af synovialvæske har været en stor forhindring i dyrkning chondrocytter indkapslet i alginat kugler under langvarig kulturer. Vi fandt det mest effektive at fortynde synovialvæske-suppleret medium med 102mm CaCl 2 (50% V / V), som også styrker integritet alginat perler. På denne måde kan mediet langsomt fjernes med en pipette, uden at beskadige perler.
4. Harvest HACs i alginat perler for genekspressionsanalyse
Særlig forsigtighed skal udvises ved høst af HACs fra alginat perler for genekspression analyse.
- Vask alginat perler 3 TIMES i 102 mM CaCl 2 i ca 5 min hver gang.
- Hent chondrocytter ved at tilføje 55 mm NaCitrate på et volumen 4-5 gange, at af perlerne. Det er vigtigt, at alginat perlerne er helt nedsænket i NaCitrate løsning. Ryst eller rock i 20-30 min.
- Spin ned celler og supernatanten.
- Til RT-PCR-analyse, resuspender cellepelleten i celle lysis buffer (Qiagen RNA isolation kit), og fortsætte med RNA rensning.
5. Fix HACs i alginat perler for histologisk analyse
Særlig forsigtighed skal træffes for at høste HACs fra 3D-perler for histologisk analyse.
- Vask alginat perler 3 gange i 102 mM CaCl 2 i ca 5 min hver gang. For helt at vaske væk tyktflydende synovialvæsken, har vi fundet det mest effektive til at vaske med chondrocytter differentiering medium (Lonza) natten over, vuggende i en 37 ° C inkubator (rokkende frekvens: omkring 75 tidens / min). Den chondrocytter vækstmedie blev brugt til at sikre chondrocytter overlevelsen i denne forlængede vask og for at opnå maksimal penetration af fastsættelse agent.
- Fix perlerne i 70% ethanol natten over, og fortsætte med histologisk analyse. For at udføre DAPI farvning, inkuber alginat perler med DAPI opløsning (500ng/ml) for 1 time under blide rokkende, og vask til 3 gange med 102mm CaCl 2 i 15 min hver gang. DAPI billeder kan derefter ses under et fluorescerende mikroskop. Perlerne kan også være sektioneret for alcian blå og H & E farvning.
6. Repræsentative resultater
Vores 3D-dyrkning metode til human chondrocytter i høj procentandel af ledvæsken er afbildet i diagram vist i Fig.1. Efter menneskelige chondrocytter blev indkapslet i alginat perler, fik de lov til at vokse i medium suppleret med varierende forhold mellem synovialvæske. På grund af viskositeten af synovialvæsken, er det vigtigt atkultur chondrocytter under konstant rokkende betingelser for at forhindre sammenklumpning af brusk konstruktioner og for at sikre jævn fordeling af næringsstofferne. Det er også vigtigt at vaske alginat perler omfattende, før du henter den chondrocytter, således at fastsættelse eller lysisbuffer kan trænge ind i perler (Fig.1). Bright felt (BF) billeder af chondrocytter i alginat perlerne er vist i Fig.2. DAPI farvning blev udført for at bekræfte usniform distribution af celler i perler (fig. 2). I slutningen af 21-dages kultur periode blev genekspression analyse udført af QRT-PCR. Henvisningen genet GAPDH blev brugt til normalisering for alle PCRs, som det var fast besluttet på at være en af de mest pålidelige henvisningen gener for qPCR analyse på chondrocytter 32. Et eksempel er vist i Fig. 3, hvor vi analyserede resultaterne fra menneskelige artikulær chondrocytter kulturperler i synovialvæske blandet fra seks patienter med slidgigt. Overens med det faktum, at chondrocytter fraLonza er blevet udvidet i 2D kulturer, hvilket uundgåeligt ville føre til en de-differentiering 33, fandt vi, at Dag 0 chondrocytter udtrykt minimale niveauer af brusk matrix gener (Fig. 3). 3D-dyrkning af chondrocytter med chondrocytter differentiering medium (Lonza) eller medium suppleret med synovialvæske væsentligt forøget brusk genekspression af kollagen, aggrecan og MMP13, hvilket indikerer chondrocytter re-differentiering ved dag 21 (Fig.3) 34. Øge andelen af ledvæske i medierne resulterede i sammenlignelige niveauer af brusk matrix markører kollagen II og aggrecan mRNA udtryk (Fig.3A og 3B). Desuden chondrocytter kulturperler i 100% synovialvæske selv udstillet et fald i brusk nedværdigende enzym MMP13 mRNA udtryk i forhold til dem, der dyrkes i medium alene (Fig.3C). Interessant, udtrykket niveau celledød indikator caspase 3 gradvist faldt med stigende forhold mellem synovialvæske, tyder på, at synovial væske dyrkning har ført til faldet apoptose niveauer (Fig. 3D). Derfor er vores resultater viser, at dyrkning af menneskelige artikulær chondrocytter i høje niveauer af synovial væske i en 3D-indstilling er en mulig teknologi.
Tabeller og figurer
Figur 1. Skematisk diagram af metoden til kultur menneskelige artikulær chondrocytter i høj procentandel af synovialvæske i 3D alginat perler. For det første er chondrocytter og alginat løsning blandet. Når de anvendes dråbevist til CaCl 2-opløsning, er chondrocytter immobiliseret inden for krydsbundet Ca-alginat hydrogel perler. Disse 3D-konstruktioner er derefter dyrkes på chondrocytter differentiering medium (Lonza) med varierende forhold mellem mennesker synovialvæske. Efter 21 dage med dyrkning under en rokkende tilstand, er alginat perler indeholder celler vaskes ekstensivt hvorefter cellerne skal hentes til genudtryk analyse.
Figur 2. Bright felt (BF) og DAPI billeder af menneskelige artikulær chondrocytter indkapslet kulturer med 0%, 30%, 50%, 70% og 100% synovialvæske. Chondrocytter var kugleformet i alle dyrkningsbetingelser. Billeder af lyse felt (BF) og DAPI blev overlejret at bekræfte placeringen og fordelingen af chondrocytter. Mellemværker, forstørrede billeder. Pilespidser, colocalization af chondrocytter i BF og DAPI farvning billeder.
Figur 3. QRT-PCR-analyse af indkapslet menneskelige artikulær chondrocytter på dag 0 (D0) en efter 21 dages dyrkning (D21) i medium suppleret med varierende forhold mellem synovialvæske (SF) (0%, 30%, 50%, 70 % og 100%). Resultater af fire uafhængige prøver er vist her. GAPDH blev brugt som intern reference for alle PCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapport har vi udviklet en metode, der giver mulighed for dyrkning af humane artikulær chondrocytter i et 3D-miljø i medium, der indeholder høje koncentrationer af menneskelig synovialvæske. Synovialvæsken er en af de vigtigste komponenter, der udgør det naturlige miljø i den fælles hulrum, hvor artikulær chondrocytter bor. Har imidlertid viskositet synovialvæsken været en stor udfordring for tre-dimensionelle langsigtet dyrkning af chondrocytter. For at overvinde den udfordring at fastholde selv næringsstof distribution i en 3D-konstruktion i et tyktflydende miljø og for at forhindre sammenlægning, vi placeret brusk konstruerer under konstant bevægelse med blide vuggende. For at forbedre den strukturelle integritet af brusk konstruerer, vi ændrede den traditionelle procedure med såning chondrocytter til en alginat hydrogel, herunder optimering af den tid, for perle dannelse og medierne skiftende procedure 31. Sådanne procedurer er afgørende, nårbrusk konstruktioner håndteres i den tyktflydende synovialvæsken under længerevarende kulturer.
Vi mener, denne metode vil give os mulighed for at studere biologi menneskelige artikulær chondrocytter i deres naturlige milleu, synovialvæsken. Et potentielt problem er, at reagenset diffusion ikke kan være ideel til chondrocytter indkapslet i alginat perler og dyrkes i en tyktflydende miljø. Således for at studere virkningen af visse Reagensmidler på manipuleret brusk, kan bedre spredning opnås ved at reducere størrelsen af alginat perler, og ved at bruge perfusion systemer til at lette reagens distribution i synovialvæske. Mens vores repræsentativt resultat stammer fra dyrkning af normale menneskelige chondrocytter i synovialvæske stammer fra patienter med slidgigt, vi tror på denne metode kan ekstrapoleres til at bruge synovialvæsken fra en ellers rask person eller andre sunde hvirveldyr. Fordi synovialvæske aktivitet kan være korreleret til kombinatoriske aktiviteterbånd af mange biokemiske faktorer til stede i væsken, kan nettoeffekten af ledvæsken på chondrocytter genekspression i vores system være korreleret med sværhedsgraden af sygdommen og i sidste ende vil hjælpe os med at forstå intraarticular miljø før og efter behandlinger. Desuden kan vores metode også føre til muligheden for at anvende en patients egen synovialvæske til dyrkning autologe chondrocytter til at regenerere ledbrusken, der er individuelt tilpasset. Med henblik herpå, kan dette system give indsigt i at studere de biomekaniske kræfter, der handler gennem synovialvæske på manipulerede brusk samt 35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura og Dana Cairns (Tufts University) for at yde hjælp til synovialvæske opbevaring og centrifugering. Dette arbejde blev finansieret af NIH (1R01AR059106-01A1) til LZ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma-Aldrich | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | JT Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza Inc. | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza Inc. | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza Inc. | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta Biosciences | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco Healthcare, Covidien | 8881 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Platform rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Vari-mix | |
| Collagen IIa-forward | 5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’ | ||
| MMP13-forward | 5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’ | ||
| MMP13-reverse | 5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’ | ||
| Caspase 3-forward | 5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’ | ||
| Caspase 3-reverse | 5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’ | ||
References
- Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
- Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data. Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).
- Chung, C., Burdick, J. A.
- Glowacki, J.
- Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. 3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes. Tissue Eng. Part A. , (2009).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R.
- Zvaifler, N. J., Firestein, G. S.
- Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).
- Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression. Biochim. Biophys. Acta. , (2011).
- van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Biorheology. 37, 45-55 (2000).
- Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage. Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).
- Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro. Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis. Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid. Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).
- Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis. Agents Actions. 26, 193-195 (1989).
- Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes. Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).
- Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).
- Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs. Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).
- Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid. J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).
- Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro. Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).
- Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis. Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).
- Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).
- Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture. J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).
- Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture. Arthritis Rheum. , (2011).
- Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro. Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).
- van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).
- Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).
- Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD. Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).
- Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).
- Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).
- Toegel, S., Huang, W., Piana, C. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).
- Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).
- Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).
- Anat, J. 121, 107-118 (1976).
