Summary
Ett 3D-system med odling mänskliga artikulära chondrocyter i höga nivåer av ledvätska beskrivs. Ledvätskan återspeglar det mest naturliga mikromiljön för ledbrosket, och kan lätt erhållas och lagras. Detta system kan därför användas för att studera brosk förnyelse och för screening läkemedel för behandling av artrit.
Abstract
Broskdestruktion är en central patologiskt inslag av artros, en ledande orsak till invaliditet i USA. Brosk i den vuxna inte regenerera inte mycket effektivt in vivo, och som ett resultat leder artros till irreversibel brosk förlust och åtföljs av kronisk smärta och orörlighet 1,2. Broskvävnad Engineering erbjuder lovande möjligheter att förnya och återställa vävnad funktion. Denna teknik innebär vanligtvis sådd kondrocyter i naturliga eller syntetiska byggnadsställningar och odling den resulterande 3D bygga på ett balanserat medel under en tid med ett mål av teknik ett biokemiskt och biomekaniskt mogen vävnad som kan transplanteras in i ett fel plats i vivo 3-6 . Att uppnå en optimal förutsättning för chondrocyte tillväxt och matris nedfall är avgörande för att lyckas med brosk vävnadsteknik.
I det ursprungliga gemensamma hålighet, brosk på articular yta ben badar i ledvätskan. Denna tydliga och trögflytande vätska ger näring till avaskulär ledbrosket och innehåller tillväxtfaktorer, cytokiner och enzymer som är viktiga för chondrocyte metabolism 7,8. Dessutom underlättar synovialvätska låg friktion förflyttning mellan brosk ytor främst genom att utsöndra två nyckelkomponenter, hyaluronan och lubricin 9 10. Däremot är vävnadstekniska brosk oftast odlas i artificiella media. Medan dessa medier kommer sannolikt kunna ge mer definierade villkor för att studera chondrocyte metabolism, synovialvätska mest korrekt återspeglar den naturliga miljön som artikulära kondrocyter bor i.
Faktum är synovialvätska fördelen att vara lätt att få och lagra, och kan ofta regelbundet fyllas på av kroppen. Flera grupper har kompletterat odlingsmediet med ledvätskan i växande människa, nötkreatur, kanin och hund Chondrocytes, men mest används endast låga nivåer av ledvätska (under 20%) från 11 till 25. Medan kyckling, häst och människa chondrocyter har odlas i medium med högre andel ledvätskan var dessa kultur-system tvådimensionella 26-28. Här presenterar vi vår metod för att odla mänskliga artikulära chondrocyter i ett 3D-system med en hög andel av ledvätska (upp till 100%) under en period av 21 dagar. På så övervann vi ett stort hinder som lagts fram av höga viskositet ledvätskan. Detta system ger möjlighet att studera mänskliga chondrocyter i ledvätskan i en 3D-miljö, vilket kan dessutom kombineras med två andra viktiga faktorer (syre spänningar och mekanisk belastning) 29,30 som utgör den naturliga miljön för brosk för att efterlikna den naturliga miljö för brosk tillväxt. Dessutom kan detta system även användas för testmetoder synovialvätska aktivitet på kondrocyterna och ger en plattform för att utvecklabrosk förnyelse teknik och behandling för artrit.
Protocol
Ett 3D-system för odling mänskliga artikulära chondrocyter i ledvätskan
I detta arbete inkapslade vi människor artikulära chondrocyter i alginat pärlor med hjälp av en modifierad tillverkning, föreslås inkapsling protokoll (Lonza och 31). Med hjälp av dessa 3D-konstruktioner har vi utvecklat ett system för odling celler i ett odlingsmedium som innehåller varierande andelar av mänskliga ledvätskan och har bedömt dessa 3D-konstruktioner för brosk genuttryck.
1. Förbered mänskliga articular kondrocyter (HAC) för tredimensionell (3D) inkapsling
- Tina en injektionsflaska (1 ml) av mänskliga artikulära kondrocyter (HAC) (Lonza) (Passage 2) i 37 ° C vattenbad i 1 min.
- Blanda med 1 ml chondrocyte tillväxt medier (Lonza) och centrifugera vid 3000 rpm i 3-5 minuter för att samla in cellerna. Kassera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i chondrocyte tillväxt media (Lonza).
- Plate celler i ett 10 cm vävnadodlingsplatta (BD Biosciences), och kultur i chondrocyte tillväxt media (Lonza) tills cellerna är konfluenta. HACs bör användas vid en passage antal högst 3 eller 4 (P3 eller P4).
- Tvätta HACs på plattan med 155mm NaCl istället för standard PBS, följt av trypsinzation att samla in celler för alginat pärla inkapsling. När cellerna är fristående, spinn ner cellerna vid 3000rpm för 5min. Cellerna är nu redo för 3D inkapsling.
2. Kapsla in HACs till 3D pärlor
Resuspendera HACs i 1,2% alginat lösning (Sigma) vid en densitet av 8x10 5 celler / ml. Cellantal var fast beslutna före inkapsling, med en standard celltalsräknare. Det är mycket viktigt att blanda väl för att säkerställa jämn fördelning av celler i pärlor.
- Pipettera HAC / Alginat lösning blandningen i en 12 ml spruta kopplad till en 22-gauge nål (Tyco Healthcare, Inc.).
- Under tiden förbereder en 50 ml bägare med 102 mM CaCl 2 med en volym 5 gånger större än den HAC / aginate lösning. Placera en omrörare inne i bägaren och rör 102 mm CaCl 2-lösning långsamt (vid ca 150 rpm).
- Håll sprutspetsen ca 6 inches ovanför ytan av CaCl 2 lösningen och lägg till HAC / alginat blandningen i CaCl 2 lösningen droppvis. I allmänhet leder alginat pärlorna är 2 mm i diameter med en inkapsling täthet av ca 10 4 celler / pärla. OBS: Höjden på sprutan över CaCl 2 lösningen är viktigt. Kortare avstånd kommer att resultera i tår formade istället för sfäriska formade pärlor, orsakar ojämn mekanisk integritet och cell inkapsling.
- Låt kulorna rör i CaCl 2 lösningen för 20-25 min. Medan andra alginat inkapsling protokoll visar på en mycket kortare inkubationstid på 10min, fann vi att längre inkubationstiden med CaCl 2 lösningen stärkt integritet skaannonser.
- Ta bort CaCl 2 och tvätta pärlor 2-3 gånger i 2-3 volymer av NaCl, och sedan en gång i chondrocyte differentiering medium (Lonza). Medan andra alginat pärla inkapsling protokoll innebära att vi använder ett filter för ovanstående tvätt förfaranden, fann vi att alginat pärlor ofta fastnar i filtret och torka ut, vilket minskar effektiviteten i inkapsling. Vi fann det mest effektivt att låta kulorna att bosätta sig i botten av bägaren innan kassering lösningen.
- Använd en vanlig stekspade för att överföra pärlor i kultur rätter. Vi kultur brukar 12 pärlor per 3 cm bra för 2 dagar i chondrocyte tillväxtmedium att kondrocyter att anpassa sig till inkapsling processen på medellång de odlas i före övergång till chondrocyte differentiering medium (Lonza) med ledvätska.
3. Kultur chondrocyter i ledvätskan odlingsmedium
- Färska ledvätskan kan erhållas från en outpatient klinik (Vi fick synovialvätska från Tufts Medical Center). Synovialvätska kan överföras på 15ml falcon rör till laboratoriet, och omedelbart centrifugeras vid 3000 rpm för 15min för att ta bort cell skräp. Alikvotera cellfria ledvätskan i 1,5 rör ml mikrocentrifug, för att undvika upprepad frysning-upptining. Supernatanten kan förvaras vid -80 ° C till dess användning.
- Före odling, blanda synovialvätska med chondrocyte differentiering medium (CDM, Lonza) vid olika volymetriska nyckeltal, med en konstant koncentration av 100mm askorbinsyra och 9 mm CaCl 2 (detta spår mängden CaCl 2 är att säkerställa integriteten i alginat pärlor).
- Håll plattan på en gunga plattform i ett 37 ° C inkubator (gunga frekvens: ca 75 ggr / min) för att hjälpa näringsämnen distribution inom alginat pärlor, och för att minska hopklumpning av pärlor. Detta är särskilt viktigt när vi kulturen dessa kondrocyter under en längre tid (upp till 4 veckor). Not: Medan chondrocyte tillväxt och media differentiering (Lonza) innehåller två vanliga antibiotika gentamycin och amfotericin, vi kompletterar inte antibiotika när vi använt olika andel av ledvätskan för chondrocyte odling. Ingen kontaminering någonsin observerats.
- Ändra media blandningar var 2-3 dagar. Den viskositet ledvätskan har varit ett stort hinder i odling chondrocyter inkapslade i alginat pärlor under långvarig kulturer. Vi fann det mest effektiva för att späda synovialvätska-kompletterat medium med 102mm CaCl 2 (50% v / v), som också stärker integritet alginat pärlor. På detta sätt kan mediet sakta tas bort med en pipett, utan att skada pärlor.
4. Harvest HACs i alginat pärlor för genuttrycksanalys
Särskild försiktighet måste iakttas vid skörd av HACs från alginat pärlor för genuttryck analys.
- Tvätta alginat pärlor 3 tiMES i 102 mm CaCl 2 i ca 5 min varje gång.
- Hämta kondrocyter genom att lägga till 55 mm NaCitrate på en volym 4-5 gånger av pärlor. Det är viktigt att alginat pärlorna är helt nedsänkt i NaCitrate lösningen. Skaka eller rock för 20-30 min.
- Snurra ned cellerna och kassera supernatanten.
- För RT-PCR-analys, resuspendera cellpelleten i cell lyseringsbuffert (Qiagen RNA isolering kit), och fortsätt med RNA rening.
5. Fix HACs i alginat pärlor för histologisk analys
Särskild försiktighet måste vidtas för att skörda HACs från 3D pärlor för histologisk analys.
- Tvätta alginat pärlor 3 gånger 102 mm CaCl 2 i ca 5 min varje gång. För att helt tvätta bort trögflytande ledvätskan, fann vi det mest effektivt att tvätta med chondrocyte differentiering medium (Lonza) över natten, gunga i ett 37 ° C inkubator (gunga frekvens: ca 75 tidens / min). Den chondrocyte odlingsmedium var van att se chondrocyte överlevnad i detta långvariga tvätt och för att ge maximal penetration av fastställande agent.
- Fäst pärlor i 70% etanol över en natt, och fortsätter med histologisk analys. För att utföra Dapi färgning, inkubera alginat pärlor med Dapi lösning (500ng/ml) för 1 timme i mjuk gungning, och tvätta för 3 gånger med 102mm CaCl 2 i 15 min varje gång. Dapi bilder kan sedan ses i fluorescerande mikroskop. Kulorna kan även sektioneras för alcian blå och H & E färgning.
6. Representativa resultat
Vår 3D-odling metod för mänskliga chondrocyter i hög andel av synovialvätska är skildras i schematiskt visas i figur 1. Efter mänskliga chondrocyter var inkapslade i alginat pärlor, de får växa i medelstora kompletteras med olika nyckeltal i ledvätskan. På grund av viskositeten hos den synovialvätska, är det viktigt attkultur kondrocyter under konstant vaggande villkor för att förhindra att klumpar av brosk konstruerar och att säkerställa en jämn fördelning av näringsämnen. Det är också viktigt att tvätta alginat pärlorna utförligt innan du hämtar den kondrocyter, så att fastställa eller lyseringsbuffert kan penetrera pärlor (figur 1). Ljusa fält (BF) bilder av chondrocyter i alginat pärlor visas i Fig. 2. Dapi färgning utfördes för att bekräfta usniform distribution av celler i kulor (Fig. 2). I slutet av 21-dagars kultur period var genuttrycksanalys utförs av QRT-PCR. Hänvisningen genen GAPDH har använt för normalisering för alla PCR, eftersom det bedömdes vara en av de mest pålitliga referens gener för qPCR analys på kondrocyterna 32. Ett exempel visas i bild. 3, där vi analyserade resultaten från mänskliga artikulära chondrocyter odlade i ledvätskan poolade från sex patienter med artros. I överensstämmelse med det faktum att kondrocyter frånLonza har utökats i 2D kulturer, vilket oundvikligen skulle leda till de-differentiering 33, fann vi att Dag 0 kondrocyter uttryckt minimala nivåer av broskvävnad gener (Figur 3). 3D odling av kondrocyter med chondrocyte differentiering medium (Lonza) eller medium kompletteras med ledvätska ökat kraftigt brosk genuttryck av kollagen, aggrecan och MMP13, vilket indikerar chondrocyte nytt differentiering av Dag 21 (Fig. 3) 34. Öka andelen ledvätskan i media resulterade i jämförbara nivåer av broskvävnad markörer kollagen II och aggrecan mRNA uttryck (Fig.3A och 3B). Dessutom visade chondrocyter odlade i 100% ledvätskan och med en minskning av brosk enzym MMP13 mRNA-uttryck jämfört med dem som odlade i medium ensam (Fig.3C). Intressant nog minskade uttrycket nivån av celldöd indikator caspase 3 successivt med ökande nyckeltal i ledvätskan, vilket tyder på att Synovial vätska odling har lett till minskad apoptos nivåer (bild 3D). Därför Våra resultat visar att odla mänskliga artikulära chondrocyter i höga nivåer av ledvätskan i en 3D-miljö är en möjlig teknik.
Tabeller och figurer
Figur 1. Schematisk beskrivning av metoden till kultur mänskliga artikulära chondrocyter i hög andel av ledvätskan i 3D alginat pärlor. Först är kondrocyterna och alginat lösningen blandas. När den appliceras droppvis till CaCl 2 lösning, är kondrocyter immobiliseras i tvärbunden Ca-alginat hydrogel pärlor. Dessa 3D-konstruktioner är sedan odlas i chondrocyte differentiering medium (Lonza) med olika nyckeltal för mänskliga ledvätskan. Efter 21 dagar av odling under en gunga skick, alginat kulor med celler tvättas omfattande varefter cellerna hämtas för genuttryck analys.
Figur 2. Bright fält (BF) och Dapi bilder av människans artikulära kondrocyter inkapslad kulturer med 0%, 30%, 50%, 70% och 100% ledvätska. Chondrocyter var klotformig i alla odlingsbetingelser. Bilder av ljusa fält (BF) och Dapi var överlagras för att bekräfta platsen och distribution av kondrocyter. Inläggningar, förstorade bilder. Pilspetsar, colocalization av chondrocyter i BF och Dapi bilder färgning.
Figur 3. QRT-PCR-analys av inkapslat mänskliga artikulära kondrocyter på dag 0 (D0) en efter 21 dagars odling (D21) i medelstora kompletteras med olika nyckeltal i ledvätskan (SF) (0%, 30%, 50%, 70 % och 100%). Resultat av fyra oberoende urval visas här. GAPDH användes som intern referens för samtliga PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna rapport har vi utvecklat en metod som möjliggör odling av mänskliga artikulära chondrocyter i en 3D-miljö i medium som innehåller höga koncentrationer av människor ledvätskan. Synovialvätska är en av de viktigaste komponenterna som utgör den naturliga miljön i det gemensamma hålighet, där artikulära kondrocyterna bor. Har dock viskositet ledvätskan varit en stor utmaning för tredimensionella långsiktig odling av kondrocyter. För att övervinna utmaningen att upprätthålla ens näringsämnen distribution i ett 3D-konstruktion i en trögflytande miljö och för att förhindra aggregering, placerade vi brosk konstruktioner under ständig rörelse med mjuka gungande. För att öka den strukturella integriteten av brosk konstruktioner, ändrade vi det traditionella förfarandet för sådd kondrocyter i en alginat hydrogel, inklusive optimering av tid för bead bildning och media föränderliga förfarandet 31. Sådana förfaranden är viktiga närbrosk konstruktioner hanteras i viskösa ledvätskan under långvarig kulturer.
Vi tror att denna metod ger oss möjlighet att studera biologi mänskliga artikulära chondrocyter i sin naturliga milleu, synovialvätska. En potentiell oro är att reagens diffusion kanske inte är idealiskt för chondrocyter inkapslade i alginat pärlor och odlas i en trögflytande miljö. Således för att studera effekten av vissa reagens på konstruerats brosk, kanske bättre spridning uppnås genom att minska storleken på alginat pärlor, och genom att använda perfusion system för att underlätta reagens distribution i ledvätskan. Medan våra representativt resultat har erhållits från odling normal människa chondrocyter i synovialvätska från patienter med artros, anser vi denna metod kan extrapoleras att använda synovialvätska från en annars frisk person eller andra friska djur ryggradsdjur. Eftersom synovialvätska aktivitet kan korreleras till kombinatorisk verksamhetband av många biokemiska faktorer i vätska, kan nettoeffekten av ledvätskan på chondrocyte genuttryck i vårt system vara korrelerade med svårighetsgraden av sjukdomen och i slutändan kommer att hjälpa oss att förstå intraarticular miljön före och efter behandlingar. Dessutom kan vår metod också leda till möjligheten att använda patientens egen ledvätska för odling autolog kondrocyter att regenerera ledbrosk som är individuellt anpassad. För detta ändamål kan detta system ger en insikt i att studera biomekaniska krafter som verkar genom ledvätskan på konstruerats brosk och 35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura och Dana Cairns (Tufts University) för att ge hjälp med ledvätska lagring och centrifugering. Detta arbete har finansierats av NIH (1R01AR059106-01A1) för LZ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma-Aldrich | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | JT Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza Inc. | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza Inc. | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza Inc. | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta Biosciences | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco Healthcare, Covidien | 8881 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Platform rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Vari-mix | |
| Collagen IIa-forward | 5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’ | ||
| MMP13-forward | 5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’ | ||
| MMP13-reverse | 5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’ | ||
| Caspase 3-forward | 5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’ | ||
| Caspase 3-reverse | 5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’ | ||
References
- Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
- Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data. Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).
- Chung, C., Burdick, J. A.
- Glowacki, J.
- Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. 3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes. Tissue Eng. Part A. , (2009).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R.
- Zvaifler, N. J., Firestein, G. S.
- Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).
- Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression. Biochim. Biophys. Acta. , (2011).
- van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Biorheology. 37, 45-55 (2000).
- Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage. Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).
- Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro. Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis. Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid. Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).
- Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis. Agents Actions. 26, 193-195 (1989).
- Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes. Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).
- Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).
- Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs. Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).
- Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid. J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).
- Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro. Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).
- Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis. Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).
- Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).
- Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture. J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).
- Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture. Arthritis Rheum. , (2011).
- Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro. Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).
- van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).
- Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).
- Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD. Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).
- Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).
- Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).
- Toegel, S., Huang, W., Piana, C. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).
- Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).
- Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).
- Anat, J. 121, 107-118 (1976).
