Summary
نحن لشرح كيفية تشريح والثقافة الفرخ E4 العقدة statoacoustic E6 explants والحبل الشوكي. تستزرع Explants المصل تحت ظروف الأجواء الخالية من المواد الهلامية في الكولاجين 3D لمدة 24 ساعة. يتم اختبار Neurite الاستجابة مع النمو المتوسط عامل وتستكمل مع بروتين المغلفة الخرز.
Abstract
ومعصب الأجهزة الحسية في الأذن الداخلية الدجاج من العمليات المحيطية من العقدة statoacoustic (SAG) الخلايا العصبية. تعصيب الجهاز الحسي يعتمد على مزيج من العظة التوجيه محوار 1 و 2 بقاء العوامل تقع على طول مسار المحاوير المتزايد و / أو ضمن أهدافها الجهاز الحسي. على سبيل المثال ، ولدت مع وظيفية تدخل طريقا محوار توجيه الإشارات الكلاسيكية ، semaphorin - neuropilin ، misrouting من المحاور أذني 3. أيضا ، أعرب العديد من عوامل النمو في الأهداف الحسية في الأذن الداخلية ، بما في ذلك Neurotrophin - 3 (NT - 3) وعامل التغذية العصبية الدماغي المشتقة (BDNF) ، وقد تم التلاعب في الحيوانات المعدلة وراثيا ، مما أدى مرة أخرى إلى misrouting من المحاور SAG 4. هذه الجزيئات نفسه يعزز بقاء ونمو الخلايا العصبية neurite SAG الفرخ 5،6 في المختبر.
هنا ، نحن وصف وشرح الطريقة في المختبر ونحن حاليا شالغناء لاختبار مدى استجابة neurites SAG فرخ لبروتينات قابلة للذوبان ، بما في ذلك morphogens المعروفة مثل Wnts ، فضلا عن عوامل النمو التي تعتبر مهمة لتعزيز SAG ثمرة neurite وبقاء الخلايا العصبية. باستخدام هذا النظام النموذجي ، ونأمل في استخلاص استنتاجات بشأن الآثار التي يمكن أن يفرز يغاندس تمارس على بقاء الخلايا العصبية وثمرة neurite SAG.
يتم تشريح explants SAG يوم الجنينية 4 (E4) والمثقف في المواد الهلامية الكولاجين ثلاثي الأبعاد تحت ظروف خالية من المصل لمدة 24 ساعة. أولا ، يتم اختبار الاستجابة من جانب neurite explants زراعة المتوسطة البروتين تستكمل. ثم لنتساءل عما إذا كانت مصادر نقطة يغاندس يمكن أن يفرز تأثيرات على الاتجاه ثمرة neurite ، وشارك في explants مثقف مع بروتين المغلفة الخرز ويعاير لقدرة حبة لتعزيز محليا أو تحول دون ثمرة. نحن تشمل أيضا مظاهرة للتشريح (تعديل بروتوكول 7) وثقافة E6 explants الحبل الشوكي. نحنتستخدم بشكل روتيني explants النخاع الشوكي للتأكد من النشاط الحيوي للبروتينات والخرز البروتين غارقة ، والتحقق من الأنواع عبر التفاعل مع أنسجة الفرخ ، في ظل الظروف نفس ثقافة explants SAG. هذه المقايسات في المختبر لفحص مريحة بسرعة عن الجزيئات التي تمارس التغذية (بقاء) أو مدار (الاتجاه) التأثيرات على الخلايا العصبية SAG ، وخصوصا قبل تنفيذ الدراسات في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك ، وهذه الطريقة تسمح للاختبار الجزيئات الفردية بموجب المصل خالية من الشروط ، مع بقاء الخلايا العصبية ارتفاع 8.
Protocol
وصفات
فرخ قارعو الأجراس
| 7.2 ز | كلوريد الصوديوم |
| ز 0.23 | CaCl 2 + 2H 2 O |
| ز 0.37 | بوكل |
| 0،115 ز | غ هبو 2 4 |
| 900 مل | المياه (الصف الأنسجة الثقافة) |
ملاحظة : ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. يصل حجم النهائي الى 1000 مل من الماء.
10X PBS
| 40 ز | كلوريد الصوديوم |
| 1 غرام | بوكل |
| 7 ز | غ هبو 2 4 |
| 1.2 غرام | KH 2 PO 4 |
| 450 مل | DEPC المياه |
ملاحظة : ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. جلب النهائي إلى حجم 500 مل من الماء. يتم تركيز العمل (1X) عن طريق تمييع الأسهم جزء 1 10X مع 9 أجزاء من الماء الصف الأنسجة والثقافة ، مثل تلك التي حصلت مع نظام الأشعة فوق البنفسجية تشعيع ميليبور لتوليد المياه مع الموصلية MΩ 18 سم.
SAG المتوسطة يزدرع عقد
- DMEM/F12 مع L - الجلوتامين ، 10 ملي Hepes
- 10 ٪ الأنسولين ونقل والسلينيوم (+1 ITS)
- 1 ٪ القلم بكتيريا
يزدرع مستنبت
- SAG المتوسطة يزدرع عقد
- 10 نانوغرام / مل Neurotrophin - 3 (NT - 3)
- 10 نانوغرام / مل عامل عصبية الهدبية (CNTF)
الحبل الشوكي تشريح والمتوسطة عقد
- L - 15
- 10 ٪ الجنين مصل العجل
- 1 ٪ القلم بكتيريا
يحضن البيض في 37-38 درجة مئوية. تشريح تعقيم الأدوات وطبق Sylgard تشريح في الايثانول 70 ٪. ويمكن تشريح الأطباق وأدوات تعقيم بالأشعة فوق البنفسجية أيضا أن تكون بين عشية وضحاها.
> 1. حبة إعداد
- الخرز مكان في microtube مع 1 مل العقيمة PBS ، مزيج ، وانتظر الخرز لتستقر في قاع الأنبوب.
- تغسل حبات عدة مرات عن طريق إزالة طاف بعد الخرز واستقروا resuspend في برنامج تلفزيوني.
- احتضان حبات في تنقية البروتين (المخفف في برنامج تلفزيوني) ، أو برنامج تلفزيوني وحده (التحكم) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف حبات في برنامج تلفزيوني وتخزينها في لوحة 24 جيدا مع PBS 1ml حتى وضعت في الكولاجين.
2. Statoacoustic تشريح العقدة
- على E4 إزالة الجنين من بويضة ووضعها في صحن الحمص مع الحل رينغر لإزالة الأغشية الجنينية.
- وضع الجنين في طبق بتري Sylgard © مبطنة مليئة HBSS الباردة وموقف الجنين على جانبها مع الحويصلة الأذنية مواجهة. دبوس الجنين الى الطبق باستخدام دبابيس تشريح.
- باستخدام اثنين من دبابيس تشريح ، وجعل قطع الأفقي من خلال الجلد البطني فورا للقناة الحقائب ، ما يقرب من حيث يقابل قناة القوقعية. اجراء خفض الرأسي الأمامي والخلفي لSAG. استخدام ملقط أو دبوس تشريح لرفع وإزالة رفرف من الجلد تحدها التخفيضات الثلاثة.
ملاحظة : يقع على حافة SAG أمامي بطني من otocyst ، في حوالي منتصف المسافة بين الحقيبة الظهرية التي مرئيا بسهولة مع قاعدة brightfield الإضاءة ، والقناة البطنية قوقعة المشاريع التي ventromedially وتحجب الأقواس البلعومية. ويستطيل قناة القوقعية وذلك ببعدها ظهري بطني زيادة تدريجية على E4 بين هامبورغ هاملتون مراحل 23-25 سبتمبر.
- سحب otocyst في اتجاه الخلفي لفصلها من SAG. محل الأنسجة المحيطة SAG مع دبابيس التشريح وإزالة بعناية SAG من الجنين باستخدام ملقط # 55. إزالة أجزاء كبيرة من الأنسجة العصبية الوسيطة وحزم جاحظ من SAG.
- تلميح باستخدام الماصة الفم واسعة ، ونقل إلى يزدرع24 لوحة جيدا مع 0.5 مل يزدرع SAG عقد المتوسط. إبقاء explants على الجليد أو في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 4 ساعات.
3. الحبل الشوكي تشريح
- إزالة الجنين E6 من البيضة ووضعها في طبق الحمص يحتوي على حل رينغر. إزالة الرأس والأغشية الجنينية.
- وضع الجسم في Sylgard © طبق تشريح تشريح الباردة التي تحتوي على النخاع الشوكي المتوسط. وموقف دبوس الجنين "أسفل بطني" والذيلية التي تواجه المجرب. مكان المسامير من خلال تشريح كل الأطراف وحتى نهاية الأمامي.
- باستخدام ملقط و / أو تشريح الدبابيس ، وإزالة بعناية الجلد والأنسجة ، وتتحرك في اتجاه بطني ، حتى السطح الظهري في النخاع الشوكي مرئيا.
- قطع خط الوسط الظهري في النخاع الشوكي مع دبوس تشريح ، في الاتجاه الأمامي الخلفي ل، جنبا إلى جنب على طول الحبل الشوكي. هذا يخلق "كتاب مفتوح" مع الجانبين الأيسر والأيمن من النخاع الشوكي منفصلة.
- إزالة الحبل الشوكي من الجسم عن طريق عقد نهاية الذيلية أقصى من الحبل الشوكي مع ملقط ورفعها إلى أعلى وبعيدا عن المجرب. إزالة DRG المتبقية والسحايا.
- عقد واحدة من نهاية الحبل الشوكي مع ملقط (أو دبوس على الطبق) واستخدام مقص لقطع Vannas على طول خط الوسط بطني ، لشطر النخاع الشوكي.
- عقد واحدة من نهاية يزدرع بالملقط لشل حركة الأنسجة واستخدام مقص لقطع Vannas explants الصغيرة (100-500 ميكرون في الطول) على طول الأنسجة. ويمكن التعرف على لوحة الكلمة بوصفها سماكة واضحة من الأنسجة على طول حافة يزدرع واحد.
- استخدام طرف الماصة واسعة الفم لنقل لوحة explants البئر 24 مع 0.5 مل المتوسطة تشريح الباردة. إبقاء explants على الجليد للمحافظة على سلامة الأنسجة ، وأو ما يصل إلى 4 ساعات.
4. يزدرع الثقافة مع البروتينات المنقى لاختبار الاستجابة neurite
- تعد 1،5 حل الكولاجين ملغ / مل في أنبوب 15 مل المخروطية ، على الجليد ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- التحقق من حل الكولاجين لديه درجة الحموضة من 7-7،4 درجة الحموضة باستخدام ورقة المؤشر. ضبط درجة الحموضة بإضافة هيدروكسيد الصوديوم في 1 مجلدات ميكرولتر.
- نقل إلى لوحة explants 24 جيدا باستخدام الماصة الفم واسعة طرف والسائلة الزائدة نضح. يمكن تربيتها explants متعددة في واحدة أيضا ، ولكن ينبغي أن توضع لا يقل عن 500 ميكرون وبصرف النظر عن بعضها البعض.
- إضافة 0.5 مل من الكولاجين إلى البئر تحتوي على يزدرع. موقف يزدرع على سطح قاع البئر. تأكد من تعيين كل ثقافة تماما قبل الشروع في البئر التالي لأن الكولاجين ستبدأ تتبلمر في درجة حرارة الغرفة.
- مكان لوحة الثقافة على 37 درجة مئوية الشريحة الأكثر دفئا عن 30-45 دقيقة إلى تتبلمر الكولاجين. عندما الكولاجين وpolymerized بين أنها سوف تشبه الهلام.
- إضافة 0.5 مل الثقافة يزدرع الدافئة المتوسطة تستكمل إما مع البروتينات المنقى (مخفف في برنامج تلفزيوني) ، أو برنامج تلفزيوني (التحكم) واحتضان عند 37 درجة مئوية ، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2. وينبغي على آثار ثمرة neurite تكون مرئية من قبل 24 ساعة.
ملاحظة : لقد استخدمنا نفس البروتوكول لexplants SAG الثقافة تصل إلى 42 ساعة.
5. يزدرع المشترك مع ثقافة البروتين المغلفة الخرز لاختبار الاتجاه ثمرة neurite
- تبدأ بخطوات الثقافة يزدرع 4،1-4،4.
- باستخدام الماصة ، ونقل 1-5 حبات من برنامج تلفزيوني إلى جانب تحتوي على الكولاجين والحل يزدرع.
- استخدام ملقط لوضع الخرز 50-500 ميكرون من حافة يزدرع.
- وضع لوحة على 37 درجة مئوية الشريحة الأكثر دفئا عن 30-45 دقيقة إلى تتبلمر الكولاجين. قد تصبح الأنسجة أو حبة النازحين كما polymerizes الكولاجين. التحقق من الثقافات وإعادة الموقف النسيج والخرز خلال 5 دقائق الاولى.
- إضافة 0.5 مل SAG سائل الاعلام الى كل جيدا ، واحتضان لمدة 24 ساعة.
6. تصور ثمرة neurite بواسطة المناعية
- شطف الثقافات في برنامج تلفزيوني والإصلاح لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني.
- الافراج عن المواد الهلامية من جدران الآبار عن طريق تتبع حول حافة المواد الهلامية مع نهاية مقربة من ملعقة صغيرة تفلون. نفذ immunostain مع المواد الهلامية في الآبار. شطف عدة مرات في برنامج تلفزيوني.
- احتضان في محلول 0.5 مل حجب (10 ٪ العجل المصل ، 0.1 ٪ تريتون X - 100 ، أزيد الصوديوم 0.1 ٪ في PBS) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- الأضداد في احتضان 0.5 مل الابتدائية (المضادة للβ تويولين الضد المخفف 1:500 في عرقلة الحل) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- شطف عدة مرات في برنامج تلفزيوني. الأضداد في احتضان 0.5 مل الثانوية (اليكسا ثر 488 الماعز المضادة للجسم الفأر 2B مفتش المخفف 1:500) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. من هذه الخطوة إلى الأمام ، والحفاظ على لوحات في الظلام أو التفاف في احباط ، ونظرا لحساسية الضوءالثانوية الأضداد.
- شطف عدة مرات في برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
7. ممثل النتائج
الشكل 1. ممثل نتائج الآثار neurite المعززة لتنقية NT - 3 و NT - 3 - حبات مغلفة على explants E4 SAG الفرخ. أجسام الخلايا العصبية SAG وكانت neurites immunostained مع تويولين - β وتصويرها مع الهدف 10X على مبائر المجهر. بعد 24 ساعة في المختبر ، عرض explants SAG أكبر ثمرة neurite في حضور 100 نانوغرام / مل تنقية الإنسان NT - 3 تضاف إلى الخلية مستنبت (1B) ، مقارنة مع الضوابط (1A). وقد شارك في الخلايا العصبية SAG مثقف مع حبات غارقة in100 نانوغرام / مل NT - 3 لإثبات أن مصدر نقطة NT - 3 يمكن أن تعزز نمو neurite محليا. عرض Explants أطول وأكثر كثافة ثمرة neurite على جانبيزدرع التي تواجه حبة بالمقارنة مع الجانب الآخر (1D) ، ومقارنة للسيطرة على الثقافات مع حبات غارقة في برنامج تلفزيوني (1C). مقياس بار = 200 ميكرون.
الشكل 2. ممثل نتائج الآثار neurite المعززة للWnt5a المنقى والخرز Wnt5a المغلفة على الحبل الشوكي E6 الفرخ. وكانت immunostained explants النخاع الشوكي مع تويولين - β وتصوير تحت المجهر متحد البؤر. بعد 24 ساعة من النمو في وجود تنقية الماوس Wnt5a (400ng/ml) ، ثمرة من neurite explants فرخ زاد الحبل الشوكي (2B) بالمقارنة مع الضوابط مثقف دون Wnt5a (2A). وضعت حبات غارقة في 500 نانوغرام / مل Wnt5a ، 300-500 ميكرون من على حافة explants النخاع الشوكي ، كما روجت ثمرة neurite (2D) مقارنة للسيطرة على الثقافات (2C). ونشرت سابقا مماثلة شارك في النتائج مع الثقافة ، معربا عن الخلايا Wnt5a 8. مقياس بار = 200ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نقدم طريقة لتشريح والثقافة وE4 SAG E6 explants الحبل الشوكي ، من الحمص ، في ظل ظروف الأجواء الخالية من المصل. ويجري حاليا استخدام هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الآثار المترتبة على مختلف يغاندس يفرز على بقاء الخلايا العصبية وثمرة neurite SAG. الرواية جوانب من هذا البروتوكول بما في ذلك استخدام نظام المصل مجانا للexplants زراعة واستخدام الخرز غارقة في عوامل النمو لدراسة الآثار المترتبة على ثمرة neurite SAG. وقد وصفت طريقة مشابهة لحبة لنا عن الحبل الشوكي الفرخ 10. تقليديا ، كانت تستخدم الخرز في الدراسات الكلاسيكية مع عوامل التوجيه وmorphogens محور عصبي. هنا ، لقد أظهرنا أنه يمكن أيضا للمقايسة حبة يمكن استخدامها لتحقيق آثار neurotrophins (أو عوامل النمو الأخرى) على ثمرة neurite (الشكل 1).
هناك خطوات حاسمة في العملية التي قد تحتاج إلى تعديل أو الأمثل للتطبيقات المختلفة. هذه الخطوات هي أيضا متغيرات هامة لtroubلو الرماية التجارب التي تبدو ناجحة. أولا ، Neurotrophin - 3 (NT - 3) ، وعامل التغذية العصبية الهدبية (CNTF) والخمسين (الأنسولين ، ترانسفيرين ، السيلينيوم) اضيفت الى المتوسط لتعزيز ثقافة SAG بقاء الخلايا العصبية ، وتعزيز نمو 6،8 neurite. وشملت هذه العوامل النمو في النخاع الشوكي في تجارب لاختبار النشاط الحيوي للجزيئات في ظل الظروف نفسها التي كانت مقايسة اختبار explants SAG. ومع ذلك ، قد تكون عوامل النمو الأخرى أكثر ملاءمة لهذه الأنواع والأنسجة الأخرى. ثانيا ، تم اختيار 1.5 ملغ / مل تركيز الكولاجين بعد اختبار مجموعة من تركيزات الكولاجين (0.5 ، 1.0 ، 1.5 و 2 ملغ / مل) لأنها تنتج ثمرة neurite أقوى من SAG الدجاج E4 بعد 24H. قد مصادر أخرى من الخلايا العصبية عرض الأمثل مختلفة من الكولاجين. أخيرا ، ينبغي أيضا أن تركيزات البروتين ، وعدد من الخرز ، والمسافة بين explants والخرز يكون الأمثل لكل تطبيق. حقيقة بعض النمووأعرب ORS ، مثل morphogens ، في تدرجات وممارسة تعتمد على التركيز على المحاور آثار النمو خلال التنمية 11. ولذلك ، ينبغي دائما مجموعة من تركيزات يتم اختبارها مع المقايسات ثمرة neurite. وينبغي الحرص على تجنب سمية : لاحظنا مستويات مرتفعة من موت الخلايا مع تركيزات عالية من بعض البروتينات (على سبيل المثال ، القنفذ الصوتي).
ويمكن تكييف هذه الطريقة لتطبيقات إضافية ، بما في ذلك الأعمار الأخرى ، وأنواع الأنسجة ، وأساليب التعاون والثقافة ، وimmunostaining إضافية (على سبيل المثال ، المقايسات بقاء الخلية). لدينا مثقف بنجاح E3 - E5 SAG ، E6 شبكية العين ، وE7 explants البصلة الشمية ، من الحمص ، وذلك باستخدام نفس الثقافة الظروف. عندما ثمرة قوي في عينات السيطرة ، يمكن أن تكشف عن هذا الأسلوب أيضا إلى عوامل طاردة ردود يفرز. واستخدمت أساليب مماثلة لاختبار آثار morphogens على الخلايا العصبية في الثدييات 12،13 ، ونحن نحقق حاليا من آثار أفضل الممارسات الإدارية ، FGFs ، والشيخح على ثمرة neurite SAG. أيضا ، لأن المواد الهلامية بلمرة الكولاجين في صفيحة ال 24 جيدا ، فهي كبيرة بما يكفي لاحقة ، وتضمين sectioning مع ناظم البرد. نقوم بشكل روتيني على المقايسات النفق cryosections الثقافات هلام الكولاجين ، والتي تمكننا من ربط مستوى الخلية مع بقاء مبلغ neurite ثمرة من نفس العينة 8.
هناك قيود على استخدام هلام المقايسات الكولاجين في الطريقة التي قدمناها لهم هنا. على سبيل المثال ، قد لوحظ في ردود مبسطة عن عمد في بيئة المختبر لا تعكس الردود على العامل نفسه عندما تكون موجودة في أكثر تعقيدا من الوضع في الجسم الحي. كذلك ، لا يمكننا أن نميز الطرفية من العمليات المركزية والسمعية لا يمكن التمييز من neurites الدهليزي. لذا ، يمكن الاختلاف في الاستجابة بين هؤلاء السكان العائد ثمرة غير النظامية أو غير موحدة ، أو ، إذا كان السكان الاستجابة هو جزء صغير منإجمالا يمكن أن يكون سجل العقدة كما يظهر أي تأثير. أخيرا ، قدمنا طريقة التي يمكن استخدامها لexplants الثقافة SAG E4 تحت المصل خالية من الشروط مع بقاء الخلايا العصبية كبيرة ، مع مجموعة متنوعة من التطبيقات من دراسة بقاء الخلية إلى توجيه محور عصبي. عموما ، فإن هذا النظام مفيد لأنه يسمح احد لرصد الآثار الناجمة عن إضافة تنقية العوامل وحدها أو في مجموعات دون التباس المتغيرات من غيرها من العوامل تفرز والعظة محوار التوجيه التي قد تكون موجودة في البيئة في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1DC002756 المنح ومؤسسة البحوث بوردو. نشكر دوريس وو وتشانغ فيسه للحصول على المشورة مع التجارب ورودني ماكفيل للمساعدة في الأرقام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection microscope | We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | ||
| Slide warmer | C.S. E. | Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator | |||
| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator | |||
| Sylgard© coated petri dish | |||
| 24-well cell culture plate | Corning | 3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 118-96R | Explant transfer |
| E4 and E6 chicken eggs | |||
| Chick Ringer’s solution | Embryo harvest | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma-Aldrich | L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501778 | Spinal cord dissection |
| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences | 354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| 1N NaOH (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| Distilled water (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman, GE Healthcare | 2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific, Inc. | 818-PG | |
| 500 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 119-R100 | To pipet collagen |
| DMEM/F12 medium | Sigma-Aldrich | D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma-Aldrich | I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma-Aldrich | C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma-Aldrich | N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation |
| PBS | Rinses | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen | 16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma-Aldrich | T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody | Invitrogen | A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR international | 57949-033 | Release collagen gels from well |
References
- Fekete, D. M., Campero, A. M.
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia. Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).
- Gu, C. Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development. Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).
- Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea. J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).
- Avila, M. A. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons. Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).
- Bianchi, L. M., Cohan, C. S. Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor. Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).
- Juurlink, B. ernhardH. J. Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture. Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).
- Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons. Hear. Res. , (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).
- Bourikas, D. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).
- Augsburger, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).
- Lyuksyutova, A. I. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).
