Dissekering och kultur Chick Statoacoustic Ganglion och Spinal explants sladd i Collagen Gel för Neurite utväxt analyser

Summary

Vi visar hur du dissekera och kultur chick E4 statoacoustic ganglion och E6 spinal explants sladden. Explants odlas i serumfritt förhållanden i 3D kollagen geler i 24 timmar. Neurite lyhördhet testas med tillväxtfaktor-kompletterat medium och med protein-belagda pärlor.

Abstract

Den sensoriska organ kyckling innerörat är innerveras av den perifera processer statoacoustic ganglion (SAG) nervceller. Sinnesorgan innervation beror på en kombination av Axon vägledning signaler ¹ och faktorer överlevnad ² längs banan för växande axoner och / eller inom deras sinnesorgan mål. Till exempel genereras funktionella störningar med en klassisk axonet vägledning signalväg, semaphorin-neuropilin, misrouting av öron axoner ^3. Även flera tillväxtfaktorer uttryck i sensoriska målen i innerörat, inklusive Neurotrophin-3 (NT-3) och Brain neurotrofa Factor (BDNF), har manipulerats i transgena djur, återigen leder till misrouting av SAG axoner ^4. Samma molekyler främja både överlevnad och neurite utväxt av nervceller chick SAG in vitro ^5,6.

Här beskriver vi och visar in vitro metod vi nu usjunga för att testa att reagera chick SAG neurites att lösliga proteiner, inklusive kända morfogener som Wnts samt tillväxtfaktorer som är viktiga för att främja utväxt SAG neurite och neuron överlevnad. Med hjälp av detta modellsystem hoppas vi att dra slutsatser om de effekter som utsöndras ligander kan utöva på SAG neuron överlevnad och neurite utväxt.

SAG explants är dissekeras på embryonala dag 4 (E4) och odlas i tredimensionella kollagen geler i serumfritt förhållanden i 24 timmar. För det första är neurite lyhördhet testas genom odling explants med protein kompletterat-medium. Sedan, för att fråga om punktkällor för utsöndras ligander kan ha riktat effekter på neurite utväxt är explants co-odlade med protein-belagda pärlor och analyserade för förmåga pärla att lokalt främja eller hämma utväxt. Vi inkluderar även en demonstration av dissektion (modifierad protokoll ⁷⁾ och kultur av E6 ryggmärgen explants. Virutinmässigt använder ryggmärgen explants att bekräfta bioaktivitet av proteiner och protein-blöt pärlor, och att bekräfta arter korsreaktivitet med chick vävnad, under samma kultur villkor som SAG explants. Dessa in vitro-analyser är bekvämt för snabb screening av molekyler som utövar trofiska (överlevnad) eller tropiska (riktnings) effekter på SAG nervceller, speciellt innan du utför studier in vivo. Dessutom tillåter denna metod testning av individuella molekyler under serumfritt förhållanden, med hög neuron överlevnad ^8.

Protocol

Recept

Chick Ringers

7,2 g	NaCl
0,23 g	CaCl 2 + 2H 2 O
0,37 g	KCl
0,115 g	Na 2 HPO 4
900 ml	Vatten (vävnadskulturer kvalitet)

Obs: Justera pH till 7,4. Ta slutliga volymen till 1000 ml med vatten.

10X PBS

40 g	NaCl
1 g	KCl
7 g	Na 2 HPO 4
1,2 g	KH 2 PO 4
450 ml	DEPC vatten

Obs: Justera pH till 7,4. Ta sistavolymen till 500 ml med vatten. Arbeta koncentration (1X) görs genom att späda 1 del 10X lager med 9 delar av vävnad-kulturens kvalitet vatten, som den framställs med en Millipore UV-strålning för att generera vatten med 18 Mohm-cm ledningsförmåga.

SAG Explantation hålla medelstora

• DMEM/F12 med L-glutamin, 10 mm Hepes
• 10% insulin, överföra, selen (ITS +1)
• 1% pen-Strep

Explantation odlingsmedium

• SAG Explantation hålla medelstora
• 10 ng / ml Neurotrophin-3 (NT-3)
• 10 ng / ml ciliär neurotrofa faktor (CNTF)

Ryggmärgen dissektion och hålla medelstora

• L-15
• 10% fetalt kalvserum
• 1% pen-Strep

Inkubera ägg vid 37-38 ° C. Sterilisera dissekera verktyg och Sylgard dissekera skålen i 70% etanol. Dissekera rätter och verktyg kan också vara UV steriliseras natten.

1. Placera pärlor i ett mikrorör med 1 ml steril PBS, blanda och vänta på pärlor att lösa till botten av röret.
2. Tvätta pärlor flera gånger genom att ta bort supernatanten efter pärlor har bosatt sig och återsuspendera i PBS.
3. Inkubera på pärlorna i renat protein (som spätts i PBS) eller PBS ensam (Control) i 1 timme i rumstemperatur.
4. Skölj pärlor i PBS och förvara i en 24-väl plattan med 1 ml PBS tills placeras i kollagen.

2. Statoacoustic ganglion dissektion

1. På E4 ta bort ett embryo ur ägget och placera den i en skål med chick Ringers lösning att ta bort embryonala membran.
2. Placera embryo i en Sylgard © kantad petriskål fylld med kallt HBSS och placera embryot på sidan med öron vesikler uppåt. Pin embryot till skålen med dissekera stift.
3. Med hjälp av två dissekera stift, gör ett horisontellt snitt genom huden omedelbart ventrala tillKanalen påsar, ungefär där den möter cochlea kanalen. Gör en lodrät klippa främre och bakre till SAG. Använd pincett eller en dissekera stift för att lyfta och ta bort den flik av huden gränsar till tre nedskärningar.

   Obs: SAG ligger vid anteroventral kanten av otocyst, ungefär halvvägs mellan den dorsala påsen som är väl synlig med brightfield bas belysning, och den ventrala cochlea kanalen vilka projekt ventromedially och skyms av svalget valv. Cochlear kanalen förlängs så att dess dorsoventral dimensionen kommer att gradvis öka på E4 mellan Hamburger-Hamilton steg 23-25 ​​september.

4. Dra otocyst i ett bakre riktning för att skilja den från SAG. Förskjuta vävnaden som omger SAG med dissektion stift och försiktigt bort SAG från embryot med # 55 pincett. Ta bort stora delar av mesenkymala vävnaden och sticker ut buntar nerv från SAG.
5. Med hjälp av en bred mun pipettspetsen, överföra Explantation till en24-brunnar med 0,5 ml SAG Explantation hålla medium. Håll explants på is eller i rumstemperatur i upp till 4 timmar.

3. Ryggmärgen dissektion

1. Ta E6 embryot från ägget och placera den i en skål med chick Ringers lösning. Ta bort huvudet och embryonala membran.
2. Placera kroppen i en Sylgard © dissekera skål med kallt ryggmärgen medelstora sladd dissekering. Position och pin embryot "ventrala ner" och caudal mot försöksledaren. Placera dissekera stift genom varje lem och genom den främre änden.
3. Använd pincett och / eller dissekera stift, försiktigt bort hud och vävnad, rör sig i en ventral riktning, tills den dorsala ytan av ryggmärgen är synlig.
4. Skär dorsala mittlinjen av ryggmärgen med en dissekera stift, i ett posteriort anterior riktning längs hela i ryggmärgen. Detta skapar en "öppen bok" som vänster och höger sida av ryggmärgen separat.
5. Ta bort ryggmärgen från kroppen genom att hålla den bakre längst slutet av ryggmärgen med pincett och lyfta upp och bort från försöksledaren. Ta bort kvarvarande DRG och hjärnhinnorna.
6. Håll ena änden av ryggmärgen med pincett (eller stift till skålen) och använd Vannas sax för att klippa längs den ventrala mittlinjen, för att HALVERA ryggmärgen.
7. Håll ena änden av Explantation med pincett för att immobilisera vävnad och använder Vannas sax för att klippa små explants (100-500 um i längd) längs vävnaden. En golvplatta kan kännas igen som en tydlig förtjockning av vävnad längs en Explantation kanten.
8. Använd en bred mun pipettspetsen att överföra explants till 24 brunnar med 0,5 ml kallt dissektion medium. Håll explants på is för att hålla vävnader bärkraft, feller upp till 4 timmar.

4. Explantation kultur med renade proteiner att testa neurite lyhördhet

1. Förbered en 1,5 mg / ml kollagen lösning i en 15 ml koniska rör, på is, enligt tillverkarens anvisningar.
2. Kontrollera att kollagen lösningen har ett pH på 7-7,4 använda pH-indikator papper. Justera pH-värdet genom att tillsätta NaOH i 1 l volymer.
3. Överför explants till en 24-brunnar med hjälp av en bred spets mun pipett och aspirera överflödig vätska. Flera explants kan odlas i en bra, men bör placeras minst 500 ìm från varandra.
4. Tillsätt 0,5 ml av kollagen till brunnen innehåller Explantation. Placera Explantation på undersidan av brunnen. Var noga med att ställa varje kultur helt innan du fortsätter med nästa väl eftersom kollagen börjar polymerisera vid rumstemperatur.
5. Placera kultur plattan på ett 37 ° C glida varmare i 30-45 min för att polymerisera kollagen. När kollagen har polymemanfattas det kommer att likna en gel.
6. Tillsätt 0,5 ml varm medelstora Explantation kultur kompletteras med antingen renade proteiner (som spätts i PBS) eller PBS (Control) och inkubera vid 37 ° C, 5% CO _2. Effekter på neurite utväxt ska synas med 24 timmar.

   OBS: Vi har använt samma protokoll för att explants kultur SAG upp till 42 timmar.

5. Explantation co-kultur med protein-belagda pärlor att prova riktade neurite utväxt

1. Börja med Explantation kultur steg 4,1-4,4.
2. Med hjälp av en pipett överförs 1-5 pärlor från PBS till brunnen innehåller kollagen lösning och Explantation.
3. Använd pincett för att placera pärlor 50-500 ìm från kanten av Explantation.
4. Placera plattan på 37 ° C glida varmare i 30-45 min för att polymerisera kollagen. Den vävnad eller sträng kan bli fördrivna som kollagen polymerizes. Kontrollera kulturer och åter placera vävnaden och pärlor under de första 5 min.
5. Lägg till 0,5 ml SAG media till varje brunn och inkubera i 24 timmar.

6. Visualisering av neurite utväxt av immunohistokemi

1. Skölj kulturer i PBS och fix för 1 timme i rumstemperatur i 4% paraformaldehyd i PBS.
2. Släpp geler från väggarna i brunnarna genom att spåra längs kanten av geler med den rundade änden av en teflon mikro spatel. Utför immunostain med geler i brunnarna. Skölj flera gånger i PBS.
3. Inkubera i 0,5 ml blockerande lösningen (10% kalvserum, 0,1% Triton X-100, 0,1% natriumazid i PBS) över natten vid 4 ° C.
4. Inkubera i 0,5 ml primär antikropp (anti-β-tubulin antikroppen späds 1:500 i blockerande lösningen) över natten vid 4 ° C.
5. Skölj flera gånger i PBS. Inkubera i 0,5 ml sekundär antikropp (Alexa Fluor 488 get anti-mus IgG _2b antikropp utspädning 1:500) över natten vid 4 ° C. Från denna steg framåt, hålla plattorna i mörker eller linda in i folie, på grund av ljuskänslighetsekundära antikroppar.
6. Skölj flera gånger i PBS och förvara vid 4 ° C i PBS för upp till en vecka.

7. Representativa resultat

Figur 1. Representativa resultat av neurite-främjande effekterna av renade NT-3 och NT-3-belagd pärlor på E4 chick SAG explants. SAG organ neuron cell och neurites var immunostained med β-tubulin och avbildade med ett 10x objektiv på en konfokalmikroskop. Efter 24 timmar in vitro visas SAG explants större neurite utväxt i närvaro av 100 ng / ml renat humant NT-3 lagts till cellkulturmedium (1B), jämfört med kontroller (1A). SAG nervceller var co-odlade med pärlor indränkt i 100 ng / ml NT-3 för att visa att en punktkälla av NT-3 lokalt kan främja neurite utväxt. Explants visas längre och tätare neurite utväxt på sidan avExplantation mot pärla jämfört med den motsatta sidan (1D) och jämfört med kontroll kulturer med pärlor indränkt i PBS (1C). Skala bar = 200 ìm.

Figur 2. Representativa resultat av neurite-främjande effekterna av renat Wnt5a och Wnt5a-belagd pärlor på E6: an chick ryggmärgen. Ryggmärgen explants var immunostained med β-tubulin och avbildade med en konfokalmikroskop. Efter 24 timmar av tillväxten i närvaro av renade mus Wnt5a (400ng/ml), neurite utväxt från chick ryggmärgen explants ökade (2B) jämfört med kontroller odlade utan Wnt5a (2A). Pärlor indränkt i 500 ng / ml Wnt5a, placerad 300-500 ìm från kanten av ryggmärgen explants, främjas också neurite utväxt (2D) jämfört med kontroll kulturer (2C). Liknande samarbete kultur resultat tidigare publicerade med Wnt5a-uttryckande celler ^8. Skala bar = 200ìm.

Discussion

Vi presenterar en metod för att dissekera och kultur E4 SAG och E6 spinal explants sladd, från chick, under serumfritt förhållanden. Detta förfarande används idag i vårt labb för att studera effekterna av olika utsöndras ligander på SAG neuron överlevnad och neurite utväxt. Nya aspekter av detta protokoll omfattar användning av en serumfritt system för odling explants och användning av pärlor fuktad med tillväxtfaktorer för att studera effekter på SAG neurite utväxt. En pärla metod som liknar vår har beskrivits för ungen ryggmärgen ^10. Traditionellt har kulor använts i studier med klassiska faktorer axon vägledning och morfogener. Här har vi visat att pärlan analysen kan också användas för att undersöka effekterna av neurotrofinernas (eller andra tillväxtfaktorer) på neurite utväxt (bild 1).

Det är viktiga steg i förfarandet som kan behöva modifieras eller optimeras för olika tillämpningar. Dessa åtgärder är också viktiga variabler för trouble-skytte experiment som verkar vara misslyckade. Först Neurotrophin-3 (NT-3), ciliär Neurotrophic faktor (CNTF) och dess (insulin, transferrin, selen) lades till odlingsmediet att främja överlevnaden SAG neuron och öka neurite utväxt ^6,8. Dessa tillväxtfaktorer ingår i ryggmärgen experiment för att testa bioaktivitet av molekyler under samma analys villkor som SAG explants testades. Dock kan andra tillväxtfaktorer är mer lämpade för dessa och andra typer av vävnad. För det andra var en 1,5 mg / ml koncentration av kollagen valt efter att ha testat en rad av kollagen koncentrationer (0,5, 1,0, 1,5 och 2 mg / ml), eftersom det fram till marknadens mest robusta neurite utväxt från E4 kyckling SAG efter 24h. Andra källor till nervceller kan visa en annan optimal av kollagen. Slutligen bör det protein koncentrationer, antal pärlor, och avståndet mellan explants och pärlor också optimeras för varje applikation. Viss tillväxt faktumyttersta randområdena, såsom morfogener, uttrycks i övertoningar och utövar koncentrationsberoende effekten på växande axoner under utveckling ^11. Därför bör en serie koncentrationer alltid testas med neurite utväxt analyser. Försiktighet bör iakttas för att undvika toxicitet: har vi sett förhöjda nivåer av celldöd med höga halter av vissa proteiner (t.ex., Sonic Hedgehog).

Denna metod kan anpassas för ytterligare tillämpningar, inklusive andra åldrar, typer vävnad, co-kultur metoder och ytterligare immunfärgning (t.ex., cellöverlevnad analyser). Vi har framgångsrikt odlade E3-E5 SAG, E6 näthinnan, och E7 lukt explants glödlampa, från chick, med samma odlingsbetingelser. När utväxt är robust i kontrollprover, kan denna metod visar också motbjudande svar utsöndras faktorer. Liknande metoder användes för att testa effekterna av morfogener på däggdjurs nervceller ^12,13, och vi undersöker för närvarande effekterna av BMP, FGFs och Shh på SAG neurite utväxt. Dessutom, eftersom kollagen geler polymeriserat i ett 24-brunnar, är de stora nog för efterföljande inbäddning och snittning med en kryostat. Vi utför rutinmässigt Tunel analyser om kryosnitt av kulturer kollagen gel, som ger oss möjlighet att korrelera nivån av cellöverlevnad med mängden neurite utväxt från samma prov ^8.

Det finns begränsningar med att använda analyser kollagen gelen på det sätt som vi presenterat dem här. Till exempel kan reaktioner som observerats i den förenklade medvetet in vitro-miljön återspeglar inte svar på samma faktor när de förekommer i de mer komplexa in vivo-situationen. Vad bra, kan vi inte skilja perifer från centrala processer och kan inte skilja auditiv från vestibulär neurites. Därför kunde heterogenitet i lyhördhet bland dessa populationer ge oregelbunden eller ojämn utväxt eller, om de svarande populationen är en liten del avTotalt kan ganglion protokollföras som inte visar någon effekt. Slutligen har vi presenterat en metod som kan användas till kultur E4 SAG explants i serumfritt förhållanden med betydande neuron överlevnad, med en mängd olika applikationer från att studera cellers överlevnad till Axon vägledning. Sammantaget är detta system fördelaktigt eftersom det tillåter en att övervaka effekterna på grund av tillägg av renat faktorer ensamma eller i kombinationer utan confounding variabler av andra utsöndrade faktorer och axon ledtrådar vägledning som kan finnas i in vivo-miljö.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope			We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination
Slide warmer	C.S. E.		Collagen polymerization
Chicken egg incubator
37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator
Sylgard© coated petri dish
24-well cell culture plate	Corning	3526
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55 Dumont forceps	Fine Science Tools	11295-51
Stainless steel dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10	Embryo pinning, fine dissection
Moria perforated spoon	Fine Science Tools	10370-17	Embryo harvest/transfer
200 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	118-96R	Explant transfer
E4 and E6 chicken eggs
Chick Ringer’s solution			Embryo harvest
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	SAG dissection
L15 medium	Sigma-Aldrich	L5520	Spinal cord dissection medium
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11150	Spinal cord dissection medium
Vannas Scissors	World Precision Instruments, Inc.	501778	Spinal cord dissection
Rat-tail collagen Type I	BD Biosciences	354249	Explant culture
10X PBS (Sterile)			To neutralize collagen
1N NaOH (Sterile)			To neutralize collagen
Distilled water (Sterile)			To neutralize collagen
pH indicator papers (6.0-8.1)	Whatman, GE Healthcare	2629-990	To check collagen pH
15 ml conical tubes	Dot Scientific, Inc.	818-PG
500 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	119-R100	To pipet collagen
DMEM/F12 medium	Sigma-Aldrich	D8437	Explant culture medium
ITS+1	Sigma-Aldrich	I2521	Medium supplement
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Medium supplement
CNTF (rat)	Sigma-Aldrich	C3835	Medium supplement
NT-3 (human)	Sigma-Aldrich	N1905	Medium supplement
Purified mouse Wnt5a	R&D Systems	645-WN-010
Affi-gel Blue gel beads	Bio-Rad	153-7302
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation
PBS			Rinses
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Blocking solution
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Blocking solution
Calf serum	Invitrogen	16170-078	Blocking solution
Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody	Sigma-Aldrich	T8535	Labels cell bodies and neurites
Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody	Invitrogen	A21141	Detects β Tubulin antibody
Teflon micro spatula	VWR international	57949-033	Release collagen gels from well