Dissecção e Cultura do Gânglio pintainho Statoacoustic e Explantes da Medula Espinhal em géis de colágeno para Ensaios crescimento de neuritos

Summary

Demonstramos como dissecar e cultura pinto gânglio statoacoustic E4 e E6 explantes medula espinhal. Explantes são cultivados sob condições sem soro em gel de colágeno 3D por 24 horas. Neuritos resposta é testado com o meio do fator de crescimento suplementado com proteína e revestido contas.

Abstract

Os órgãos sensoriais do ouvido interno de frango são inervados pelos processos periféricos do gânglio statoacoustic (SAG) neurônios. Inervação órgão sensorial depende de uma combinação de pistas de orientação axônio ¹ e fatores de sobrevivência ^duas localizadas ao longo da trajetória de axônios em crescimento e / ou dentro de seus alvos órgão sensorial. Por exemplo, interferência funcional com uma via clássica de sinalização de orientação do axônio, Semaforina-neuropilin, gerado misrouting de axônios ótica ^3. Além disso, vários fatores de crescimento expressos nas metas sensoriais do ouvido interno, incluindo Neurotrofina-3 (NT-3) e Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), têm sido manipulados em animais transgênicos, mais uma vez levando a misrouting de axônios SAG ^4. Essas mesmas moléculas promover a sobrevivência e crescimento de neuritos de neurônios SAG pinto in vitro ^5,6.

Aqui, descrevemos e demonstrar o método in vitro estamos atualmente ucantar para testar a capacidade de resposta do neurites SAG pinto de proteínas solúveis, incluindo morfogenes conhecido como o Wnts, bem como fatores de crescimento que são importantes para promover o crescimento SAG neurite e sobrevivência dos neurônios. Usando este sistema modelo, esperamos tirar conclusões sobre os efeitos que ligantes secretados podem exercer sobre a sobrevivência SAG neurônio e crescimento de neuritos.

Explantes SAG são dissecados no dia embrionárias 4 (E4) e cultivadas em géis tridimensionais de colágeno sob condições sem soro por 24 horas. Primeiro, a capacidade de resposta neurite é testada por explantes de cultura suplementado com proteína-médio. Então, perguntar se fontes pontuais de ligantes secretada pode ter efeitos direcionais no crescimento de neuritos, são explantes co-cultivados com proteína revestido contas e ensaiadas para a capacidade do talão até localmente promovem ou inibem a conseqüência. Nós também incluímos uma demonstração da dissecção (protocolo modificado ⁷⁾ e cultura de explantes E6 medula espinhal. Nósrotineiramente usam explantes medula espinhal para confirmar bioatividade das proteínas e proteína-embebido contas, e verificar as espécies reatividade cruzada com tecido de bico, nas condições mesma cultura como explantes SAG. Estes ensaios in vitro são convenientes para a rápida triagem para as moléculas que exercem tróficos (sobrevivência) ou trópico (direcional) efeitos sobre os neurônios SAG, especialmente antes de realizar estudos in vivo. Além disso, este método permite que o teste de moléculas individuais sob condições sem soro, com alta sobrevivência dos neurônios ^8.

Protocol

Receitas

Pinto Ringers

7,2 g	NaCl
0,23 g	CaCl 2 + 2H 2 O
0,37 g	KCl
0,115 g	Na 2 HPO 4
900 ml	Água (grau de cultura de tecidos)

Nota: Ajustar o pH para 7,4. Trazer um volume final de 1000 ml com água.

PBS 10X

40 g	NaCl
1 g	KCl
7 g	Na 2 HPO 4
1,2 g	KH 2 PO 4
450 ml	Água DEPC

Nota: Ajustar o pH para 7,4. Traga finaisvolume para 500 ml com água. Concentração de trabalho (1X) é feita por diluição de 1 parte de ações 10x com 9 partes de cultura de tecidos de água de grau, como o obtido com um sistema de irradiação UV Millipore para gerar água com 18 cm de condutividade mohms.

SAG médio explante segurando

• DMEM/F12 com L-glutamina, 10 mM Hepes
• Insulina 10%, transferindo, Selenium (ITS +1)
• 1% pen-strep

Explante meio de cultura

• SAG médio explante segurando
• 10 ng / ml neurotrofina-3 (NT-3)
• 10 ng / ml fator neurotrófico ciliar (CNTF)

Dissecção da medula espinhal e médias empresas holding

• L-15
• 10% de soro fetal bovino
• 1% pen-strep

Ovos incubar a 37-38 ° C. Esterilizar ferramentas e dissecar prato Sylgard dissecar em etanol 70%. Dissecando pratos e ferramentas também podem ser esterilizados UV durante a noite.

1. Coloque as contas em um microtubo com 1 ml estéril PBS, misturar, e esperar que os grânulos se depositem no fundo do tubo.
2. Lave as contas várias vezes através da remoção do sobrenadante após as contas se instalaram e ressuspender em PBS.
3. Incubar as contas em proteína purificada (diluído em PBS) ou PBS sozinho (Control) por 1 hora em temperatura ambiente.
4. Lave as contas em PBS e armazenar em uma placa de 24 poços com 1ml de PBS até à sua colocação em colágeno.

2. Dissecção ganglionar Statoacoustic

1. E4 em remover o embrião do ovo e coloque-o em um prato com solução de Ringer pinto para remover membranas embrionárias.
2. Coloque o embrião numa placa de Petri forrada Sylgard © preenchido com HBSS frio e posição do embrião em seu lado com a vesícula ótica voltada para cima. Pin o embrião para o prato utilizando os pinos de dissecação.
3. Usando dois pinos de dissecação, faça um corte horizontal através da pele imediatamente ventral aobolsas canal, aproximadamente onde se encontra com o ducto coclear. Faça um corte vertical anterior e posterior ao SAG. Use uma pinça ou um pino de dissecação para levantar e remover o retalho de pele fronteira com os três cortes.

   Nota: O SAG está localizado na borda do anteroventral otocyst, a meio caminho entre a bolsa dorsal que é facilmente visível com iluminação brightfield base, eo ducto coclear ventral quais projetos ventromedially e é obscurecido pelos arcos da faringe. O ducto coclear se alonga para sua dimensão dorsoventral aumentará progressivamente em E4 entre Hamburger-Hamilton estágios 23-25 ​​setembro.

4. Puxe a otocyst em uma direção posterior para separá-lo do SAG. Deslocar o tecido ao redor da SAG com pinos de dissecção e remova cuidadosamente o SAG do embrião usando # 55 fórceps. Remover grandes pedaços de tecido mesenquimal e feixes de nervos que se projeta da SAG.
5. Usando a ponta da pipeta wide-boca, a transferência do explante a um24 poços da placa com 0,5 ml explante SAG segurando médio. Mantenha explantes no gelo ou em temperatura ambiente por até 4 horas.

3. Dissecção da medula espinhal

1. Remover o embrião E6 do ovo e coloque-o em um prato contendo solução de Ringer com pinto. Retire a cabeça e as membranas embrionárias.
2. Colocar o corpo em um prato Sylgard © dissecar contendo meio de dissecção fria da medula espinhal. Posição e pin o embrião "para baixo ventral" e caudal de frente para o experimentador. Coloque os pinos de dissecação através de cada membro e até o final anterior.
3. Utilizando uma pinça e / ou dissecar pinos, remova cuidadosamente a pele e tecido, se movendo em uma direção ventral, até que a superfície dorsal da medula espinhal é visível.
4. Cortar a linha média dorsal da medula espinhal com um pino de dissecação, em uma posterior à direção anterior, em todo o comprimento da medula espinhal. Isso cria um "livro aberto", como os lados direito e esquerdo da medula espinhal em separado.
5. Remover a medula espinhal do corpo, segurando a extremidade caudal-a maior parte da medula espinhal com uma pinça e levantando-o e longe do experimentador. Remover DRG restantes e meninges.
6. Segure uma das extremidades do cabo da coluna vertebral com uma pinça (ou fixá-lo ao prato) e usar a tesoura para cortar Vannas ao longo da linha média ventral, a bissetriz da medula espinhal.
7. Segure uma das extremidades do explante com uma pinça para imobilizar o tecido e usar a tesoura para cortar Vannas explantes pequenos (100-500 hm de comprimento) ao longo do comprimento do tecido. A placa de piso pode ser reconhecido como um espessamento do tecido claro ao longo de uma borda explante.
8. Use a ponta da pipeta de boca larga para transferir explantes a uma placa de 24 poços com 0,5 ml de médio dissecção fria. Mantenha explantes no gelo para manter a viabilidade do tecido, fou até 4 horas.

4. Explante cultura com proteínas purificadas para testar capacidade de resposta neurite

1. Prepare uma solução de colágeno 1,5 mg / ml em um tubo de 15 ml cônico, no gelo, de acordo com as instruções do fabricante.
2. Verificar a solução de colágeno tem um pH de 7-7,4 papel usando indicador de pH. Ajustar o pH pela adição de NaOH em volumes de 1 mL.
3. Transferência de explantes a uma placa de 24 poços usando uma pipeta de boca larga e excesso de líquido aspirado. Explantes múltiplas podem ser cultivadas em um bem, mas deve ser colocada, pelo menos, 500 mm afastados uns dos outros.
4. Adicionar 0,5 ml de colágeno para o bem que contém o explante. Posição do explante sobre a superfície inferior do poço. Certifique-se de definir cada cultura completamente antes de prosseguir com o bem próxima, pois o colágeno começa a polimerizar em temperatura ambiente.
5. Coloque a placa de cultura sobre a 37 ° C mais quente deslizar por 30-45 min para polimerizar o colágeno. Quando o colágeno tem Polymeterizada ele vai se assemelhar a um gel.
6. Adicionar 0,5 ml de meio de cultura morno explante, suplementada com proteínas purificadas (diluído em PBS) ou PBS (controle) e incubar a 37 ° C CO, 5% _2. Efeitos sobre o crescimento de neuritos deve ser visível por 24 horas.

   NOTA: Nós temos utilizado o mesmo protocolo para explantes SAG cultura até 42 horas.

5. Explante co-cultura com proteína revestido contas para testar crescimento de neuritos direcional

1. Comece com as etapas da cultura explante 4,1-4,4.
2. Usando uma pipeta, transferir 1-5 grânulos de PBS para o bem que contém a solução de colágeno e explante.
3. Use uma pinça para posicionar contas 5-50 mM a partir da borda do explante.
4. Coloque o prato sobre a 37 ° C mais quente deslizar por 30-45 min para polimerizar o colágeno. O tecido ou talão pode tornar-se deslocado à medida que o colágeno sofre polimerização. Verifique as culturas e re-posição tecido e miçangas durante primeiros 5 min.
5. Adicionar 0,5 ml SAG mídia para cada poço e incubar por 24 horas.

6. Visualização do crescimento de neuritos por imuno-histoquímica

1. Enxágüe em PBS culturas e correção para uma hora em temperatura ambiente em paraformaldeído 4% em PBS.
2. Solte o gel das paredes dos poços, traçando em torno da borda dos géis com a ponta arredondada de uma espátula micro teflon. Executar a immunostain com o gel nos poços. Lavar diversas vezes em PBS.
3. Incubar em 0,5 ml de solução de bloqueio (10% soro bovino, 0,1% Triton X-100, azida de sódio a 0,1% em PBS) durante a noite a 4 ° C.
4. Incubar em 0,5 ml do anticorpo primário (anti-β-tubulina anticorpo diluído 1:500 em solução de bloqueio) overnight a 4 ° C.
5. Lavar diversas vezes em PBS. Incubar em 0,5 ml de anticorpo secundário (Alexa flúor 488 cabra anti-camundongo IgG _2b diluído 1:500) durante a noite a 4 ° C. A partir deste passo em frente, manter as placas no escuro ou embrulhe em papel alumínio, devido à sensibilidade à luz deanticorpos secundários.
6. Lavar diversas vezes em PBS e armazenar a 4 ° C em PBS por até uma semana.

7. Resultados representante

Figura 1. Resultados representativos dos efeitos de promoção de neurite purificada NT-3 e NT-3-revestido contas em explantes SAG E4 pinto. SAG corpos de neurônios e células neurites foram imunocoloração com β-tubulina e fotografada com a objetiva de 10x em um microscópio confocal. Após 24 horas in vitro, explantes SAG exibido conseqüência maior neurite na presença de 100 ng / ml humano purificado NT-3 adicionado ao meio de cultura celular (1B), comparados aos controles (1A). Neurônios SAG foram co-cultivados com contas embebido em 100 ng / ml NT-3 para demonstrar que uma fonte pontual de NT-3 pode promover localmente crescimento de neuritos. Explantes exibidos mais longos e mais densos conseqüência neurite do lado daexplante de frente para o talão em comparação com o lado oposto (1D) e comparados com controle de culturas com contas embebido em PBS (1C). Barra de escala = 200 mM.

Figura 2. Resultados representativos dos efeitos de promoção de neurite purificada Wnt5a e Wnt5a revestido contas em E6 cabo pinto espinhal. Explantes medula espinhal foram imunocoloração com β-tubulina e fotografada com um microscópio confocal. Após 24 horas de crescimento na presença de purificada do mouse Wnt5a (400ng/ml), crescimento de neuritos a partir de explantes medula espinhal pintinho foi aumentada (2B) comparados aos controles cultivados sem Wnt5a (2A). Contas embebido em 500 ng / ml Wnt5a, colocado 300-500 mM a partir da borda de explantes da medula espinhal, também promoveu crescimento de neuritos (2D) em relação ao controle de culturas (2C). Similar co-cultura resultados foram publicados anteriormente com Wnt5a células que expressam ^8. Barra de escala = 200mM.

Discussion

Nós apresentamos um método para dissecar e cultura SAG E4 e E6 explantes medula espinhal, de bico, sob soro livre de condições. Este procedimento é usado atualmente em nosso laboratório para estudar os efeitos de vários ligantes secretada na sobrevivência SAG neurônio e crescimento de neuritos. Aspectos inovadores deste protocolo incluem o uso de um sistema isento de soro, para explantes cultura eo uso de contas embebido em fatores de crescimento para estudar os efeitos sobre crescimento de neuritos SAG. Um método semelhante ao nosso talão tem sido descrita para a medula espinhal pinto ^10. Tradicionalmente, os grânulos têm sido utilizadas em estudos com fatores axônio clássico orientação e morfogenes. Aqui, nós mostramos que o ensaio de esferas pode também ser usado para investigar os efeitos de neurotrofinas (ou outros fatores de crescimento) no crescimento de neuritos (Fig. 1).

Existem etapas críticas do processo que pode ter de ser modificados ou otimizados para aplicações diferentes. Estes passos também são variáveis ​​importantes para trouble-shooting experimentos que parecem ser vencida. Primeiro, neurotrofina-3 (NT-3), fator neurotrófico ciliar (CNTF) e ITS (insulina, transferrina, selênio) foram adicionados ao meio de cultura para promover a sobrevivência do neurônio SAG e aumentar crescimento de neuritos ^6,8. Esses fatores de crescimento estão incluídos nos experimentos da medula espinhal, a fim de testar a bioatividade de moléculas nas condições do ensaio mesmo que o SAG explantes foram testados. No entanto, outros fatores de crescimento podem ser mais apropriadas para estes e outros tipos de tecido. Segundo, uma concentração de 1,5 mg / ml de colágeno foi escolhido depois de testar uma gama de concentrações de colágeno (0,5, 1,0, 1,5 e 2 mg / ml), porque ele produziu o crescimento de neuritos mais robusto do SAG frango E4 após 24h. Outras fontes de neurônios pode exibir um ótimo diferentes de colágeno. Finalmente, as concentrações de proteína, o número de contas, ea distância entre os explantes e contas também devem ser otimizadas para cada aplicação. Algum fato crescimentoors, como morfogenes, são expressos em gradientes e exercer dependente da concentração efeitos sobre os axônios em crescimento durante o desenvolvimento ^11. Portanto, uma gama de concentrações deve sempre ser testada com ensaios de crescimento de neuritos. Cuidados devem ser tomados para evitar a toxicidade: temos observado níveis elevados de morte celular com alta concentração de algumas proteínas (por exemplo, Sonic hedgehog).

Este método pode ser adaptado para aplicações adicionais, incluindo outras idades, tipos de tecidos, co-cultura métodos e imunocoloração adicionais (por exemplo, ensaios de sobrevivência celular). Conseguimos cultivadas SAG E3-E5, E6 retina, e E7 explantes bulbo olfatório, a partir de bico, usando as condições de cultura mesmo. Quando conseqüência é robusto em amostras de controlo, este método também pode revelar respostas repulsiva a fatores secretados. Métodos semelhantes são usados ​​para testar efeitos de morfogenes sobre os neurônios de mamíferos ^12,13, e atualmente estamos investigando os efeitos das BMPs, FGFs e Shh no crescimento de neuritos SAG. Além disso, como os géis de colágeno são polimerizados em um placa de 24 cavidades, eles são grandes o suficiente para posterior incorporação e corte com um criostato. Nós rotineiramente realizar ensaios de TUNEL em criosecções de culturas gel de colágeno, o que nos permite correlacionar o nível de sobrevivência das células com a quantidade de crescimento de neuritos partir da mesma amostra ^8.

Existem limitações ao uso do gel de colágeno ensaios da maneira que nós apresentamos aqui. Por exemplo, as respostas observadas na deliberadamente simplificado em ambiente in vitro podem não refletir as respostas para o mesmo fator, quando presente na mais complexa situação in vivo. Como assim, não podemos distinguir periférico de processos centrais e não pode distinguir auditiva de neurites vestibular. Portanto, a heterogeneidade na capacidade de resposta entre essas populações poderiam trazer conseqüência irregular ou não-uniforme ou, se a população de responder é uma pequena fração dototal, o gânglio pode ser marcado como mostrar nenhum efeito. Finalmente, apresentamos um método que pode ser usado para explantes SAG cultura E4 em soro livre de condições com a sobrevivência do neurônio significativo, com uma variedade de aplicações de estudar a sobrevivência da célula para a orientação dos axônios. No geral, este sistema é benéfico porque permite monitorar os efeitos devido à adição de purificada fatores isoladamente ou em combinações sem as variáveis ​​de confusão de outros fatores secretados e pistas de orientação dos axônios que podem estar presentes no ambiente em vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope			We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination
Slide warmer	C.S. E.		Collagen polymerization
Chicken egg incubator
37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator
Sylgard© coated petri dish
24-well cell culture plate	Corning	3526
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55 Dumont forceps	Fine Science Tools	11295-51
Stainless steel dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10	Embryo pinning, fine dissection
Moria perforated spoon	Fine Science Tools	10370-17	Embryo harvest/transfer
200 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	118-96R	Explant transfer
E4 and E6 chicken eggs
Chick Ringer’s solution			Embryo harvest
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	SAG dissection
L15 medium	Sigma-Aldrich	L5520	Spinal cord dissection medium
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11150	Spinal cord dissection medium
Vannas Scissors	World Precision Instruments, Inc.	501778	Spinal cord dissection
Rat-tail collagen Type I	BD Biosciences	354249	Explant culture
10X PBS (Sterile)			To neutralize collagen
1N NaOH (Sterile)			To neutralize collagen
Distilled water (Sterile)			To neutralize collagen
pH indicator papers (6.0-8.1)	Whatman, GE Healthcare	2629-990	To check collagen pH
15 ml conical tubes	Dot Scientific, Inc.	818-PG
500 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	119-R100	To pipet collagen
DMEM/F12 medium	Sigma-Aldrich	D8437	Explant culture medium
ITS+1	Sigma-Aldrich	I2521	Medium supplement
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Medium supplement
CNTF (rat)	Sigma-Aldrich	C3835	Medium supplement
NT-3 (human)	Sigma-Aldrich	N1905	Medium supplement
Purified mouse Wnt5a	R&D Systems	645-WN-010
Affi-gel Blue gel beads	Bio-Rad	153-7302
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation
PBS			Rinses
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Blocking solution
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Blocking solution
Calf serum	Invitrogen	16170-078	Blocking solution
Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody	Sigma-Aldrich	T8535	Labels cell bodies and neurites
Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody	Invitrogen	A21141	Detects β Tubulin antibody
Teflon micro spatula	VWR international	57949-033	Release collagen gels from well