Summary
우리는 병아리 E4 statoacoustic 신경절 및 E6 척수의 explants을 해부하다 문화하는 방법을 보여줍니다. Explants는 24 시간 동안 3D 콜라겐 젤의 혈청 무료 조건에서 양식입니다. Neurite 대응은 성장 인자 - 보충 매체와 단백질 코팅 비즈와 함께 테스트됩니다.
Abstract
닭 내이 (内耳)의 감각 기관은 statoacoustic 신경절 (SAG) 뉴런의 주변 장치 프로세스에 의해 innervated 있습니다. 감각 기관의 innervation이 성장 axons 및 / 궤도를 따라 그들의 감각 기관 목표 내에 축삭 안내 단서 1과 생존 요인 2 조합에 따라 달라집니다. 예를 들어, 전형적인 축삭지도 신호 경로, semaphorin - neuropilin와 기능 간섭은 귀의 axons 3 misrouting 생성. 또한, 여러 가지 성장 요인 Neurotrophin - 3 (NT - 3) 및 뇌 유래 Neurotrophic 팩터 (BDNF)를 포함 내이의 감각 대상, 표현하는 것은 다시 SAG의 axons 4 misrouting로 이어지는, 유전자 변형 동물에 조작되었습니다. 이 같은 분자 체외 5,6의 생존과 여자는 SAG의 뉴런의 neurite의 파생물을 모두 추진하고 있습니다.
여기서는 설명하고 체외 방법에서 현재 U있는 입증알려진 같은 Wnts 같은 morphogens뿐만 아니라, SAG의 neurite의 파생물 및 신경 세포 생존을 촉진에 중요한 성장 요인을 포함하여 가용성 단백질에 여자는 SAG의 neurites의 반응을 테스트하는 노래. 이 모델 시스템을 사용하여, 우리는 분비 리간드는 SAG의 신경 세포의 생존과 neurite의 파생물에 견딜수 수있는 효과에 대한 결론을 그릴 수 있도록 최선을 다하겠습니다.
SAG의 explants은 배아 일 4 (E4)에 해부 및 24 시간 동안 혈청이없는 조건 입체 콜라겐 젤의 양식입니다. 첫째, neurite 응답은 단백질 보충 매체 culturing의 explants에 의해 테스트됩니다. 그런 다음 분비 리간드의 포인트 소스 neurite 가지에 대한 방향성 영향을 미칠 수 있는지 여부를 물어, explants는 단백질 코팅 비즈와 공동 교양 및 지역 홍보 또는 파생물을 억제하기 위해 비드의 능력에 대한 assayed 있습니다. 우리는 또한 해부의 실연 (7 번 프로토콜 수정) 및 E6 척수의 explants 문화를 포함합니다. 우리정기적으로 단백질과 단백질 절어 구슬의 bioactivity을 확인하기 척수의 explants를 사용하고 SAG의 explants 같은 문화 조건에서, 병아리, 조직과 종에게 교차 반응을 확인할 수 있습니다. 시험 관내 assays에서 이들은 신속 특히 생체내에서 연구를 수행하기 전에, 영양 (생존) 또는 SAG의 뉴런에서 열대 (방향) 효과를 발휘 분자에 대한 심사를위한 편리합니다. 또한,이 방법은 높은 신경 세포의 생존 8, 혈청이없는 조건에서 각각의 분자의 테스트를 수 있습니다.
Protocol
요리법
칙 Ringers
| 7.2 g | NaCl |
| 0.23 g | CaCl 2 + 2 시간 2 O |
| 0.37 g | KCl |
| 0.115 g | 나이 HPO 4 |
| 900 ML | 물 (조직 문화 학년) |
참고 : 7.4로 산도를 조정합니다. 물로 1,000 ML에 최종 볼륨을 가져와.
10X PBS
| 40g | NaCl |
| 1g | KCl |
| 7g | 나이 HPO 4 |
| 1.2 g | KH 2 PO 4 |
| 450 ML | DEPC 물 |
참고 : 7.4로 산도를 조정합니다. 최종 가져와물 500 ML에 볼륨. 작업 농도 (1X)는 같은 18 MΩ - cm의 전도성과 물을 생성하는 Millipore 자외선 조사 시스템 얻은로 조직 문화 등급 물 9 부분 1 부분 10X 주식을 diluting에 의해 이루어집니다.
explant 개최 매체 SAG
- L - 글루타민과 함께 DMEM/F12, 10 MM Hepes
- 10 % 인슐린, 전송, 셀레늄 (ITS +1)
- 1퍼센트 펜 - strep
Explant 문화 매체
- explant 개최 매체 SAG
- 10 NG / ML Neurotrophin - 3 (NT - 3)
- 10 NG / ML ciliary neurotrophic 인자 (CNTF)
척수의 해부 및 유지 매체
- L - 15
- 10% 소태아 혈청
- 1퍼센트 펜 - strep
37-38에서 부화 계란 ° C. 70 % 에탄올에 도구와 Sylgard 해부 접시를 해부 소독. 요리 도구를 해부하면 UV가 밤새 소독 수 있습니다.
- 한 ML 무균 PBS, 믹스, 그리고 튜브의 바닥에 정착하는 비즈 기다리는와 microtube에 넣어 비즈.
- 비즈가 정착하고 PBS에 resuspend 후에 뜨는을 제거하여 비즈를 여러 번 씻으십시오.
- 상온에서 1 시간 동안 단백질 (PBS에 희석) 또는 PBS 혼자 (컨트롤)을 정화의 구슬을 품어.
- 콜라겐에 배치까지 1ml PBS로 24 잘 플레이트에서 PBS와 저장소의 구슬을 씻어.
2. Statoacoustic 신경절의 해부
- E4에서 난자에서 배아를 제거하고 배아 세포막을 제거하는 여자 울리는의 솔루션과 함께 접시에 넣습니다.
- 차가운 HBSS 최대 직면하고있는 귀의 소포와의 측면에 위치 배아를 가득 Sylgard © 늘어선 페트리 접시에서 배아를 놓습니다. 해부 핀을 사용하여 요리에 배아를 핀.
- 두 해부 핀을 사용하여 피부를 통해 수평 절단을 즉시 복부운하 파우치는 약 그것은 달팽이 덕트가 만나는 곳이. 수직 절단이 앞쪽에 있고 SAG에 후부합니다. 세 인하 마주하고 피부를 리프트하고 제거하는 포셉 또는 해부 핀을 사용합니다.
참고 : SAG는 brightfield 기본 조명과 함께 쉽게 볼 수있는 지느러미 파우치, 그리고 ventromedially 프로젝트와 pharyngeal 아치에 의해 왜곡시킨다 복부 달팽이 덕트 사이의 중간 정도 otocyst의 anteroventral 가장자리에 위치하고 있습니다. 달팽이 덕트 elongates는 dorsoventral 차원 있도록 점진적으로 햄버거 - 해밀턴 단계 9월 23일에서 25일까지 사이 E4에서 증가합니다.
- SAG에서 분리 사후 방향으로 otocyst를 당겨. 해부 핀과 SAG를 둘러싼 조직을 치환 조심스럽게 # 55 포셉를 사용하여 배아에서 SAG를 제거합니다. mesenchymal 조직 및 SAG에서 튀어나온 신경 번들의 큰 덩어리를 제거합니다.
- 넓은 입을 pipet 팁 사용으로 explant를 전송미디어를 들고 0.5 ML의 SAG의 explant 24 - 우물 판. 최대 4 시간 동안 얼음이나 실온에서 explants 보관하십시오.
3. 척수의 해부
- 난자에서 E6 배아를 제거하고 여자 울리는의 솔루션을 포함 접시에 넣습니다. 머리와 배아 세포막을 제거합니다.
- Sylgard에 몸을 © 차가운 척수의 해부 매체를 포함하는 해부 접시를 놓습니다. 위치와 실험자 직면하고있는 배아 '복부 아래 "와 꼬리를 핀. 각 사지 통해 앞쪽에 말까지 해부 핀을 넣으십시오.
- 집게 및 /를 사용하거나 핀을 해부하는 것은 조심스럽게 척수의 지느러미 표면을 볼 때까지 복부 방향으로 이동, 피부와 조직을 제거합니다.
- 척수의 전체 길이를 따라, 앞쪽에 방향으로 사후에 해부 핀으로 척수의 지느러미 중간선을 잘라요. 이것은 별도의 척수의 왼쪽과 오른쪽 양쪽으로 "열린 책"을 만듭니다.
- 집게와 척수의 꼬리 - 대부분의 끝을 잡고 실험자부터 멀리 올려서하여 본문에서 척수를 제거합니다. 나머지 DRG와 meninges을 제거합니다.
- 포셉 (또는 접시에 핀)와 척수의 한쪽 끝을 잡고 척수를 이등분하는 배면의 중간선을 따라 잘라 Vannas 가위를 사용합니다.
- 조직을 고정하고 조직의 길이를 따라 작은 explants (100-500 음 길이)를 잘라 Vannas 가위를 사용하는 집게와 explant의 한쪽 끝을 잡아. 바닥 플레이트 한 explant 가장자리를 따라 조직의 명확한 농화로 인식된다.
- 0.5 ML 차가운 해부 매체와 24 잘 접시에 explants를 전송하기 위해 넓은 입을 pipet 팁을 사용합니다. 얼음 explants는 조직 생존, F를 유지하기 위해 계속또는 최대 4 시간.
4. neurite 반응을 테스트하기 위해 정화 단백질과 문화를 Explant
- 제조 업체의 지시에 따라, 얼음, 15 ML 원뿔 튜브 1.5 MG / ML 콜라겐 솔루션을 준비합니다.
- 콜라겐 솔루션 7-7.4를 사용하여 산도 표시기 종이의 산도를 가지고 있는지 확인합니다. 1 μl 권 NaOH를 추가하여 산도를 조정합니다.
- 다양한 입 pipet 팁 및 대기음 초과 액체를 사용하여 24 자 판에 explants을 전송합니다. 여러 explants 잘 하나에 교양 수 있지만, 서로 별개로 적어도 500 μm의를 배치해야합니다.
- 잘 explant를 포함하는 콜라겐의 0.5 ML을 추가합니다. 우물의 바닥 표면에 explant를 놓습니다. 콜라겐은 상온에서 중합 시작되므로 다음 잘 진행하기 전에 완전히 각 문화를 설정해야합니다.
- 콜라겐 중합에 30-45 분 ° C 슬라이드 따뜻한 37 문화 판을 놓습니다. 콜라겐은 polyme을 때그것이 젤 닮았 것입니다 rized.
- 정화 단백질 (PBS에 희석) 또는 PBS (제어) 중 하나와 함께 보충 0.5 ML 따뜻한 explant 문화 매체를 추가하고 37 품어 ° C, 5 % CO 2. neurite 가지의 효과는 24 시간으로 표시됩니다.
참고 : 42 시간 문화 SAG의 explants에 동일한 프로토콜을 사용하고 있습니다.
5. 방향 neurite의 파생물을 테스트하는 단백질 코팅 비즈와 공동 문화를 Explant
- explant 문화 단계 4.1-4.4로 시작합니다.
- pipet을 사용하여 PBS에서 잘 콜라겐 솔루션과 explant를 포함하는 1-5 비즈를 전송.
- explant의 가장자리에서 비즈 50-500 μm의 위치를 위해 집게를 사용하십시오.
- 콜라겐 중합에 30-45 분 ° C 슬라이드 따뜻한 37 접시를 놓습니다. 조직이나 비드는 콜라겐이 polymerizes로 전이 될 수 있습니다. 첫 5 분 동안 문화와 다시 위치 조직 및 구슬을 확인하십시오.
- 0.5 m 추가내가 잘하는 각각의 미디어를 SAG 24 시간 동안 품어.
6. immunohistochemistry로 neurite 가지의 시각화
- PBS의 문화를 씻어 PBS에서 4 % paraformaldehyde로 실온에서 1 시간 수정.
- 테플론 마이크로 주걱의 둥근 엔드와 젤의 가장자리 주변의 추적에 의해 우물의 벽에서 젤 풀어. 우물에서 젤로 immunostain을 수행합니다. PBS로 여러 번 씻어.
- 4 박 0.5 ML 차단 솔루션 (10 % 송아지 혈청, PBS에 0.1 % 트리톤 X - 100, 0.1 %의 나트륨 azide) ° C.에 품어
- 4 박 0.5 ML 차 항체 (항 - β - Tubulin 항체가 솔루션을 차단에 1:500 희석)에 품어 ° C.
- PBS로 여러 번 씻어. 4 박 0.5 ML 차 항체 (알렉사 형석 488 염소 안티 - 마우스 IgG 항체 2B가 1:500 희석)에 품어 ° C. 앞으로이 단계부터의 감도를 조명으로 인해 호일에 어두운 또는 포장에 접시를 유지보조 항체.
- ° C PBS에서 일주일 4에서 PBS와 저장소에 여러 번 씻어.
7. 대표 결과
그림 1. 정화 NT - 3 및 E4 여자는 SAG의 explants에서 NT - 3 - 코팅 구슬의 neurite - 촉진 효과의 대표적인 결과입니다. 신경 세포 기관 및 neurites β - Tubulin와 immunostained 및 공촛점 현미경에서 10X 목적으로 몇 군데를했다 SAG. 체외 24 시간 후, SAG의 explants 컨트롤 (1A)에 비해, NG / ML 정화 인간 NT - 3는 세포 배양 매체 (1B)에 추가 100 존재에 큰 neurite의 파생물을 표시합니다. SAG의 뉴런은 NT - 3의 포인트 소스가 로컬 neurite 가지를 홍보할 수 있습니다는 것을 입증하는 in100 NG / ML NT - 3 절어 비즈와 공동 교양되었습니다. Explants 더 표시되고 측면에 밀도 neurite 가지비드가 반대편 (1D)에 비해 및 PBS (1C)에 배어 구슬과 문화를 제어에 비해 직면 explant. 스케일 바 = 200 μm의.
그림 2. E6 병아리 척수에 정화 Wnt5a 및 Wnt5a - 코팅 구슬의 neurite - 촉진 효과의 대표적인 결과입니다. 척수의 explants는 β - Tubulin와 immunostained 및 공촛점 현미경으로 몇 군데 있었다. 정화 마우스 Wnt5a (400ng/ml), 병아리, 척수의 explants에서 neurite 가지의 존재 성장 24 시간의 증가 이후 (2B) Wnt5a (2A)없이 양식 컨트롤에 비교했다. 500 NG / ML Wnt5a에 배어 구슬은 또한 문화 (2C)를 제어에 비해 neurite 가지 (2D)를 추진하고, 척수의 explants의 가장자리 300-500 μm의 배치. 비슷한 공동 문화 결과는 이전에 다음 ID로 Wnt5a - 표현 세포 8 발표했다. 스케일 바 = 200μm의.
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Discussion
우리는 혈청이없는 조건에서, 병아리의, 문화 E4의 SAG와 E6 척수의 explants을 해부하다하고 방법을 제시한다. 이 절차는 현재 SAG의 신경 세포의 생존과 neurite의 파생물에 대한 다양한 분비 리간드의 효과를 연구하기 위해 연구실에서 사용됩니다. 이 프로토콜의 소설 측면 culturing의 explants와 SAG의 neurite의 파생물에 대한 효과를 연구하기 위해 성장 요인에 배어 구슬의 사용을위한 혈청없는 시스템의 사용을 포함합니다. 우리와 비슷한 비드 방법은 여자가 척수 10 설명되었습니다. 전통적으로, 구슬은 고전적인 축삭지도 요소 및 morphogens와 함께 연구에 사용되었습니다. 여기, 우리는 비드 분석도 neurite 가지 (그림 1) neurotrophins (또는 다른 성장 요소)의 효과를 조사하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다.
다른 응용 프로그램에 대한 수정하거나 최적화 할 수 있습니다 프로 시저에서 중요한 단계가 있습니다. 이 단계는 또한 troub에 중요한 변수실패처럼 보이는 르 촬영 실험. 첫째, Neurotrophin - 3 (NT - 3), Ciliary Neurotrophic 인자 (CNTF)와 ITS가 (인슐린, 트랜스페린, 셀레늄) SAG의 신경 세포의 생존을 촉진하고 neurite 가지 6,8을 향상시키기 위해 문화 매체에 추가되었습니다. 이러한 성장 요인은 SAG의 explants가 테스트되었습니다 것과 동일한 분석 조건에서 분자의 bioactivity을 테스트하기 위해 척수 실험에 포함되어 있습니다. 그러나 다른 성장 요인은 이러한 및 기타 조직 유형에 대한 더 적절한 수 있습니다. 둘째, 콜라겐의 1.5 MG / ML 농도가 24 시간 후 E4 치킨 SAG에서 가장 강력한 neurite의 파생물을 제작하기 때문에 콜라겐 농도 범위 (0.5, 1.0, 1.5 및 2 MG / ML)를 테스트 후 선정되었습니다. 뉴런의 다른 소스는 콜라겐의 다른 최적의를 표시할 수 있습니다. 마지막으로, 단백질 농도, 구슬의 개수, 그리고 explants과 구슬 사이의 거리는 각 응용 프로그램에 최적화된해야합니다. 일부 성장 사실같은 morphogens 같은 ors은, 그라디언트로 표현 개발 11시 성장 axons에 집중 - 의존 효과를 발휘하고 있습니다. 따라서, 농도 범위는 항상 neurite 가지의 assays와 함께 테스트해야합니다. 치료는 독성을 피하기 위해 이동해야합니다 우리는 (예, 소닉 고슴도치) 몇 가지 단백질의 높은 농도로 세포 사망의 높은 수준을 관찰했습니다.
이 방법은 다른 연령, 조직 유형, 공동 문화 방법, 및 추가 immunostaining (예, 세포 생존 assays)를 포함하여 추가 응용 프로그램에 대해 적용할 수 있습니다. 우리는 같은 문화 조건을 사용하여 여자에서 성공적으로 교양 E3 - E5의 SAG, E6 망막, 그리고 E7 후각 망울의 explants 있습니다. 가지는 컨트롤 샘플에서 강력한 때,이 방법은 또한 분비 요인에 반발 반응을 확인할 수 있습니다. 비슷한 방법은 포유류의 신경 12,13에 morphogens의 효과를 테스트에 사용되었고, 현재 BMPs, FGFs, 그리고 쉬의 효과를 조사하고 있습니다SAG의 neurite의 파생물에 H. 콜라겐 젤은 24 잘 플레이트에 polymerized 있기 때문에 또한, 그들은 충분히 큰 이후에 삽입하고 그라 이오 스탯과 sectioning. 우리는 정기적으로 우리가 똑같은 샘플을 8 neurite 가지의 양을과 세포 생존의 수준을 상호 연관시킬 수 있도록 콜라겐 겔 문화의 cryosections에 TUNEL assays을 수행합니다.
우리가 그들을 제시하는 방법으로 콜라겐 겔 assays를 사용하는 한계가 있습니다. 예를 들어, 고의적으로 체외 환경에서 단순화된에서 관찰 응답은 동일한 요소에 대한 답변을 반영하지 않을 수 있습니다되면 생체내 상황에서보다 복잡한에 존재. 뿐만 아니라, 우리는 중앙 프로세스에서 말초 구분하지 수 vestibular neurites에서 청각을 구분할 수 없습니다. 따라서 이러한 인구 가운데 응답의 이질은 응답 인구의 작은 분수 경우, 불규칙한 또는 비 균일한 가지를 얻을 수 있총 신경절은 아무런 영향을 보여주는하지 않기 때문에 득점 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 축삭의지도로 세포 생존을 공부에서 다양한 응용 프로그램과 함께, 중요한 신경 세포의 생존과 혈청이없는 조건 하에서 문화 E4의 SAG의 explants하는 데 사용할 수있는 방법을 제시합니다. 그것은 생체내 환경에서에 존재하는 다른 분비 요인 및 축삭지도 단서의 혼란함을 주죠 변수없이 요소를 단독으로 또는 조합을 정화의 추가로 인해 효과를 모니터 한 수 있기 때문에 전체적으로,이 시스템은 유용합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 그랜트 RO1DC002756 국립 연구소와 Purdue 학술 진흥 재단에 의해 투자되었다. 우리는 실험과 수치과 관련하여 도움이 로드니의 McPhail와 조언 도리스 우와 Wiese 장 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection microscope | We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | ||
| Slide warmer | C.S. E. | Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator | |||
| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator | |||
| Sylgard© coated petri dish | |||
| 24-well cell culture plate | Corning | 3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 118-96R | Explant transfer |
| E4 and E6 chicken eggs | |||
| Chick Ringer’s solution | Embryo harvest | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma-Aldrich | L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501778 | Spinal cord dissection |
| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences | 354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| 1N NaOH (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| Distilled water (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman, GE Healthcare | 2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific, Inc. | 818-PG | |
| 500 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 119-R100 | To pipet collagen |
| DMEM/F12 medium | Sigma-Aldrich | D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma-Aldrich | I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma-Aldrich | C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma-Aldrich | N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation |
| PBS | Rinses | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen | 16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma-Aldrich | T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody | Invitrogen | A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR international | 57949-033 | Release collagen gels from well |
References
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