Разбор и культуры Чик Statoacoustic ганглия и спинного мозга при эксплантов Коллаген Гели для нейритов Анализы вырост

Summary

Мы показываем, как препарировать и культуре куриных Е4 statoacoustic ганглия и E6 спинного эксплантов мозга. Эксплантов культивируют в бессывороточной условия в 3D гели коллагена в течение 24 часов. Нейритов отзывчивость тестируется с фактором роста дополнена средой и с белком покрытием бисером.

Abstract

Органов чувств куриного внутреннего уха иннервируются периферических процессов statoacoustic ганглий (SAG) нейронов. Сенсорная иннервация органа зависит от сочетания аксон руководством сигналы ¹ и ² факторов выживания, расположенных вдоль траектории растущих аксонов и / или в рамках своей цели сенсорных органов. Например, функциональные вмешательство в классический аксон руководством сигнального пути, semaphorin-neuropilin, генерируемых misrouting из ушной аксонов ^3. Кроме того, некоторые факторы роста, выраженный в сенсорных целей внутреннего уха, в том числе нейротрофина-3 (NT-3) и производные мозга нейротрофический фактор (BDNF), были изменены в трансгенных животных, опять же ведет к misrouting СА аксонов ^4. Эти же молекулы способствующие выживанию и аксонов нейронов куриных SAG в пробирке ^5,6.

Здесь мы описываем и продемонстрировать в пробирке методом мы в настоящее время упеть проверить отзывчивость нейритов куриных SAG в растворимые белки, в том числе известные морфогенов таких как Wnts, а также факторы роста, которые имеют важное значение для содействия SAG результатом аксонов и нейронов выживания. Используя эту модель системы, мы надеемся сделать выводы об эффектах, которые выделяются лигандов может оказывать на SAG выживанию нейронов и аксонов.

SAG эксплантов расчленены на 4-й день эмбрионального (Е4) и культивировали в трехмерном гели коллагена под бессывороточной условиях в течение 24 часов. Во-первых, нейритов отзывчивость проверяется при культивировании эксплантов с белком-добавляемой среде. Затем, чтобы спросить, есть ли точечных источников выделяется лиганды могут иметь направленного воздействия на аксонов, эксплантаты являются со-культивировали с белком покрытые бисером и анализировали на способность борта к локально способствовать или препятствовать нарост. Мы также включаем демонстрации вскрытия (модифицированный протокол ⁷⁾ и культуры E6 спинного эксплантов мозга. Мыобычно используют спинного эксплантов шнур для подтверждения биологической активности белков и белковых пропитанной бисера, а также для проверки видов перекрестной реактивности с куриных ткани, в тех же условиях культуры как SAG эксплантов. Эти тесты в пробирке удобны для быстрого скрининга молекул, которые оказывают трофические (выживание) или тропического (по направлению) воздействие на нейроны SAG, особенно перед проведением исследования в естественных условиях. Более того, этот метод позволяет испытания отдельных молекул под бессывороточной условиях, с высокой выживаемости нейронов ^8.

Protocol

Рецепты

Чик Ringers

7,2 г	NaCl
0,23 г	CaCl 2 + 2H 2 O
0,37 г	KCl
0,115 г	Na 2 HPO 4
900 мл	Вода (степень культуры ткани)

Примечание: Регулировка рН до 7,4. Принесите конечный объем до 1000 мл воды.

10X PBS

40 г	NaCl
1 г	KCl
7 г	Na 2 HPO 4
1,2 г	KH 2 PO 4
450 мл	DEPC воды

Примечание: Регулировка рН до 7,4. Доведите окончательноеобъем до 500 мл водой. Рабочие концентрации (1X) производится путем разбавления 1 часть 10X акции с 9 частями ткани культуры сорт воды, как, например, полученные с Millipore системы УФ-излучение для получения воды с 18 МОм-см проводимость.

SAG эксплантов проведения среда

• DMEM/F12 с L-глутамина, 10 мМ Hepes
• 10% инсулина, передача, селен (ИТС +1)
• 1% перо-стрептококк

Эксплантов культуральной среде

• SAG эксплантов проведения среда
• 10 нг / мл нейротрофина-3 (NT-3)
• 10 нг / мл цилиарной нейротрофический фактор (CNTF)

Спинной мозг и рассечение проведения среда

• L-15
• 10% эмбриональной телячьей сыворотки
• 1% перо-стрептококк

Инкубировать яйца при 37-38 ° С. Стерилизовать рассекает инструменты и Sylgard рассекает блюдо в 70% этанола. Пройдя через посуду и инструменты могут быть также УФ стерилизовать в одночасье.

1. Место бусины микропробирок с 1 мл стерильной PBS, перемешайте и подождите, пока бусы оседают на дне пробирки.
2. Вымойте бисером несколько раз, удаляя супернатант после бисером поселились и ресуспендируют в PBS.
3. Инкубируйте бусины очищенного белка (разводят в PBS) или PBS в одиночку (контроля) в течение 1 часа при комнатной температуре.
4. Промыть бусин в ФБР и хранить в 24-луночного планшета с 1 мл PBS, пока размещены в коллаген.

2. Statoacoustic рассечение ганглий

1. На Е4 удалить эмбрион из яйцеклетки и поместить его в блюдо с раствором куриного Рингера для удаления зародышевых оболочек.
2. Место эмбриона в Sylgard © выстроились Петри заполнена холодным HBSS и положение эмбриона на бок слухового пузыря вверх. Pin эмбриона блюдо использованием рассекает булавки.
3. Использование двух рассекает контакты, сделать горизонтальный разрез через кожу сразу вентральнееканал сумки, примерно там, где он отвечает улиткового канала. Сделайте вертикальный разрез передней и задней, чтобы SAG. Используйте пинцет или рассекает булавку, чтобы поднять и удалить лоскут кожи граничит с тремя разрезами.

   Примечание: SAG находится на краю антеровентральном отоцист, примерно на полпути между спинной сумке которого хорошо видна с подсветкой базы светлое, и вентральной улиткового канала, какие проекты ventromedially и заслоняется глотки арок. Улиткового канала удлиняется так что его дорсовентральной размер будет постепенно увеличиваться на Е4 между Гамбургер-Гамильтона этапы 23-25 ​​9.

4. Потяните отоцист в заднем направлении, чтобы отделить его от SAG. Свернуть тканей, окружающих SAG с рассечением штифты и осторожно снимите SAG из эмбриона с помощью # 55 щипцами. Удалите большие куски мезенхимальных тканей и нервных пучков выступающие от SAG.
5. Использование широким горлом кончика пипетки, передача эксплантов для24-луночный планшет с 0,5 мл SAG эксплантов проведение среды. Держите эксплантов на льду или при комнатной температуре в течение 4 часов.

3. Спинной рассечение шнур

1. Удалить E6 эмбриона из яйцеклетки и поместить его в блюдо с раствором куриного Рингера. Удалите головы и зародышевых оболочек.
2. Место тела в Sylgard © рассекает блюдо с холодной средой рассечение спинного мозга. Положение и контактный эмбриона "вентральный вниз" и хвостового стоящих перед экспериментатором. Место вскрытия булавки каждой конечности и через передний конец.
3. Использование щипцов и / или рассекает булавки, осторожно снимите кожу и ткани, двигаясь в направлении вентральной, пока дорсальной поверхности спинного мозга видна.
4. Отрежьте спинной средней линии спинной мозг с рассекает контактный, в задней к передней, вдоль всей длины спинного мозга. Это создает "открытая книга", как левая и правая стороны спинного мозга отдельно.
5. Удалить спинной мозг из организма, удерживая хвостового-самый конец спинного мозга пинцетом и поднимая вверх и в сторону от экспериментатора. Удалите оставшиеся DRG и мозговых оболочек.
6. Держите один конец спинного мозга с пинцетом (или контактный его в блюдо) и использовать Vannas ножницы, чтобы разрезать вдоль вентральной средней линии, чтобы делить пополам спинного мозга.
7. Держите один конец эксплантов щипцами для иммобилизации ткани и использовать Vannas ножницы, чтобы вырезать небольшие эксплантов (100-500 мкм в длину) по всей длине ткани. Плиты перекрытия могут быть признаны ясно утолщения ткани вдоль одной эксплантов края.
8. Используйте широкий рот кончик пипетки для передачи эксплантов в 24-луночный планшет с 0,5 мл холодной среды рассечение. Держите эксплантов на льду для поддержания жизнеспособности тканей, еили до 4 часов.

4. Эксплантов культуры с очищенных белков для проверки нейритов отзывчивость

1. Подготовка 1,5 мг / мл раствора коллагена в 15 мл коническую трубку, на льду, в соответствии с инструкциями производителя.
2. Проверьте коллагена решение имеет рН 7-7.4 использованием индикаторной бумаги рН. Отрегулируйте рН путем добавления NaOH в 1 мкл.
3. Передача эксплантов для 24-луночного планшета, используя широкий кончик пипетки ртом и аспирата лишнюю жидкость. Несколько эксплантов можно культивировать в одной скважине, но должно быть как минимум 500 мкм друг от друга.
4. Добавить 0,5 мл коллагена и содержащих эксплантов. Позиция эксплантов на нижней поверхности скважины. Не забудьте настроить каждую культуру полностью, прежде чем перейти к следующему хорошо, потому что коллаген начнет полимеризоваться при комнатной температуре.
5. Место культуры пластины на 37 ° С теплее слайд в течение 30-45 мин для полимеризации коллагена. Когда коллаген polymerized она будет напоминать гель.
6. Добавить 0,5 мл теплой питательной среды эксплантатов дополнены или очищенных белков (разводят в PBS) или PBS (контроль) и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% СО _2. Влияние на аксонов должен быть виден на 24 часа.

   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали тот же протокол для эксплантов культуры SAG до 42 часов.

5. Эксплантов совместной культуре с белком покрытием бисером проверить результат направленного нейритов

1. Начните с эксплантов шаги культуры 4.1-4.4.
2. С помощью пипетки, передача 1-5 бусы из PBS к колодцу, содержащей решение коллагена и эксплантов.
3. Используйте пинцет, чтобы положение бусин 50-500 мкм от края эксплантов.
4. Место пластины на 37 ° С теплее слайд в течение 30-45 мин для полимеризации коллагена. Ткани или бисер может стать, перемещенных в коллаген полимеризуется. Проверьте культур и повторно позиции ткани и бисера в течение первых 5 мин.
5. Добавить 0,5 мл SAG средств массовой информации в каждую лунку и инкубировать в течение 24 часов.

6. Визуализация аксонов по иммуногистохимии

1. Промыть культур в PBS и исправить в течение 1 часа при комнатной температуре в 4% параформальдегида в ФСБ.
2. Выпуск гели от стен скважины с помощью трассировки по краю гели с закругленным концом лопаточки тефлоновой микро. Выполните immunostain с гелей в скважинах. Промойте несколько раз в PBS.
3. Инкубируйте в 0,5 мл блокирующий раствор (10% телячьей сыворотки, 0,1% Triton X-100, 0,1% азида натрия в PBS) в течение ночи при 4 ° C.
4. Инкубируйте в 0,5 мл первичного антитела (анти-β-тубулина антителами разбавленной 1:500 в блокировании решения) в течение ночи при 4 ° C.
5. Промойте несколько раз в PBS. Инкубируйте в 0,5 мл вторичного антитела (Alexa Fluor 488 антимышиного IgG антител _2b разбавленной 1:500) в течение ночи при 4 ° C. С этого шаг вперед, держать пластины в темных или заверните в фольгу, из-за светочувствительностьвторичные антитела.
6. Промойте несколько раз в PBS и хранить при температуре 4 ° С в PBS на срок до одной недели.

7. Представитель Результаты

Рисунок 1. Представитель результаты нейритов способствующих эффект очищенного NT-3 и NT-3-покрытием бусины на эксплантаты Е4 куриных SAG. SAG нейронов клеточных тел и невриты были immunostained с β-тубулина и полученную с 10-кратным цели по конфокальной микроскопии. После 24 часов в пробирке, SAG эксплантов отображается больше аксонов в присутствии 100 нг / мл очищенной человека NT-3 добавляли в среду клеточной культуры (1B), по сравнению с контрольной группой (1А). SAG нейроны со-культурный бисером пропитанной in100 нг / мл NT-3, чтобы продемонстрировать, что точечный источник NT-3 может локально способствовать аксонов. Эксплантов отображается дольше и плотнее аксонов на сторонеэксплантов сталкивается шарик по сравнению с противоположной стороны (1D) и по сравнению с контрольными культурами бисером пропитанные PBS (1С). Шкала бар = 200 мкм.

Рисунок 2. Представитель результаты нейритов способствующих эффект очищенного Wnt5a и Wnt5a покрытием бусины на E6 куриных спинного мозга. Спинной эксплантов шнур были immunostained с β-тубулина и полученную с использованием конфокальной микроскопии. Через 24 часов роста в присутствии очищенной мыши Wnt5a (400ng/ml), аксонов из куриных спинного эксплантов шнур был увеличен (2B) по сравнению с контрольной культурный без Wnt5a (2А). Бисер пропитанную 500 нг / мл Wnt5a, размещенные 300-500 мкм от края спинного эксплантов мозга, также способствовало аксонов (2D) по сравнению с контрольными культурами (2C). Аналогичные побочные культура результаты ранее были опубликованы с Wnt5a-экспрессирующие клетки ^8. Шкала бар = 200мкм.

Discussion

Мы представляем метод препарировать и культуры E4 и E6 SAG спинного эксплантов мозга, от цыпленка, под бессывороточной условиях. Эта процедура в настоящее время используется в нашей лаборатории для изучения влияния различных выделяется лигандов на SAG выживанию нейронов и аксонов. Новые аспекты этого протокола включают в себя использование бессывороточной системы для культивирования эксплантатов и использование бисера пропитанные факторами роста для изучения воздействия на SAG результатом аксонов. Бусинка методом, аналогичным нашим был описан для куриных спинного мозга ^10. Традиционно, бусы были использованы в исследованиях с классическим аксон руководством факторов и морфогенов. Здесь мы показали, что шарик анализа также может быть использован для исследования эффектов нейротрофинов (или других факторов роста) на аксонов (рис. 1).

Есть критические шаги в процедуре, которая, возможно, потребуется внести изменения или оптимизированные для различных приложений. Эти шаги также являются важными переменными для troubле-съемки экспериментов, которые могут оказаться неудачными. Во-первых, нейротрофина-3 (NT-3), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) и ITS (инсулин, трансферрин, селен) были добавлены к культуральной среде, содействовать выживанию нейронов SAG и повышения аксонов ^6,8. Эти факторы роста включены в спинной мозг в экспериментах для проверки биологической активности молекул на тех же условиях, что анализ SAG эксплантов были протестированы. Тем не менее, другие факторы роста могут оказаться более подходящими для этих и других видов ткани. Во-вторых, 1,5 мг / мл, концентрация коллагена был выбран после тестирования спектр коллагеновых концентрации (0,5, 1,0, 1,5 и 2 мг / мл), потому что он произвел самый надежный аксонов от SAG куриные Е4 через 24 часа. Другие источники нейроны могут отображать различные оптимальные коллагена. Наконец, белка концентрации, количество бусинок, а расстояние между эксплантов и бисером также должны быть оптимизированы для каждого приложения. Некоторый рост фактПРС, таких как морфогенов, выражаются в градиентах и оказывают концентрация-зависимых эффектов по выращиванию аксоны во время развития ^11. Таким образом, диапазон концентраций всегда должны быть проверены с помощью аксонов анализы результат. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать токсичности: у нас наблюдается повышенный уровень гибели клеток с высокой концентрацией некоторых белков (например, Sonic Hedgehog).

Этот метод может быть адаптирован для дополнительных приложений, в том числе других возрастов, типов тканей, со-культуры методов, а также дополнительные иммуноокрашивания (например, анализы выживаемость клеток). Мы успешно культурный E3-E5 SAG, E6 сетчатки, и E7 обонятельных эксплантов луковица, от куриных, с использованием тех же условиях культуры. Когда результат является надежной в контрольных образцах, этот метод может также показать отталкивающим ответы на выделяемые факторы. Аналогичные методы были использованы для тестирования эффектов морфогенов на млекопитающих нейроны ^12,13, и мы в настоящее время изучает последствия BMP, FGFs, Ш.ч на SAG результатом аксонов. Кроме того, поскольку коллаген гели полимеризуется в 24-луночного планшета, они являются достаточно большими для последующего вложения и секционирования с криостата. Мы регулярно выполнять TUNEL пробы на cryosections коллагена гель культур, что позволяет соотнести уровень выживаемости клеток с количеством аксонов из того же образца ^8.

Существуют ограничения на использование анализов коллагеновый гель в том, как мы представили их здесь. Например, ответы наблюдались в намеренно упрощенной, в среду пробирке, могут не отражать ответы на тот же фактор, когда присутствует в более сложной ситуации в естественных условиях. Кроме того, мы не можем отличить периферический из центральных процессов и не может отличить от слухового вестибулярного невриты. Таким образом, неоднородность отклика среди этих групп может дать нерегулярными или неоднородным результат или, если ответ населения небольшая частьВсего ганглия может быть засчитан как показывает никакого эффекта. Наконец, мы представили метод, который может быть использован для культуры эксплантов Е4 SAG под бессывороточной условиях со значительным выживание нейронов, со множеством приложений от изучения выживаемости клеток, чтобы руководство аксона. В целом, эта система выгодна, поскольку она позволяет контролировать эффекты, связанные с добавлением очищенной факторы по отдельности или в комбинации, не вмешивающихся факторов других выделяемых факторов и сигналы аксонов руководством, которое может присутствовать в в естественных условиях окружающей среды.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope			We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination
Slide warmer	C.S. E.		Collagen polymerization
Chicken egg incubator
37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator
Sylgard© coated petri dish
24-well cell culture plate	Corning	3526
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55 Dumont forceps	Fine Science Tools	11295-51
Stainless steel dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10	Embryo pinning, fine dissection
Moria perforated spoon	Fine Science Tools	10370-17	Embryo harvest/transfer
200 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	118-96R	Explant transfer
E4 and E6 chicken eggs
Chick Ringer’s solution			Embryo harvest
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	SAG dissection
L15 medium	Sigma-Aldrich	L5520	Spinal cord dissection medium
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11150	Spinal cord dissection medium
Vannas Scissors	World Precision Instruments, Inc.	501778	Spinal cord dissection
Rat-tail collagen Type I	BD Biosciences	354249	Explant culture
10X PBS (Sterile)			To neutralize collagen
1N NaOH (Sterile)			To neutralize collagen
Distilled water (Sterile)			To neutralize collagen
pH indicator papers (6.0-8.1)	Whatman, GE Healthcare	2629-990	To check collagen pH
15 ml conical tubes	Dot Scientific, Inc.	818-PG
500 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	119-R100	To pipet collagen
DMEM/F12 medium	Sigma-Aldrich	D8437	Explant culture medium
ITS+1	Sigma-Aldrich	I2521	Medium supplement
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Medium supplement
CNTF (rat)	Sigma-Aldrich	C3835	Medium supplement
NT-3 (human)	Sigma-Aldrich	N1905	Medium supplement
Purified mouse Wnt5a	R&D Systems	645-WN-010
Affi-gel Blue gel beads	Bio-Rad	153-7302
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation
PBS			Rinses
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Blocking solution
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Blocking solution
Calf serum	Invitrogen	16170-078	Blocking solution
Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody	Sigma-Aldrich	T8535	Labels cell bodies and neurites
Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody	Invitrogen	A21141	Detects β Tubulin antibody
Teflon micro spatula	VWR international	57949-033	Release collagen gels from well