Dissektion og Kultur af Chick Statoacoustic Ganglion og rygmarven eksplanteret i Kollagen Gels for neurite udvækst Analyser

Summary

Vi viser, hvordan du dissekere og kultur chick E4 statoacoustic ganglion og E6 rygmarven eksplanteret. Eksplanteret dyrkes under serumfrit betingelser i 3D kollagen geler i 24 timer. Neurite lydhørhed er testet med vækstfaktor-suppleret medium og med protein-belagt perler.

Abstract

Den sanseorganer af kylling indre øre er innerveres af de perifere processer statoacoustic ganglion (SAG) neuroner. Sanseorgan innervation afhænger af en kombination af axon vejledning tidskoder ¹ og overlevelsesfaktorer ² placeret langs bane voksende axoner og / eller inden for deres sanseorgan mål. For eksempel genereret funktionel interferens med en klassisk Axon vejledning signalvejen, semaphorin-neuropilin, misrouting af eksotiske axoner ^3. Også flere vækstfaktorer til udtryk i den sensoriske mål i det indre øre, herunder neurotrophin-3 (NT-3) og Brain Afledte Neurotrope Factor (BDNF), er blevet manipuleret i transgene dyr, igen fører til misrouting af SAG axoner ^4. Disse samme molekyler fremme både overlevelse og neurite udvækst af chick SAG neuroner in vitro ^5,6.

Her vil vi beskrive og demonstrere in vitro-metode vi i øjeblikket usynge for at teste reaktionsevne chick SAG neurites til opløselige proteiner, herunder kendte morphogens som Wnts, samt vækstfaktorer, som er vigtige for at fremme SAG neurite udvækst og neuron overlevelse. Ved hjælp af denne model system, vi håber at kunne drage konklusioner om de virkninger, som udskilles ligander kan udøve på SAG neuron overlevelse og neurite udvækst.

SAG eksplanteret er dissekeret i embryonale dag 4 (E4) og kultiveret i tre-dimensionelle kollagen gel under serum-fri betingelser for 24 timer. Først er neurite reaktionsevne testet af dyrkning eksplanteret med protein-suppleret medium. Så, for at spørge, om punktkilder udskilles ligander kan have retningsbestemte effekter på neurite outgrowth, er eksplanteret co-kulturperler med protein-belagt perler og analyseret for evne til perle til lokalt at fremme eller hæmme udvækst. Vi har også omfatter en demonstration af dissektion (modificeret protokol ⁷⁾ og kultur E6 rygmarven eksplanteret. Virutinemæssigt bruger rygmarven eksplanteret at bekræfte bioaktivitet af proteiner og protein-gennemblødt perler, og at kontrollere arter krydsreaktivitet med chick væv, under den samme kultur betingelser som SAG eksplanteret. Disse in vitro assays er bekvemt for hurtig screening for molekyler, der udøver trofiske (overlevelse) eller Tropic (retningsbestemt) virkninger på SAG neuroner, især før udførelse af undersøgelser in vivo. Desuden er denne metode giver mulighed for afprøvning af enkelte molekyler under serumfrit betingelser med høj neuron overlevelse ^8.

Protocol

Opskrifter

Chick Ringers

7,2 g	NaCl
0,23 g	CaCl 2 + 2H 2 O
0,37 g	KCl
0,115 g	Na 2 HPO 4
900 ml	Vand (Vævskultur klasse)

Bemærk: Justér pH til 7,4. Bring endelige volumen til 1000 ml med vand.

10X PBS

40 g	NaCl
1 g	KCl
7 g	Na 2 HPO 4
1,2 g	KH 2 PO 4
450 ml	DEPC vand

Bemærk: Justér pH til 7,4. Bring endeligvolumen til 500 ml med vand. Brugskoncentration (1X), er lavet ved at fortynde 1 del 10X lager med 9 dele af cellekultur kvalitet vand, som den, der opnås med en Millipore UV-bestråling system til at generere vand med 18 MOhm-cm ledningsevne.

SAG eksplantation holde medium

• DMEM/F12 med L-glutamin, 10 mM HEPES
• 10% Insulin, Overførsel, Selen (ITS +1)
• 1% pen-STREP

Eksplantation dyrkningsmedium

• SAG eksplantation holde medium
• 10 ng / ml neurotrophin-3 (NT-3)
• 10 ng / ml ciliaere neurotrope faktor (CNTF)

Rygmarven dissektion og holde mellemstore

• L-15
• 10% føtalt kalveserum
• 1% pen-STREP

Inkuber æg på 37-38 ° C. Sterilisere dissekere værktøjer og Sylgard dissecting fad i 70% ethanol. Dissekere retter og værktøjer kan også UV steriliseres natten over.

1. Placer perler i en mikrorør med 1 ml steril PBS, mix, og vent på perler at bilægge til bunden af ​​røret.
2. Vask perlerne flere gange ved at fjerne supernatanten efter perlerne har bosat sig, og resuspenderes i PBS.
3. Inkubér perlerne i oprenset protein (fortyndet i PBS) eller PBS alene (Control) i 1 time ved stuetemperatur.
4. Skyl perlerne i PBS og opbevar det i en 24-brønds plade med 1 ml PBS, indtil placeret i collagen.

2. Statoacoustic ganglion dissektion

1. På E4 fjerne foster fra ægget og læg den i et fad med kylling Ringers opløsning til at fjerne embryonale membraner.
2. Placer embryo i et Sylgard © foret petriskål fyldt med kold HBSS og position embryoet på sin side med den eksotiske vesikel vender opad. Pin embryonet til fadet med dissekerende ben.
3. Ved hjælp af to dissekering ben, et vandret snit gøre gennem huden straks ventrale tilCanal poser, omtrent hvor den møder cochlear kanalen. Lav et lodret snit anterior og posterior til SAG. Brug pincet eller en dissekering pin til at løfte og fjerne flappen af ​​huden omgivet af de tre snit.

   Bemærk: SAG ligger i anteroventral kanten af ​​otocyst, omtrent midtvejs mellem den dorsale pose som er let synlige med brightfield basen belysning, og den ventrale Cochlear ventilationskanal hvilke projekter ventromedially og er skjult af de svælg buer. Cochlear ventilationskanal elongates så dens dorsoventral dimension stiger progressivt på E4 mellem Hamburger-Hamilton etaper 23-25 ​​september.

4. Træk otocyst i posterior retning for at adskille den fra SAG. Fortrænges væv omkring SAG med dissektion knappenåle og fjern forsigtigt SAG fra foster ved hjælp af # 55 pincet. Fjern store bidder af mesenchymale væv og udstående nerve bundter fra SAG.
5. Ved hjælp af en bred mund pipette spids, den eksplantation overførsel til et24-brønds plade med 0,5 ml SAG eksplantation holder medium. Hold eksplanteret på is eller ved stuetemperatur i op til 4 timer.

3. Rygmarven dissektion

1. Tag E6 foster fra ægget og læg den i en skål, der indeholder kylling Ringers opløsning. Fjern hovedet og embryonale membraner.
2. Placer kroppen i en Sylgard © dissekere skaal indeholdende koldt rygmarven dissektion medium. Placering og pin embryoet "ventrale ned" og caudal vender forsøgslederen. Placer dissekere knappenåle gennem hver legemsdel og gennem den forreste ende.
3. Brug pincet og / eller dissecting ben, fjern forsigtigt hud og væv, bevæger sig i en ventral retning, indtil den dorsale overflade af rygmarven er synlig.
4. Skær ryg midterlinjen i rygmarven med en dissekere pin, i en posterior til anterior retning, langs hele længden af ​​rygmarven. Dette skaber en "åben bog" som venstre og højre side af rygmarven adskilt.
5. Fjern rygmarven fra kroppen ved at holde caudale-meste ende af rygmarven med pincet og løfte op og væk fra forsøgslederen. Fjern resterende DRG og meninges.
6. Hold den ene ende af rygmarven med pincet (eller pin det til fadet) og bruge Vännäs saks til at skære langs den ventrale midterlinjen til bisect rygmarven.
7. Hold den ene ende af eksplantation med en pincet til at immobilisere væv og bruge Vännäs saks til at skære små eksplanteret (100-500 UM i længde) langs længden af ​​væv. En gulvplade kan blive anerkendt som en klar fortykkelse af væv langs den ene eksplantation kant.
8. Brug en bred mund pipette tip at overføre eksplanteret til en 24 brønds plade med 0,5 ml koldt dissektion medium. Hold eksplanteret på is for at bevare væv levedygtighed, feller op til 4 timer.

4. Eksplantation kultur med oprensede proteiner for at teste neurite lydhørhed

1. Forbered en 1,5 mg / ml kollagen opløsning i en 15 ml konisk rør, på is, i henhold til producentens anvisninger.
2. Kontroller kollagen opløsning har en pH-værdi på 7-7,4 ved hjælp af pH indikator papir. Justér pH-værdien ved at tilsætte NaOH i 1 ml mængder.
3. Overførsel eksplanteret til en 24-brønds plade ved hjælp af en bred mund pipette spids og aspirér overskydende væske. Flere eksplanteret kan dyrkes i en brønd, men bør placeres mindst 500 μm fra hinanden.
4. Tilsæt 0,5 ml af kollagen til brønden, der indeholder eksplantation. Placer eksplantation på bunden overfladen af ​​godt. Sørg for at indstille hver kultur helt, før du fortsætter med det næste vel, fordi collagen vil begynde at polymerisere ved stuetemperatur.
5. Placer kultur pladen på et 37 ° C slide varmere i 30-45 min til polymerisere kollagen. Når collagen er polymerized vil det ligne en gel.
6. Tilsæt 0,5 ml varm eksplantation kultur medium suppleret med enten oprensede proteiner (fortyndet i PBS) eller PBS (Control) og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO _2. Virkninger på neurite udvækst skal være synlig med 24 timer.

   BEMÆRK: Vi har brugt den samme protokol til kultur SAG eksplanteret op til 42 timer.

5. Eksplantation co-kultur med protein-belagt perler til at teste retningsbestemt neurite udvækst

1. Begynd med eksplantation kultur trin 4,1-4,4.
2. Ved hjælp af en pipette, 1-5 perler overførsel fra PBS til brønden, der indeholder kollagen løsning og eksplantation.
3. Brug pincet til at placere perlerne 50-500 μm fra kanten af ​​eksplantation.
4. Placer pladen på et 37 ° C slide varmere i 30-45 min til polymerisere kollagen. Det væv eller perle kan blive fortrængt som kollagen polymerizes. Kontroller kulturer og re-position i vævet og perler i løbet af de første 5 min.
5. Tilsæt 0,5 ml SAG medier til hver brønd og inkuberes i 24 timer.

6. Visualisering af neurite udvækst ved immunohistokemi

1. Skyl kulturer i PBS og løse i 1 time ved stuetemperatur i 4% paraformaldehyd i PBS.
2. Frigør geler fra væggene af brøndene ved at spore rundt om kanten af ​​geler med den afrundede ende af en teflon mikro spatel. Udfør immunostain med gel i brøndene. Skyl flere gange i PBS.
3. Inkuber i 0,5 ml blokerende opløsning (10% kalveserum, 0,1% Triton X-100, 0,1% natriumazid i PBS) natten over ved 4 ° C.
4. Inkuber i 0,5 ml primært antistof (anti-β-tubulin antistof fortyndes 1:500 med blokerende opløsning) natten over ved 4 ° C.
5. Skyl flere gange i PBS. Inkuber i 0,5 ml sekundært antistof (Alexa fluor 488 ged anti-mus IgG _2b antistof fortyndet 1:500) natten over ved 4 ° C. Fra dette skridt fremad, holde plader i mørke eller wrap i folie, på grund af lysfølsomhedsekundære antistoffer.
6. Skyl flere gange i PBS og opbevares ved 4 ° C i PBS i op til en uge.

7. Repræsentative resultater

Figur 1. Repræsentative resultater af neurite-fremmende effekter af renset NT-3 og NT-3-coatede perler på E4 chick SAG eksplanteret. SAG neuron celle organer og neurites var immunostained med β-tubulin og filmede med et 10x objektiv på en konfokal mikroskop. Efter 24 timer in vitro, vises SAG eksplanteret større neurite udvækst i overværelse af 100 ng / ml oprenset humant NT-3 tilføjet til cellekulturmedium (1B), sammenlignet med kontrolgruppen (1A). SAG neuroner var co-kulturperler med perler opblødt i 100 ng / ml, NT-3 til at vise, at et punkt kilde til NT-3 lokalt kan fremme neurite udvækst. Eksplanteret vises længere og tættere neurite udvækst på siden afeksplantation overfor perlen i forhold til den modsatte side (1D) og sammenlignet med kontrolgruppen kulturer med perler dyppet i PBS (1C). Skala bar = 200 μm.

Figur 2. Repræsentative resultater af neurite-fremmende effekter af renset Wnt5a og Wnt5a-belagt perler på E6 chick rygmarven. Rygmarven eksplanteret blev immunostained med β-tubulin og filmede med konfokal mikroskop. Efter 24 timers vækst i overværelse af renset musen Wnt5a (400ng/ml), neurite udvækst fra chick rygmarven eksplanteret blev forøget (2B) sammenlignet med kontrolgruppen kulturperler uden Wnt5a (2A). Perler dyppet i 500 ng / ml Wnt5a, placeret 300-500 μm fra kanten af ​​rygmarven eksplanteret, også promoveret neurite udvækst (2D) sammenlignet med kontrolgruppen kulturer (2C). Lignende co-kultur resultater blev tidligere udgivet med Wnt5a-udtrykkende celler ^8. Skala bar = 200μm.

Discussion

Vi præsenterer en metode til at dissekere og kultur E4 SAG og E6 rygmarven eksplanteret, fra chick, under serum-fri betingelser. Denne procedure er i øjeblikket anvendes i vores laboratorium for at studere effekten af ​​forskellige udskilles ligander på SAG neuron overlevelse og neurite udvækst. Nye aspekter af denne protokol omfatter brugen af ​​et serum-fri system til dyrkning eksplanteret og brug af perler vædet i vækstfaktorer for at studere virkningerne på SAG neurite udvækst. En perle metode magen til vores, der er beskrevet for de chick rygmarven ^10. Traditionelt har perler været anvendt i studier med klassiske Axon vejledning faktorer og morphogens. Her har vi vist, at perle-analysen også kan bruges til at undersøge virkningerne af neurotrophins (eller andre vækstfaktorer) på neurite udvækst (fig. 1).

Der er kritiske skridt i den procedure, som muligvis skal ændres eller optimeret til forskellige anvendelser. Disse skridt er også vigtige variabler for trouble-skydning forsøg, der synes at være forgæves. Først neurotrophin-3 (NT-3), ciliaere Neurotrope faktor (CNTF) og ITS (Insulin, transferrin, selen) blev tilføjet til dyrkningsmediet at fremme SAG neuron overlevelse og forbedre neurite udvækst ^6,8. Disse vækstfaktorer er inkluderet i rygmarven eksperimenter for at teste bioaktivitet af molekyler under de samme assay betingelser, at SAG eksplanteret blev testet. Dog kan andre vækstfaktorer være mere passende for disse og andre vævstyper. For det andet var en 1,5 mg / ml koncentration af kollagen valgt efter teste en række af kollagen koncentrationer (0,5, 1,0, 1,5 og 2 mg / ml), fordi det er produceret de mest robuste neurite udvækst fra E4 kyllingen SAG efter 24 timer. Andre kilder af neuroner kan vise en anden optimal af kollagen. Endelig bør det protein koncentrationer, antallet af perler, og afstanden mellem eksplanteret og perler også være optimeret til hver enkelt ansøgning. Nogle vækst kendsgerningyderste periferi, som f.eks morphogens, er udtrykt i farveforløb og udøve koncentrationsafhængig effekter på vækst axoner under udvikling ^11. Derfor bør en række koncentrationer altid testes med neurite udvækst analyser. Der bør udvises forsigtighed for at undgå toksicitet: vi har observeret forhøjede niveauer af celledød med høje koncentrationer af nogle proteiner (f.eks, Sonic pindsvin).

Denne metode kan tilpasses til yderligere applikationer, herunder andre aldre, vævstyper, co-kultur metoder, og yderligere immunfarvning (f.eks, celleoverlevelse assays). Vi har med succes dyrket E3-E5 SAG, E6 nethinden, og E7 lugtekolben eksplanteret, fra chick, med de samme dyrkningsbetingelser. Når udvækst er robust i kontrolprøver, kan denne metode også afsløre frastødende reaktioner på udskilles faktorer. Lignende metoder blev anvendt til at teste effekten af morphogens på pattedyr neuroner ^12,13, og vi undersøger i øjeblikket effekten af BMPs, FGFs og Sht på SAG neurite udvækst. Også, da den kollagen gel polymeriseret i et 24-brønds plade, de er store nok til senere indlejring og sektionering med en kryostat. Vi rutinemæssigt udfører Tunel analyser om cryosections af kollagen gel kulturer, hvilket gør os i stand til at korrelere det niveau af cellernes overlevelse med mængden af neurite udvækst fra den samme prøve ^8.

Der er begrænsninger ved hjælp af kollagen gel analyser på den måde, vi har præsenteret dem her. For eksempel kan respons observeret i det bevidst forenklede in vitro miljø afspejler ikke svar på den samme faktor, når de findes i de mere komplekse in vivo situation. Samt, kan vi ikke skelne perifere fra det centrale processer og kan ikke skelne auditive fra vestibulær neurites. Derfor kunne heterogenitet i lydhørhed blandt disse patientgrupper give uregelmæssig eller ikke-uniform outgrowth eller, hvis det reagerer befolkningen er en lille brøkdel aftotalen, kan ganglion blive scoret som ikke viser effekt. Endelig har vi præsenteret en metode, der kan bruges til kultur E4 SAG eksplanteret under serumfrit betingelser med betydelig neuron overlevelse, med en bred vifte af applikationer fra at studere celle overlevelse til Axon vejledning. Alt i alt, dette system er gavnligt, fordi det tillader en at overvåge effekter som følge af tilsætning af renset faktorer alene eller i kombinationer uden forstyrrende variabler af andre udskilles faktorer og Axon vejledning tidskoder, der kan være til stede i in vivo miljø.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope			We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination
Slide warmer	C.S. E.		Collagen polymerization
Chicken egg incubator
37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator
Sylgard© coated petri dish
24-well cell culture plate	Corning	3526
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55 Dumont forceps	Fine Science Tools	11295-51
Stainless steel dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10	Embryo pinning, fine dissection
Moria perforated spoon	Fine Science Tools	10370-17	Embryo harvest/transfer
200 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	118-96R	Explant transfer
E4 and E6 chicken eggs
Chick Ringer’s solution			Embryo harvest
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	SAG dissection
L15 medium	Sigma-Aldrich	L5520	Spinal cord dissection medium
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11150	Spinal cord dissection medium
Vannas Scissors	World Precision Instruments, Inc.	501778	Spinal cord dissection
Rat-tail collagen Type I	BD Biosciences	354249	Explant culture
10X PBS (Sterile)			To neutralize collagen
1N NaOH (Sterile)			To neutralize collagen
Distilled water (Sterile)			To neutralize collagen
pH indicator papers (6.0-8.1)	Whatman, GE Healthcare	2629-990	To check collagen pH
15 ml conical tubes	Dot Scientific, Inc.	818-PG
500 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	119-R100	To pipet collagen
DMEM/F12 medium	Sigma-Aldrich	D8437	Explant culture medium
ITS+1	Sigma-Aldrich	I2521	Medium supplement
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Medium supplement
CNTF (rat)	Sigma-Aldrich	C3835	Medium supplement
NT-3 (human)	Sigma-Aldrich	N1905	Medium supplement
Purified mouse Wnt5a	R&D Systems	645-WN-010
Affi-gel Blue gel beads	Bio-Rad	153-7302
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation
PBS			Rinses
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Blocking solution
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Blocking solution
Calf serum	Invitrogen	16170-078	Blocking solution
Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody	Sigma-Aldrich	T8535	Labels cell bodies and neurites
Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody	Invitrogen	A21141	Detects β Tubulin antibody
Teflon micro spatula	VWR international	57949-033	Release collagen gels from well