Summary
דג הזברה מהווה מודל חשוב ללמוד את מנגנוני התחדשות לב אצל בעלי חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אינדוקציה של אוטם לב דג הזברה למבוגרים באמצעות cryoinjury. שיטה זו גורמת מוות של תאים מסיבית של 20% קיר החדר, בדומה לזו שנצפתה אוטמים יונקים.
Abstract
לב היונקים אינו מסוגל התחדשות משמעותית בעקבות פציעה אקוטית כגון אוטם שריר הלב 1. לעומת זאת, urodele דו חיים ודגים teleost לשמור על היכולת המדהימה של התחדשות לב עם מעט או ללא צלקות לאורך כל החיים 2,3. לא ידוע מדוע רק כמה חוליות שאינם יונקים יכולים לשחזר את איבר שלם מרקמות שריד 4.5. כדי להבין את ההבדלים מולקולרית תאית בין התגובות רגנרציה במינים שונים, אנחנו צריכים להשתמש גישות דומות עבור גרימת פציעות חריפה.
אצל יונקים, המודל השכיח ביותר ללמוד תיקון הלב כבר איסכמיה חריפה לאחר קשירת העורק הכלילי או הרס רקמות לאחר cryoinjury 6,7. התחדשות לב ב הסלמנדרות ו דג הזברה נחקרה בעיקר לאחר כריתה חלקית של החדר איפקס 2,3. לאחרונה, מספר קבוצות יש established טכניקה cryoinjury ב 8-10 דג הזברה בוגרים. לשיטה זו פוטנציאל גדול, כי זה מאפשר דיון השוואתי של תוצאות שהתקבלו מיני יונקים ולא יונקים.
כאן, אנו מציגים שיטה לגרום האוטם לשחזור בצורת דיסק של החדר על ידי דג הזברה cryoinjury. מודל זה מבוסס על פגיעה ברקמות הקפאה, הפשרה מהירה, שתוצאתה מוות של תאים מסיבית של 20% cardiomyocytes של קיר החדר. ראשית, חתך קטן נעשה דרך החזה עם מספריים iridectomy לגשת לב. קיר החדר היה קפוא ישירות על ידי יישום של 23-25 שניות cryoprobe נירוסטה precooled בחנקן נוזלי. כדי להפסיק את הקפאת המים, הלב דגים בטמפרטורת החדר הושלכה על קצה cryoprobe. הליך זה נסבל היטב על ידי בעלי חיים, עם שיעור הישרדות של 95%.
כדי לאפיין את תהליך ההתחדשות, לבבות היואסף קבועה בימים שונים לאחר cryoinjury. לאחר מכן הדגימה היו מוטבעים על cryosectioning. שקופיות עם חלקים עובדו לניתוח היסטולוגית, על ההכלאה immunofluorescence באתרו. התחייבות זו משפר את הבנתנו את הגורמים הנדרשים הפלסטיות רגנרטיבית של דג הזברה, ולספק תובנות חדשות על מכונות של התחדשות הלב. הבנה רעיונית המולקולרי של התחדשות לב דג הזברה תשפיע גם בביולוגיה התפתחותית ורפואה רגנרטיבית.
Protocol
1. ציוד Set-up
- הכלי העיקרי המשמש לביצוע cryoinjury הוא cryoprobe, מכשיר עט כזה עשוי נירוסטה (איור 1 א). ידית גלילי הוא 40 מ"מ ארוך בעל קוטר של 8 מ"מ. קצה המוליך הוא 6 מ"מ אורך ו 0.8 מ"מ בקוטר. צומת בין עצה לבין האחיזה הוא חרוטי 4 מ"מ ארוכים. בנוסף, ידית cryoprobe צריך להיות מבודד עם צינור סרט פלסטיק כדי למנוע כוויות קור על האצבעות תוך כדי לחיצה על הכלי במהלך ההליך.
- חומרים אחרים שצריכים בהקפאה הם סטראו, מלקחיים חדות, מיקרו מספריים האביב הניתוח, פיפטה העברת פלסטיק. בנוסף להכין כוס של anesthetizing דגים כפית פלסטיק להעברת דגים.
- במהלך הניתוח, דגים ממוקמות על ספוג לח עם למעלה בצד הגחון שלו (1B איור). להחזיק את החיה בהליך יציבה,חריץ המתאים יש לחתוך באופן ידני ספוג.
- הכן מיכל מים עם מערכת להעביר את הדג לאחר הניתוח.
- הגדרת טיימר כפול 1 עם ספירה לאחור 2 10 ולאחר מכן באופן אוטומטי הספירה לאחור 24 2.
2. נוהל Cryoinjury
- לצנן את cryoprobe ידי טבילה עצה 3-5 ס"מ של חנקן נוזלי דקות לפחות 3.
- להרדים דג הזברה למבוגרים ידי immerging אותו tricaine 0.02% עד שהדג הופך על הגב שלה הזימים שלו כמעט להפסיק לנוע (כ -90 שניות).
- מעבירים את הדג עם כפית פלסטיק ספוג לח כי נחתך להחזיק דג הפוך (1B איור). להחזיק דגים יציבה עם מלקחיים באמצעות הלא דומיננטית יד. מבחינה חזותית לאתר את שולי המדיאלי האחורי של הלב ולהשתמש מספריים iridectomy ישרים לנקב את העור. (איור 1 ג).
- לעשות חתך קטן (כ 2 מ"מ) מעל הלב על ידי מ"קtting ישר anteriorly דרך העור, השרירים (איור 1D). לא לחתוך את המנגנון branchial גרמית, כמו זה יהרוג את בעל החיים.
- קורעים בעדינות את שכבת האפיתל כסוף של ובהיפודרמיס (איור 1E) עם קצה המספריים יש גישה ישירה אל החדר הפועם. אל תכניס את המספריים עמוק בתוך חלל הגוף, כמו לנקב את רצון הלב. הלב הפועם צריך להיות גלוי היטב, ולא דימום נרחב צריך להתרחש במהלך פתיחת בית החזה (איור 1F).
- להפעיל את הטיימר מתוכנת כך נקבע למשך 10 שניות ולאחריה 24 שניות. במהלך 10 שניות להוציא את cryoprobe מ חנקן נוזלי. ודא כי אין חנקן יותר cryoprobe ידי ניעור אותו בעדינות. מורחים את החתך רוחבית באמצעות מלקחיים כדי לפתוח את בית החזה (איור 1F).
- לאחר טיימר טבעות 10 שניות, אבל מיד לגעת בעדינות עם קצה החדר של יחסי ציבורדואר מקורר cryoprobe (איור 1G).
- פעם אחת הטבעות טיימר 24 שניות, יוצקים 2-3 מ"ל מים באמצעות מערכת טפטפת פלסטיק על החזה כדי לשחרר את cryoprobe מרקמות, ולהעביר את הדג לתוך מיכל עם מים במערכת.
- הדג צריך להפעיל מחדש את הנשימה לאחר כמה שניות, ואז הוא צריך לחדש את השחייה. אם זה לא לנשום לאחר כ 45 שניות, לעורר את בעלי החיים על ידי התזת מים אל הזימים עם טפטפת פלסטיק עד שהוא מתחיל לנשום בכוחות עצמו. מניסיוננו, 95% של הדג לשרוד ניתוח, מקרי מוות מתרחשים כל יום של הניתוח. זה לא יהיה צורך לתפור חתכים.
3. הלב איסוף קיבוע
- הכן 1 מ"ל של 2% פורמלין בצינור microcentrifuge לתיקון הלב, שני מלקחיים, מיקרו המבתרים מספריים מחוררת ספוג לח.
- בכל יום נבחר לאחר cryoinjury, להרדים את הדגים tricaine 0.1% במשך 5 דקות.
- מניחים אתדגים הצד הגחוני לתוך ספוג לח מחוררת. לעשות חתך גדול (כ 4 מ"מ) מעל הלב באמצעות סחוס branchial עם מספריים המבתרים מיקרו. פתח נרחב חתך עם מלקחיים (איור 1H).
- לצבוט את bulbus arteriosus, מבנה לבן הקדמי אל החדר (איור 1 HI), ולהסיר את הלב מתוך חלל ידי משיכתו. הלב גזור כולו מוצג 1J תרשים ו -2 איור.
- להציב עד 3 לבבות לתוך צינור microcentrifuge עם 1 מ"ל של 2% פורמלין. בעדינות להפוך את הצינור כמה פעמים לשמור את זה בן לילה ב 4 ° C.
4. הלב הרכבה
- יש לשטוף את ליבם של PBS במשך 5 דקות. מעבירים את הלבבות לתוך 10 מ"ל של סוכרוז 30% כי יש מראש מקורר ב 4 ° C, ומערבבים בעדינות. הדגימה צריכה בתחילה לצוף על פני השטח של פתרון סוכרוז. המשך הדגירה של 1 שעה 20 דקות ב 4 ° C. לאחרהפעם, לבבות ישקע לתחתית הצינור.
- להכין קופסה עם קרח יבש. קח עובש הטבעה, ויוצקים שכבה 5 מ"מ של המדיום אוקטובר גובר בתחתית התבנית.
- עם מלקחיים לשים לב אל T OC הרכבה בינונית בתבנית. תחת סטראו, לשנות את הכיוון של הדגימה להשיג איפקס חדרית בתחתית התבנית, ואת bulbus arteriosus כלפי מעלה.
- מניחים את התבניות עם טיפוס על קרח יבש. כאשר הבינוני גובר מתחיל לקפוא, ממלאים את שאר התבנית עם המדיום אוקטובר ולתת לו לקפוא לחלוטין. שמור את התבנית עבור שעות לפחות 1 ב -80 ° C עד אחד בלבד. הדגימה קפוא יכול להיות מאוחסן במשך חודשים רבים ב -80 ° C.
5. לבבות חתך
- הגדרת cryostat עם גודל חיתוך של 16 מיקרומטר, טמפרטורת החדר של -24 ° C, הטמפרטורה של הדגימה ב -22 ° C.
- מניחים את גוש קפוא עםהדגימה ב cryostat ולתקן האוריינטציה שלו להתחיל לחתוך במקביל התחתון של הבלוק.
- להכין שש Superfrost פלוס שקופיות בלוק אחד למנות אותם 1-6. להתחיל לחתוך עד לרקמה הוא הגיע, וגם לקצץ את הבלוק סביב הדגימה עם גילוח.
- כדי להשיג 6 משכפל לב אחד, לקחת את החלק הראשון בשקופית 1, סעיף 2 בשקופית 2, 3 על שקופית 3, וכו 'ברגע שאתה שם את סעיף 6 בשקופית 6, הפעל מחדש עם שקופית 1 וממשיכים עד כל איבר הוא חתך. איסוף שתי שורות של כ 8 קטעים בשקופית (איור 3).
- בואו השקופיות יבש לשעה 1 בטמפרטורת החדר. לאחסן אותם לתקופה של עד 1 שנה בקופסאות סגורות היטב ב -20 ° C.
6. נציג תוצאות
פגיעה לב נציג בעקבות פרוטוקול זה מוצג בלב שלם גזור ב 4 dpci (cryoinjury ימים הודעה, איור 2 ד-F). כדי Visualize רקמת שריר הלב in vivo, השתמשנו דג מהונדס המבטא EGFP ו DsRed2 גרעינית תחת שליטה של האמרגן cmlc-2 לב ספציפית 11,12. העדר EGFP ו DsRed2 אותות ניאון התחום אזור בצורת דיסק האוטם לאורך הקיר הפסגה, לרוחב החדר.
כדי לבצע ניתוחים תאית ומולקולרית של רקמה, לבבות היו קבועים מחולק עם cryostat. שקופית עם נציג סדרה רצופה של חלקים לב רחבי מוצגת באיור 3.
הסעיפים ניתן לנתח בשיטות שונות (איור 4). כדי לקבוע את מידת ההתחדשות לב לעומת צלקות, ביצענו ניתוח היסטולוגית באמצעות חומצה Fuchsin Orange-G (AFOG) מכתים, אשר באופן דיפרנציאלי תוויות רקמות הלב ואת fibrotic 9. הביטוי ניתוחים גנים הושגו לפי בהליך הכלאה באתרו
באיור 1. גרימת cryoinjury של החדר של דג הזברה הבוגרת. (א) תצלום של cryoprobe. (ב) דג הזברה מבוגר ממוקם חריץ של ספוג עם הצד שלה עד הגחון. (CF) חזה חתך לגשת לב. (C) חתך קטן דרך העור והשרירים נעשית בין שני סנפירי החזה (קו אדום). (ד) המספריים מוכנסים לתוך חתך לחתוך את העור בעקבות החץ האדום. (ה) מתחת לעור, שכבה דקה של ובהיפודרמיס כסוף (מוקף בקו מקווקו כחול) נפתח בעדינות לגשת לב. (ו) חתך מתפשטת עםמלקחיים ואת החדר הפועם (ירוק חץ) נגיש cryoinjury. (ז) cryoprobe קר מוכנס בעדינות לתוך החזה לגעת בלב. (HJ) אוסף הלב. (ג) חתך עמוק וארוך נעשית דרך קשתות branchial של החזה כדי לגשת חלל קרום הלב. שני מבנים לב גלויים: bulbus arteriosus (החץ הלבן) ואת החדר (חץ ירוק). (אני) arteriosus bulbus הוא מחזיק עם מלקחיים והוציא מתוך חלל הגוף. (י) לב שלם הוא נכרת מן הגוף.
איור 2. השליטה ייצוגית לבבות cryoinjured גזור מן דג הזברה מהונדס למבוגרים להביע EGFP ו DsRed2 הגרעיני cardiomyocytes. (AC) וללא כל פגע לב. (A) תאורה שדה כהה מראה החדר (V), bulbus arteriosus (Ba, לבן) ואת השסתומים (VA), שם אטריום היתה קשורה החדר. (B ו-C) תמונות של פלורסנט לא הוא החדר ללא שינוי התצוגה EGFP ו DsRed2 ביטוי cardiomyocytes. (DF) לב בבית cryoinjury 4 ימים הודעה (4 dpci) (ד) תאורה שדה כהה חושף האוטם בצורת דיסק (קו מקווקו צהוב). (EF) סמנים Cardiomyocyte EGFP ו DsRed2 לא מזוהים באזור האוטם, המציין את שריר הלב הפגוע (מוקף בקו מקווקו).
איור 3. חתך של הלב. (א ') בלב שלם עם ציור של חלקים חותך החל מקרב לב (1 ו 2, באדום) לכיוון החלק העליון של הלב (3 ו 4 בירוק). (ב) צילום של שקופית עם סדרה של קטעים עוקבים רחבי מוכתמים AFOG (חומצה Fuchsin Orange-G). הסעיפים הראשונים (1 ו 2, ריבועים אדומים) מכילים איפקס החדר, ואת הקטעים האחרונים של לב (3 ו 4, ריבועים ירוקים) מהווים bulbus arteriosus.
iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg "/>
באיור 4. דוגמאות של ניתוח המבוצע על סעיפים לב ב cryoinjury 7 ימים לתגובה. (א) AFOG (חומצה Fuchsin אורנג'-G) מדבקות צביעה בריאים שרירים תאים כתום, רקמה צלקתית המכיל קולגן בכחול הפיברין באדום. (ב) הכלאה באתרו של רשת חדרי שרירן כבד (vmhc) mRNA מדמיין שריר הלב ללא שינוי (כתמים כחולים). את הרקמות הפגועות נטול תעתיק הגן לב (קו מקווקו אדום). (ג) Immunoassaying של tropomyosin (ירוק) תוויות cardiomyocytes שלמים ולא רקמות פגועות (מוקף בקו מקווקו). DAPI (כחול) כתמים גרעינים של כל התאים. (ד) cardiomyocytes שכותרתו גנטית אקספרס DsRed2 (אדום) בגרעין שלהם. DAPI (כחול) מכנה את כל הגרעינים. אזור האוטם אינו מכיל DsRed2 חיובי תאים (קו מקווקו לבן).
Discussion
Cryoinjury מוגדר נזק מבוקר של רקמה על ידי יישום מדויק של 14 קור קיצוניים. הלם תרמי ישירה הורסת את התאים על ידי הרס החלבון ועל ידי קרח תאיים היווצרות גבישים נוזלים כי נקרע קרום הפלזמה. כתוצאה מכך, התאים הפצועים למות תהליכי אפופטוזיס ונמק 14. שני אלה מנגנוני מוות של תאים הוכחו לתרום אובדן רקמות לאחר אוטם שריר הלב 15. לכן, cryoinjury מייצג מודל מתאים של גרימת אוטם שריר הלב. מספר מחקרים דיווחו על שיטה זו הוכיחה גם אצל יונקים שונים, כולל עכברים, חולדות, ארנבות וחזירים 6,7. עיבוד של פרוטוקול cryoinjury של דג הזברה מאפשר דיון השוואתי נוסף על התגובה האוטם בין מינים שונים.
שתי קבוצות אחרות פיתחו באופן עצמאי את ההליך cryoinjury ללב דג הזברה מבוגר. ההבדלים העיקריים הם סורגרי שיטות, סוג של כלי וזמן הקפאה שימושית. במחקר ידי רוזה גונזלס, et al., קרום הלב נפתח על ידי קריעת רקמות במקום חיתוך. הם השתמשו נחושת 0.3 מ"מ חוט קשור צינור פוליאמיד מראש מקורר בחנקן נוזלי להקפיא את הלב של שניות עד הפשרת יכול להיבחן 10. במחקר של שנאבל et al., פיסת חרוטי קרח יבש באורך 20 מ"מ עם קצה מחודד של 2 מ"מ בקוטר שלה שימש לגעת בלב למשך 10 שניות 8. שתי הקבוצות השיגו נזק חדרית דרך מותו של שריר הלב. היתרון של השיטה שלנו היא בתצהיר לשחזור יותר צלקת קולגן עשיר, אשר מחקה יותר טוב את הריפוי המוקדמות האוטם התגובות שנצפו מערכות יונקים.
צעד קריטי במהלך ההליך cryoinjury על דג הזברה הוא עושה חתך דרך העור ואת שק קרום הלב, ללא ניקוב הלב הבסיסית. Performe נכוןניתוח ד גורמת לדימום קטן. דימום פזרני מציין לנקב לא מכוונת של החדר עם המספריים. במקרים כאלה, בעלי החיים יש חזר בו מן הניסוי. כדי למנוע ניקוב הלב, הצבע מספריים צריך להיות מכוון בזווית שטוחה על העור.
היבט חשוב נוסף ליצירת פגיעה לשחזור הוא המיקום המדויק של cryoprobe קרים על החדר למשך מדויקת אופטימלית. זמן הקפאה קצר מדי תגרום לדלקת עם מוות של תאים קטן. הקפאה ממושכת, לעומת זאת, עלול לגרום נזק רב של הלב, דבר שעלול להוביל לתמותה מוגברת של בעלי החיים. קבענו כי הזמן האופטימלי להחזיק את החדר בטווחים המדינה קפואים בין 23-26 שניות על דג הזברה 2 ס"מ מבוגר, והוא עשוי להיות שונה dependently על גודל של בעלי החיים.
כי בפרוטוקול שלנו היא מאוד פשוטה ומהירה, אין גבול הניסיוניations ב העמדת מספר מספיק של בעלי חיים להשיג משוכפלים ביולוגיים מתאימים. טיפול cryosurgical נסבל היטב על ידי בעלי החיים. אוסף של לבבות בנקודות זמן שונות לאחר cryoinjury מאפשר אפיון מפורט של השלבים הבאים בתהליך ההתחדשות. ניתוח ניסיוני של לבבות cryoinjured עשויים לכלול 1) ויזואליזציה של שעתוק הגנים על ידי הכלאה ב באתרו, 2) זיהוי של חלבון על ידי חלוקת מכתים immunofluorescent, 3) הדמיה היסטולוגית של מבנים שונים. הבנת תהליכי ריפוי מפתח לאחר אוטם שריר הלב על דג הזברה ישפיע על תחום הביולוגיה רגנרטיבית. יתר על כן, זה יכול להיות מועיל עבור תכנון גישות טיפוליות חדשניות ברפואה רגנרטיבית.
Disclosures
ניסוי על בעלי חיים אושרה על ידי משרד וטרינרי הקנטון של פרייבורג.
Acknowledgments
אנו מודים ו 'צימרמן לקבלת סיוע טכני מעולה לטיפול דגים. עבודה זו נתמכה על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע, מענק מספר: 310000_120611.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds - Truncated Molds T8 | Polysciences, Inc. | 18985 |
References
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Singh, B. N., Koyano-Nakagawa, N., Garry, J. P., Weaver, C. V. Heart of newt: a recipe for regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 3, 397-409 (2010).
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).
- Ausoni, S., Sartore, S. From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration. J. Cell Biol. 184, 357-364 (2009).
- Borchardt, T., Braun, T. Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems: what are the differences between newts and man. Thrombosis and haemostasis. 98, 311-318 (2007).
- Bos, E. J. vanden, Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289, H1291-H1300 (2005).
- van Amerongen, M. J., Harmsen, M. C., Petersen, A. H., Popa, E. R., van Luyn, M. J. Cryoinjury: a model of myocardial regeneration. Cardiovasc. Pathol. 17, 23-31 (2008).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS ONE. 6, (2011).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
- González-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Rottbauer, W. Reptin and pontin antagonistically regulate heart growth in zebrafish embryos. Cell. 111, 661-672 (2002).
- Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
- Chablais, F., Jazwinska, A. IGF signaling between blastema and wound epidermis is required for fin regeneration. Development. 137, 871-879 (2010).
- Baust, J. G., Gage, A. A.
- Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annual review of physiology. 72, 19-44 (2010).
