Forberedelse Individual Drosophila Egg Chambers til Live Imaging

Summary

Den

Abstract

Levende celler billeddannelse er en vigtig teknik anvendes på en række Drosophila væv, der anvendes som modeller til at undersøge emner såsom akse specifikation, celledifferentiering og organogenese ^1. Korrekt forberedelse af de eksperimentelle prøver er en vigtig, ofte overset, trin. Målet for præparat er at sikre fysiologiske relevans og etablere optimale billeddannelse betingelser. For at opretholde vævslevedygtighed, er det vigtigt at undgå dehydrering, hypoxi, overophedning eller medium forringelse ^2.

Den Drosophila æg Kammeret er et veletableret system for behandlingen af spørgsmål vedrørende, men ikke begrænset til kroppen mønster, mRNA lokalisering og cytoskeletal organisation ^3,4. For tidlig-og midt-fase æg kamre, er stigende i Halocarbon oil god for at overleve i, at det tillader fri diffusion af ilt, forhindrer dehydrering og hypoxi og har fremragende optiske egenskaber til mikroskopi. Imældning af fluorescerende proteiner er mulig ved at indføre transgener ind i ægget kammer eller fysisk injektion af mærket RNA, protein eller antistoffer ^5-7. For eksempel kan tilsætning af MS2-konstruktioner til genomet af dyr tidstro overvågning af mRNA'er i oocytten ^8. Disse konstruktioner muliggør in vivo mærkning af mRNA ved anvendelse af MS2 bakteriofag RNA-stilken sløjfe interaktion med kappeprotein ^9.

Her præsenterer vi en protokol til udvinding af æggestokkene samt isolering af individuelle ovarioles og æg kamre fra den kvindelige Drosophila. For en detaljeret beskrivelse af Drosophila oogenesen See Allan C. Spradling (1993, genoptrykt 2009) ^10.

Protocol

1. Drosophila forberedelse forud for dissektion (Ifølge E. Gavis, Princeton University)

1. Kassér de voksne fra et tyndt seedet flaske og overføre flasken til 25 ° C forud for dit eksperiment. Når nye voksne er begyndt at dukke op, vente to dage.
2. Tag en flue hætteglas indeholdende ca 10 ml af fast føde og tilsæt 0,5-0,7 gram tørgær (se tabel) på en 45 graders vinkel. Må ikke dække hele overfladen af ​​flyve mad med gær.
3. Tilsættes nogle få dråber vand til gær, er tilstrækkelig til at hydratisere (figur 1A). Placere hætteglasset ved 45 grader og tillade omkring 3 minutter for gær at opsuge vand (figur 1B).

Bemærk: Alternativt forblanding en gær indsætte i en separat beholder og tilsæt pastaen til hætteglasset med en spatel.

4. Bedøve fluerne i hætteglasset ved at injicere CO _2-gas. Når de holder op med at flytte, tip ubevidste fluerne på CO ₂
5. Isoler 10-15 hunner og 5 hanner af den ønskede genotype under et dissektionsmikroskop med en fin spids pensel (Figur 1D). Hanner er indlysende ved tilstedeværelsen af ​​claspers, en mørk fremspringende struktur ved deres bageste.
6. Tilføj udvalgte fluer til yeasted hætteglasset (Figur 1E). Sted ved 25 ° C i 24-60 timer. Inkuber i kortere perioder for en større procent af unge til midten af ​​fase æg kamre og længere perioder for sene stadier af æg kamre.

2. Drosophila ovarie dissektion

1. Placere en lille dråbe Halocarbon oil på en nr. 1,5, 22 x 50 mm dækglas (figur 2A). Indstilles fremstillede dækglasset på den side, hvor det ikke vil være i vejen.
2. Anesthetize fluerne i yeasted modbydelige ved at injicere CO _2-gas og drikkepenge på en CO _2-pad.
3. Brug skarpe fin-nosed pincet til at gribe en individuel opfedes kvindelig på den forreste del af maven (ikke mellem the underliv og thorax) (fig. 2B-C).
4. Holde den kvindelige med pincet og vist under et dissektionsmikroskop, ca 2-3 cm over fremstillede dækglas.
5. Stadig holder ved den forreste, anvendes et andet sæt af pincet for at fjerne væv ved ekstreme bageste af den kvindelige (fig. 2D). Bemærk: Gut væv vil normalt trække ud med den bageste ende. Tør det fjernede væv fra tangen.
6. Mens han stadig holder det kvindelige i den forreste, skal du bruge udslettet pincet til forsigtigt at klemme eller massere maven, arbejder fra den forreste mod bagdelen. Massere maven på samme måde som fjerner tandpasta fra enden af ​​et rør.
7. To store uigennemsigtige strukturer vil blive skubbet fra maven og holde på enden af ​​tangen (fig. 2E-F). Disse er de parrede ovarierne.
8. Tryk æggestokkene på Halocarbon oil på diaset nedenfor.
9. Gentage dissektion 1-2 gange til opnåelse af i alt 4-6 ovarier i olien på dækglas (Figure 2G).

3. Isolering ovarioles

Bemærk: Hver ovarie indeholder ca 16 ovarioles bestående af 6 til 10 æg kamre forskellige anbragt som perler på en snor ^10.

Bemærk: Før isolere ovarioles, justere lyskilden på dissektionsmikroskop således at belysningen rammer i en flad vinkel i forhold til prøven. Dette giver modsætning til prøven og tillader visualisering af unge trin æg kamre.

1. I olien, adskille de to æggestokke ved at fjerne det forbindende væv ved den bageste ende (gamle trin) med lukkede pincet (figur 3A).
2. Orientere et individ ovarie med de ældste trin til venstre og yngste trin til højre. De unge trin æg kamre i ovariet er transparente og danne mere spidse ende af ovariet.
3. Med et par tænger i den dominerende hånd gribe forsigtigt bageste af et ovarie, fortrinsvis ved resterne af the bindevæv. Mens du holder æggestokkene på plads med pincet, bruge en dissekere sonde (eller wolfram nål) til at drille ud af de enkelte ovarioles (fig. 3B-D).

Bemærk: Individuelle ovarioles vil bryde mellem de unge stadier (germarium at iscenesætte 10) som de ældre stadier er for store til at være adskilt fra den fulde æggestok.

Bemærk: at punktere en sen fase oocyt med dissektionsmikroskop proben vil resultere i cytoplasmaet siver ind i olien og lav udvinding af individuelle ovarioles meget udfordrende. Hvis et sent stadium oocyt er punkteret, flytte til en frisk æggestok.

4. Når ovariole er fri i æggestokkene, skal du bruge dissekere sonden at trække den til midten af ​​olie faldet og orientere i den ønskede retning for eksperimentet. Bemærk: Ovarioles i olie vil falde, og klæbe til glasset.
5. Gentag denne proces (3,3-3,4), indtil der er 15-25 individuelle ovarioles. Bemærk: Dette kan kræve dissektion af multiple æggestokke. Hele processen tager mindre end 15 minutter.

Bemærk: Det er tilrådeligt at dissekere en æggestok hver fra flere fluer i stedet for dissekere begge æggestokke fra færre fluer til at øge antallet n af fluer til eksperimentet.

Bemærk: Hård behandling af ovariole vil resultere i usunde oocytter og kan føre til fejl i eksperimentet.

Bemærk: Oocytter vil begynde at vise fænotypiske ændringer som følge af stress 40 minutter efter blev dissekeret fra ovariet (sammenlign figur 7E til F).

6. Når ovarioles befinder sig i en tilstrækkelig orientering (figur 3E), skal du bruge dissekere sonden og lukkede pincet til at flytte overskydende ovarievævet ud af olien. Dette materiale kan tørres af tang på et stykke køkkenrulle.

4. Isolering af de enkelte sene stadier af æg kamre (Ifølge E. Gavis, Princeton University)

1. Med et par tænger i dominant hånd fat i bageste af en isoleret æggestok, fortrinsvis ved resterne af bindevæv. Mens man holder ovariet på plads med pincet, indføre dissekere sonden i den bageste ende af ovariet nær tangen (figur 4A). Undgå at punktere eventuelle æg kamre ved at indsætte sonden mellem sene stadier af æg kamre.
2. Træk dissektionsnål gennem ovariet, indtil det kommer ud på det tidlige tidspunkt æg kamre (figur 4b). Når det gøres korrekt, vil sonden fjerne bindevævet holde ovarioles og sene stadier af æg kamre på plads.
3. Gentag trin 4,2 indtil ovarioles er spredt ud på dækglasset. Bemærk: Når æg kamre ikke længere stablet oven på hinanden, er dette trin er fuldført.
4. Ved hjælp af dissekering proben slutningen oocytterne separere at tillade nem billeddannelse (fig. 4C).

Bemærk: punktere en oocyt, mens dissekere sene stadier af æg kamre er ikke så fordømme som med dissekere jegndividual ovarioles for yngre trin.

Bemærk: For stage 14 æg kamre, de pincet bruge til at forstå de dorsale vedhæng til orientering.

5. Injektionspræparat

Bemærk: For injektion af midten trin oocytter, orientere ovarioles vinkelret på længdeaksen af ​​dækglasset.

1. Tænd for billedbehandling mikroskop [i vores tilfælde en DeltaVision Core fra Anvendt Precision] og hente de passende imaging indstillinger (fig. 5A-B).
2. Tænde injektionsapparatet (figur 5C).
3. Læg den kanyle med en belastning spids (fig. 5D-E). Opløsninger, der skal injiceres, bør centrifugeres kort ved høj hastighed for at undgå aflejringer, som kan blokere injektionsnålen.
4. Fastgøre den fyldte injektionsnålen til injektoren. Vær omhyggelig med at undgå at bryde den nål (fig. 5F).
5. For at hjælpe med unclogging nåle, placere et lille stykke glas 2x10 mm fra en klippe eller brækket dækglasset ent ene side af olien dråbe indeholder ovarioles. Sørg for, at dette glas fragment er smurt ind i olie. Dette glas vil tjene til RAM nålespidsen mod for at bryde eller unclogging nålen.

6. Injektion af fluorescerende RNA

Før du begynder: Indstil indsprøjtningsapparatet og mikro-manipulator kontrol, således at kanylen er placeret over midten af ​​synsfeltet.

1. Montere prøven, der skal injiceres på mikroskopbordet.
2. Vælg 20x mål. Højere eller lavere forstørrelse mål kan også anvendes.

Bemærk: Hvis du bruger en automatiseret scene med punkt besøge kapacitet er det tilrådeligt at markere hele scenen 8-9 oocyter til injektion før du begynder. Dette giver mulighed for nem besøg og injektion af udvalgte oocytter.

3. Sænk kanylen, indtil den rører olien. Centret nålespidsen over objektivet.
4. Drejvæk fra værelse lyset og tænde lys-feltet lys til mikroskop. Vælg det første punkt (oocyt) på den markerede punkter listen. Mens du kigger gennem okularerne, fokusere på ægget (figur 6A).
5. Sænke nålen manuelt, indtil det er i samme plan i fokus som oocytten og synlige ved siden af ​​oocytten.
6. Ved hjælp af manipulatoren kontrol spidsen af ​​kanylen bevæge sig, indtil den er inde i oocyt. En hurtig knivstikkeri bevægelse er ofte mere succesfuld end en langsom forhånd. Inde, skubbe et lille volumen fra nålen og visuelt vurdere virkningerne, gentages efter behov. Hvis injektionen er lykkes, vil cytoplasmaet inde i ægget blive fortrængt, hvis dette ikke er klart, gentag. Det er ikke nødvendigt at billedet i fluorescens for at bestemme, om materialet er blevet injiceret. Efter injektion, fjernes kanylen fra indersiden af ​​oocytten (figur 6B-G).
7. Den nøjagtige mængde væske injiceret er vanskelig at kvantificere. At forøge injicerede volumen, adjust trykket eller tidspunktet for injektionen puls, bryde nålespidsen at øge åbningen lidt eller bruge gentagen injektion impulser.

Bemærk: Hele injektion processen bør tage mindre end 10 sekunder, når korrekt udført. Omfattende stikkende eller langvarig med nålen ind i ægget, vil resultere i alvorlig beskadigelse af ægget kammeret.

8. Før udvælgelse næste markerede oocytten, hæve injektionsnålen høj nok til olien for ikke at kontakte andre oocytter i bevægelsesbanen.
9. På det nye ægcelle, gentage trin 6,6. Fortsætte på denne måde, indtil alle de ønskede oocytterne injiceres.

Bemærk: Hvis der laves en fejl under injektion, gå videre til næste mærket oocyt. Spild ikke tid på beskadigede oocytter.

Bemærk: Nålen kan blive tilstoppet under en injektion session. I dette tilfælde bevæger nålen nær den brudte glasstykke i olien på dækglasset. With glasset og kanylen i den samme fokale plan forsigtigt ram nålen ind i glasset (fig. 6H). Teste, at nålen bliver tilstoppede ved at trykke på dosisknappen og se eventuelt fluid forlader spidsen af ​​nålen.

10. Når alle oocytterne er blevet injiceret, manuelt bevæge nålen op ud af olien og orientere den ud af strålevejen for mikroskopet. Sikre, at den er i en sikker orientering, for at undgå ødelæggelse af øjet.

Bemærk: Hvis en længere tidsperiode er forløbet mellem æg kammeret isolation og oocyt injektion, vil oocytter være vanskeligt at injicere og udviser fænotypiske ændringer forbundet med stress. Lignende problemer kan opstå ved hårdhændet håndtering af oocytten eller injektion af overskydende mængder (sammenlign fig 6I, J, K).

7. Live imaging eksperimentelle design

1. Vælg den første injiceres ægget fra listen. Test, at injektionen var inde i ægget ved imaging en ramme i fluorescens (ens i figur 6G).
2. Konfigurere eksperimentelle parametre, herunder: excitationsbølgelængde, emission sti, excitation tid, Z-stakken og tiden mellem samlingerne. Bemærk: For mere information om dette, Parton R., et al se. (2010) ^2.
3. Saml datasættet.

8. Repræsentative resultater

In vitro syntetiseret Alexa-546 GRK RNA injiceres en Me31B :: GFP æg kammer (fig. 7A). RNA'et lokaliserer til den dorsale forreste af oocytten og danner en hætte omkring kernen (figur 7B). For flere eksempler på RNA lokalisering se MacDougall N., et al. (2003) ^11.

Midten og slutningen af fase oocyter, der udtrykker fluorescerende mærket protein (Tau-GFP, figur 7C) eller RNA-tagging-systemer (GRK * mCherry, figur 7D) kan afbildes uden injektion.

Figur 1.

Figur 2.

Figur 3.

Figur 4.

Figur 5.

Figur 6.

Figur 7.

Discussion

Levende celler billeddannelse er en kraftig assay for behandlingen cellulære processer, i realtid. Ud over simple lys felt observation, har tilsætning af fluorescerende mærker til proteiner og RNA'er af interesse fører til mange gennembrud. Her har vi beskrevet en protokol for billeddannelse individuelle levende oocytter, som kan anvendes i kombination med genetiske og biokemiske assays.

I denne protokol, vi også forklare, hvordan man eksperimentelt manipulere levende oocytter ved injektion. Der er mange muligheder for materiale til injektion, herunder in vitro syntetiseret fluorescerende mærkede RNA til analyse af evnen af en sekundær struktur til direkte RNA lokalisering (Ball og Davis, upubliceret), og antistoffer, der inhiberer funktionen af proteiner ^6. Det fremtidige arbejde vil sandsynligvis se indførelsen af ​​andre mærkningskrav komponenter og cellulære maskineri til levende oocyter gør det muligt for molekylære mekanismer, der skal testes.

t "> Bevarelse af levedygtighed og sundhed vævet er afgørende, når man arbejder med levende celler. I denne protokol, peger vi på en række skridt, der kan føre til stress af ægget kammeret. For eksempel, på trods af olie er overlegen til billedbehandling, Udvidet kultur i olien kan føre til stress på ægget kammeret. Dette kan nemt overvåges under lyse felteksponering ved at undersøge det nukleare morfologi og placering, oocyt membran, der vil fordreje og bleb under stress (sammenlign figur 7E (ustressede) til Figure7F ( understreget)). Stage 9 æg kamre vise RNA lokalisering og grænsen cellemigration ¹² over flere timer. Men en scene 7/8 æg kammer vil begynde at udvise skadelige virkninger i Halo kul olie efter omkring 40 minutter i æggestokkene blive fjernet fra kvindelige. sent æg kamre, trin 11 til 14, kan udvikle sig normalt i enten olie eller vandige medium på grund af udskillelse af æggeskallen fra follikelceller på disse stadier ^13. Det har været reported at tilsætningen af insulin til vandig insekt medium kan opretholde scene 9 oocytter i op til 6 timer ¹⁴ og germaria op til 14 timer ^15. I alle tilfælde bør aggressiv manøvrering af ægget kammeret undgås, da det understreger de oocytter og reducerer dens levedygtighed. Imaging færre æg kamre og tage sig til at behandle hver enkelt forsigtigt er den bedste måde at sikre optimal levedygtighed.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning.
Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0)	Any Supplier		A good quality brush is important
Halocarbon Products Corporation, Series 95	Halocarbon Products Corp.		European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil.
Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T
Dumont No.5 - Dumostar	Fine Science Tools	11253-20	"Biologie" tip is also good but more fragile
Dissecting probe	Fine Science Tools	10140-01
Dissecting microscope	Olympus Corporation	SZ61
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)	European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads
KimCare	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Microscope- DeltaVision	Applied Precision	DC-CORE
Micromanipulator	Burleigh	Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300	http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo)
Injection apparatus	Tritech Research, Inc.	MINJ-1	Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips
Injection needle	Eppendorf	930000043	Different tips are better for different applications
Loading tips 20μl	Eppendorf	5242956.003
Dry active yeast	Fleischman’s	#2192