Summary
De
Abstract
Levende cellen imaging is een belangrijke techniek toegepast op een aantal van Drosophila weefsels als model onderwerpen als as specificatie, celdifferentiatie en Organogenese een te onderzoeken. De juiste voorbereiding van de experimentele monsters is een cruciaal, vaak genegeerd, stap. Het doel van de voorbereiding is om fysiologische relevantie en zorgen voor optimale beeldvorming voorwaarden vast te stellen. Voor het behoud levensvatbaarheid van het weefsel, is het essentieel om dehydratie, hypoxie, oververhitting of medium verslechtering te voorkomen 2.
De Drosophila ei kamer is een goed opgezet systeem voor de behandeling van vragen over, maar niet beperkt tot, het lichaam patronen, mRNA lokalisatie en de organisatie van het cytoskelet 3,4. Voor de vroege-en midden-stage ei kamers, montage in halogene olie is goed om te overleven in dat het gratis diffusie van zuurstof mogelijk maakt, voorkomt uitdroging en hypoxie en heeft een uitstekende optische eigenschappen voor microscopie. Imveroudering van fluorescente eiwitten mogelijk door het invoeren van transgenen in het ei kamer of fysische injectie van gelabelde RNA, eiwit of antilichamen 5-7. Bijvoorbeeld toevoeging van MS2-constructen in het genoom van dieren kunnen real time waargenomen mRNA in de eicel 8. Deze constructies zorgen voor in-vivo-etikettering van mRNA door middel van gebruik van de bacteriofaag MS2 RNA stam-lus interactie met zijn vacht eiwit 9.
Hier presenteren we een protocol voor de winning van eierstokken en het isoleren van individuele ovarioles en ei kamers van de vrouwelijke Drosophila. Voor een gedetailleerde beschrijving van Drosophila oögenese See Allan C. Spradling (1993, herdruk 2009) 10.
Protocol
1. Drosophila voorbereiding vóór het vertrek voor dissectie (Volgens E. Gavis, Princeton University)
- Gooi de volwassenen uit een dun gezaaid fles en zet de fles tot 25 ° C op voorhand van uw experiment. Zodra nieuwe volwassenen zijn begonnen te ontstaan, wacht twee dagen.
- Neem een vlieg flacon met ongeveer 10 ml van vast voedsel en voeg 0.5-0.7 gram droge gist (zie tabel) op een hoek van 45 graden. Bedek de gehele oppervlakte van de vlieg voedsel met gist.
- Een paar druppels water op de gist voldoende te hydrateren (figuur 1A). Plaats de flacon van 45 graden en laat ongeveer 3 minuten voor de gist om te genieten van het water (Figuur 1B).
Opmerking: Als alternatief, premix een gist plakken in een aparte container en de pasta aan de flacon toe te voegen met een spatel.
- Verdoof de vliegen in de flacon door het injecteren van CO 2-gas. Als ze stoppen met bewegen, kantelt het onbewuste vliegen op de CO 2
- Isoleer 10-15 vrouwtjes en vijf mannetjes van de gewenste genotype onder een dissectie ruimte met een fijne tip penseel (figuur 1D). Mannetjes duidelijk zijn door de aanwezigheid van claspers, een donkere uitstekende constructie op hun achterste.
- Selectie toevoegen vliegen om de gegiste flacon (figuur 1E). Plaats bij 25 ° C 24-60 uur. Incubeer gedurende kortere tijdsperioden voor een grotere procent van de jonge tot medio stadium ei kamers en langere termijnen voor de late fase ei kamers.
2. Drosophila vruchtbeginsel ontleding
- Een kleine druppel olie op een halogene nr. 1.5 22 x 50 mm dekglas (Figuur 2A). Stel de bereide dekglas de zijde waar het niet in de weg.
- Verdoof de vliegen in de gegiste verachtelijke door het injecteren van CO 2-gas en tip op een CO 2-pad.
- Gebruik scherpe fijn-nosed tang te vatten een individuele vrouwelijke vetgemest op de voorste van de buik (niet tussen ee buik thorax) (Figuur 2B-C).
- Houd de vrouw met de tang en bekijken onder een stereomicroscoop, ongeveer 2-3 cm boven de voorbereide dekglaasje aan.
- Nog steeds met de voorste, moet een tweede set van een tang het weefsel te verwijderen op de uiterste achterkant van het vrouwelijke (Figuur 2D). Let op: Gut weefsel meestal uit trekken met de achterste einde. Veeg het verwijderde weefsel van de tang.
- Terwijl u nog steeds de vrouwelijke op de voorste, gebruikt u de afgeveegd tang om zachtjes knijpen of masseren van de buik, het werken vanuit de voorste naar de achterkant. Masseer de buik op dezelfde wijze als het verwijderen tandpasta het einde van een buis.
- Twee grote ondoorzichtige structuren worden geschoven en de buik stok aan het einde van de tang (Figuur 2E-F). Dit zijn de gepaarde eierstokken.
- Raak de eierstokken op de halogene olie op de dia hieronder.
- Herhaal de dissectie 1-2 keer tot een totaal van 4-6 eierstokken te geven in de olie op het dekglaasje (Figure 2G).
3. Isoleren ovarioles
Opmerking: Elke eierstok bevat ongeveer 16 ovarioles up van 6 tot 10 eieren kamers van verschillende stadia gerangschikt als kralen aan een snoer 10 gemaakt.
Let op: Voorafgaand aan het isoleren van de ovarioles, de lichtbron aan te passen op de stereomicroscoop, zodat de verlichting valt onder een kleine hoek naar het monster. Dit geeft tegenstelling tot het monster en maakt visualisatie van de jonge fase ei kamers.
- In de olie te scheiden van de twee eierstokken door het verwijderen van het bindweefsel op het achterste einde (oud fasen) met gesloten tang (Figuur 3A).
- Orient een individuele eierstok met de oudste stadia naar links en jongste fase naar rechts. De jonge stadium ei kamers in de eierstok zijn transparant en vormen de meer puntige uiteinde van de eierstok.
- Met een pincet in de dominante hand, voorzichtig pak de achterkant van een eierstok, bij voorkeur door de overblijfselen van ee bindweefsel. Terwijl u de eierstok op zijn plaats met de tang, gebruik dan een dissectie sonde (of wolfraam naald) te plagen uit individuele ovarioles (figuur 3B-D).
Opmerking: Individuele ovarioles zal breken tussen de jonge stadia (germarium tot 10 fase) als de oudere fasen zijn te groot om te worden gescheiden van de volledige eierstok.
Let op: doorboort een laat stadium eicel met het ontleden van sonde zal resulteren in het cytoplasma lekken in de olie en maak extractie van individuele ovarioles zeer uitdagend. Als een laat stadium eicel wordt aangeprikt, ga dan naar een frisse eierstok.
- Zodra de ovariole vrij is van de eierstok, gebruikt u de ontleden sonde te slepen naar het midden van de olie-drop en oriënteren in de gewenste richting voor het experiment. Let op: Ovarioles in olie zal vestigen en zich aan het glas.
- Herhaal dit proces (3.3 tot 3.4), totdat er 15-25 individuele ovarioles. Opmerking: Dit kan de dissectie van multip nodigle eierstokken. Het hele proces duurt minder dan 15 minuten.
Opmerking: Het is aan te raden om een eierstok elke ontleden van verschillende vliegen in plaats van het ontleden van beide eierstokken van minder vliegen aan de n aantal vliegen te verhogen voor het experiment.
Opmerking: ruwe behandeling van de ovariole zal resulteren in ongezonde oöcyten en kan leiden tot artefacten in het experiment.
Let op: eicellen zullen beginnen te fenotypische veranderingen als gevolg van 40 minuten na opengesneden uit de eierstok (vergelijk figuur 7E tot en met F) de nadruk weer te geven.
- Eenmaal ovarioles zijn op een adequate oriëntatie (figuur 3E), gebruikt u de sonde ontleden en gesloten tang om overtollig eierstokweefsel te verplaatsen uit de olie. Dit materiaal kan worden weggeveegd van de tang op een papieren handdoek.
4. Het isoleren van individuele laat stadium ei kamers (Volgens E. Gavis, Princeton University)
- Met een pincet in de Dominmier de hand, pakt u de achterkant van een geïsoleerde eierstok, bij voorkeur door de overblijfselen van het bindweefsel. Terwijl u de eierstok op zijn plaats met de tang, introduceren de ontleden sonde in het achterste eind van de eierstok in de buurt van de tang (figuur 4A). Vermijd het aanprikken van een ei kamers door het invoegen van de sonde tussen de late fase ei kamers.
- Trek de naald door het ontleden van de eierstok totdat deze uit in een vroeg stadium ei kamers (Figuur 4B). Wanneer dit juist gebeurt, zal de sonde te verwijderen het bindweefsel die de ovarioles en laat stadium ei kamers op zijn plaats.
- Herhaal stap 4.2 tot het ovarioles zijn verspreid op het dekglaasje aan. Opmerking: Als ei kamers niet meer gestapeld elkaar deze stap is voltooid.
- De ontleden sonde scheiden eind oöcyten om gemakkelijk te kunnen beeldvorming (Figuur 4C).
Let op: doorboort een eicel, terwijl ontleden laat stadium ei kamers is niet zo veroordelen als bij het ontleden van iNDIVIDUELE ovarioles voor jongere stadia.
Opmerking: Voor fase 14 ei kamers, gebruik de tang om de dorsale aanhangsels voor oriëntatie te begrijpen.
5. Injectie voorbereiding
Opmerking: Voor de injectie van medio stadium eicellen, richt u de ovarioles loodrecht op de lengteas van het dekglas.
- Zet de imaging microscoop [in ons geval een DeltaVision Core van Applied Precision] en plaats de juiste beeldvorming instellingen (Figuur 5A-B).
- Zet de injectie apparaat (figuur 5C).
- Plaats de injectienaald met een laad-tip (figuur 5D-E). Oplossingen voor worden geïnjecteerd moeten kort worden gecentrifugeerd bij hoge snelheid aan deposito's die de injectienaald kunnen blokkeren te vermijden.
- Bevestig de geladen injectienaald op de injector. Zorg om te voorkomen dat het breken van de naald (Figuur 5F).
- Om u te helpen met ontstoppen naalden, leg dan een klein stukje glas 2x10 mm van een snee of gebroken dekglaasje eent een zijde van de oliedruppel met de ovarioles. Zorg ervoor dat dit glas fragment is bedekt met olie. Dit glas zal dienen te rammen van de naald tegen de voor het breken of ontstoppen van de naald.
6. Injectie van fluorescerende RNA
Voordat u begint: Stel de injectie apparatuur en micro-manipulator controles zodanig dat de injectienaald zich boven het centrum van het gezichtsveld.
- Plaats het monster te injecteren in de microscooptafel.
- Selecteer de 20x doelstelling. Hogere of lagere vergroting doelstellingen kunnen ook worden gebruikt.
Opmerking: Als u een geautomatiseerde podium met punt bezoek aan mogelijkheden is het raadzaam om de etappe te markeren 8-9 eicellen voor injectie voordat u begint. Dit zorgt voor een eenvoudig bezoek aan en de injectie van geselecteerde eicellen.
- Laat de injectienaald tot hij raakt de olie. Centreer de naald over het objectief.
- Draaienoff verlichting in de kamer en zet de bright-field licht voor de microscoop. Selecteer het eerste punt (eicel) op de gemarkeerde punten lijst. Kijk door de oculairs, richten zich op de eicel (figuur 6A).
- Handmatig verlaagt de naald tot het in hetzelfde vlak van focus als de eicel en zichtbaar naast de eicel.
- Met behulp van de manipulator, plaatst u de punt van de injectienaald tot hij zich in de eicel. Een snelle stekende beweging is vaak meer succes dan een langzaam vooruit. Eenmaal binnen, werpen een klein volume van de naald en visueel beoordelen van de effecten, te herhalen indien nodig. Als de injectie succesvol is, zal het cytoplasma in de eicel worden verplaatst, als dit niet duidelijk is, herhaal. Het is niet nodig beeld fluorescentie te bepalen of materiaal geïnjecteerd. Na de injectie, verwijder de naald uit in de eicel (figuur 6B-G).
- De precieze hoeveelheid vloeistof geïnjecteerd is moeilijk te kwantificeren. Om de geïnjecteerde volume, automati te verhogenst de druk of de tijd van de injectie puls, breek de naald om de opening licht stijgen of herhaalde injectie pulsen te gebruiken.
Opmerking: Het hele injectie proces duurt minder dan 10 seconden op de juiste wijze uitgevoerd. Uitgebreide stekende of slepende met de naald naar binnen om eicel zal resulteren in ernstige schade aan de ei kamer.
- Voor het selecteren van de gemarkeerde eicel, verhoging van de injectienaald hoog genoeg in de olie om geen andere oöcyten contact wordt de afstand.
- In het nieuwe eicel, herhaalt u stap 6.6. Ga door op deze manier tot alle benodigde eicellen worden geïnjecteerd.
Opmerking: Als een fout is gemaakt tijdens het injecteren, naar de volgende gemarkeerd eicel. Verspil geen tijd op beschadigde eicellen.
Opmerking: De naald kan verstopt raken tijdens een injectie sessie. In dit geval zet de naald nabij de gebroken stuk glas in de olie op het dekglaasje. Verstandh het glas en de naald in hetzelfde focal plane, zacht ram de naald in het glas (figuur 6H). Test dat de naald verstopt raken door op de injectie-knop en te kijken of alle vloeistof verlaat de punt van de naald.
- Als alle eicellen zijn geïnjecteerd, verplaats de naald omhoog, uit de olie en richt het uit van de bundel pad voor de microscoop. Zorg ervoor dat het in een veilige richting, om te voorkomen dat schade aan de ogen.
Opmerking: Als een langere periode van tijd is verstreken tussen de ei kamer isolatie en eicel injectie, eicellen zal moeilijk zijn om te injecteren en vertonen fenotypische veranderingen die gepaard gaan met stress. Soortgelijke problemen kunnen ontstaan met een ruwe behandeling van de eicel of de injectie van overtollige volumes (vergelijk figuren 6I, J, K).
7. Live beeldvorming experimenteel design
- Selecteer de eerste geïnjecteerde eicel uit de lijst. Test dat de injectie was in de eicel door de beeldvorming een frame in fluorescentie (eens in figuur 6G).
- Configureer de experimentele parameters, waaronder: excitatie golflengte, emissie-pad, excitatie tijd, Z-stack en de tijd tussen de collecties. Opmerking: Voor meer informatie hierover, zie Parton R., et al.. (2010) 2.
- Verzamel de dataset.
8. Representatieve resultaten
In vitro gesynthetiseerd Alexa-546 grk RNA geïnjecteerd in een Me31B :: GFP ei kamer (Figuur 7A). Het RNA lokaliseert aan de dorsale anterieure van de eicel en vormt een pet rond de kern (Figuur 7B). Voor meer voorbeelden van RNA-lokalisatie te zien MacDougall N., et al.. (2003) 11.
Midden en late fase eicellen te drukken fluorescent gelabelde eiwitten (Tau-GFP, figuur 7C) of RNA-tagging-systemen (GRK * mCherry, figuur 7D) kunnen worden afgebeeld zonder injectie.
Figuur 1.
Figuur 2.
Figuur 3.
Figuur 4.
Figuur 5.
Figuur 6.
Figuur 7.
Discussion
Live cell imaging is een krachtige test voor de behandeling van cellulaire processen in real time. Naast eenvoudige helder veld observatie, de toevoeging van fluorescerende labels eiwitten en RNA van belang heeft tot vele doorbraken. Hier hebben we aangegeven een protocol voor de beeldvorming natuurlijke persoon die eicellen die in combinatie worden gebruikt met genetische en biochemische assays.
In dit protocol hebben we ook uitgelegd hoe je experimenteel leven eicellen te manipuleren door middel van injectie. Er zijn vele mogelijkheden voor materiaal te injecteren, zoals in vitro gesynthetiseerd fluorescent gelabelde RNA assay het vermogen van een secundaire structuur directe RNA lokalisatie (kogel en Davis, niet gepubliceerd) en antilichamen die de functie van eiwitten 6 remmen. Toekomstig werk zal waarschijnlijk zien de invoering van andere etikettering componenten en cellulaire machinerie tot leven eicellen waardoor moleculaire mechanismen te testen.
t "> Behoud van de leefbaarheid en de gezondheid van het weefsel essentieel is bij het werken met levende cellen. In dit protocol, we wijzen op een aantal stappen die kunnen leiden tot stress van de ei kamer. bijvoorbeeld, ondanks de olie superieur voor de beeldvorming, uitgebreide cultuur in de olie kan leiden tot stress op het ei kamer. Dit kan gemakkelijk worden gecontroleerd onder helderveld blootstelling door onderzoek van de nucleaire morfologie en positie, eicel membraan dat zal verstoren en blaar onder stress (vergelijk figuur 7E (onbeklemtoonde) naar Figure7F ( benadrukt)). Etappe 9 ei kamers tonen RNA lokalisatie en grens celmigratie 12 over meerdere uren. echter een fase 7/8 ei kamer zal beginnen om nadelige gevolgen in Halo carbon olie vertonen na ongeveer 40 minuten van de eierstokken worden verwijderd uit de vrouw. laat stadium ei kamers, trap 11 tot 14, kan normaal ontwikkelen in olie of waterige media als gevolg van de afscheiding van de eischaal uit de follikel cellen op deze stadia 13. Het is al reported dat de toevoeging van insuline aan waterige insect medium kan Etappe 9 eicellen te behouden voor maximaal 6 uur 14 en germaria tot 14 uur 15. In alle gevallen dient de agressieve manoeuvres van de ei kamer worden vermeden, omdat het wijst op de eicellen en vermindert de levensvatbaarheid ervan. Imaging minder ei kamers en de zorg voor de behandeling van elk is voorzichtig de beste manier om een optimale levensvatbaarheid te garanderen.Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Wellcome Trust Senior Research Fellowship aan I. Davis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning. | |||
| Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0) | Any Supplier | A good quality brush is important | |
| Halocarbon Products Corporation, Series 95 | Halocarbon Products Corp. | European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil. |
|
| Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T | |
| Dumont No.5 - Dumostar | Fine Science Tools | 11253-20 | "Biologie" tip is also good but more fragile |
| Dissecting probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| CO2 pad |  Genesee Scientific |
59-114 (789060 Dutscher) | European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads |
| KimCare | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
| Microscope- DeltaVision | Applied Precision | DC-CORE | |
| Micromanipulator | Burleigh | Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300 | http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo) |
| Injection apparatus | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips |
| Injection needle | Eppendorf | 930000043 | Different tips are better for different applications |
| Loading tips 20μl | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
References
- Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol. Biol. 420, 1-25 (2008).
- Parton, R. M., Valles, A. -M., Dobbie, I. D., Davis, I. Pushing the Limits of Live Cell Imaging in Drosophila. Live Cell Imaging: A Laboratory. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 387-418 (2010).
- Johnston, D. Moving messages: the intracellular localization of mRNAs. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (5), 363-375 (2005).
- Jansen, R. mRNA Localization: Message on the Move. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 247-256 (2001).
- Van De Bor, V., Hartswood, E., Jones, C., Finnegan, D., Davis, I. gurken and the I factor retrotransposon RNAs share common localization signals and machinery. Dev. Cell. 9 (1), 51-62 (2005).
- Delanoue, R., Herpers, B., Soetaert, J., Davis, I., Rabouille, C. Drosophila Squid/hnRNP helps Dynein switch from a gurken mRNA transport motor to an ultrastructural static anchor in sponge bodies. Dev. Cell. 13 (4), 523-538 (2007).
- Jaramillo, A. M., Weil, T. T., Goodhouse, J., Gavis, E. R., Schupbach, T. The dynamics of fluorescently labeled endogenous gurken mRNA in Drosophila. J. Cell. Sci. 121 (Pt. 6), 887-894 (2008).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous mRNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr. Biol. 13, 1159-1168 (2003).
- Bertrand, E. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol. Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).
- MacDougall, N., Clark, A., MacDougall, E., Davis, I. Drosophila gurken (TGFalpha) mRNA localizes as particles that move within the oocyte in two dynein-dependent steps. Dev. Cell. 4 (3), 307-319 (2003).
- Tekotte, H., Tollervey, D., Davis, I. Imaging the migrating border cell cluster in living Drosophila egg chambers. Dev. Dyn. 236 (10), 2818-2824 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R., Davis, I., Gavis, E. R. Changes in bicoid mRNA anchoring highlight conserved mechanisms during the oocyte-to-embryo transition. Curr. Biol. 18, 1055-1061 (2008).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
