Framställning av individuella Drosophila Egg Chambers för Live Imaging

Summary

Den

Abstract

Levande cell imaging är en viktig teknik tillämpas på ett antal Drosophila vävnader som används som modeller för att undersöka ämnen som axeln specifikation, celldifferentiering och organogenesen ^1. Korrekt beredning av de experimentella proverna är en avgörande, ofta försummas, steg. Målet för framställning är att säkerställa fysiologiska relevansen och att fastställa optimala avbildningsbetingelser. För att upprätthålla vävnadsviabilitet, är det viktigt att undvika uttorkning, hypoxi, överhettning eller medium försämring ^2.

Drosophila ägget kammaren är ett väl etablerat system för att pröva frågor som rör, men inte begränsat till kroppen mönstring, mRNA lokalisering och cytoskelett organisation ^3,4. För tidig-och mitten-stegs ägg kammare, montering i halogenkol olja är bra för överlevnad i det tillåter fri diffusion av syre, förhindrar uttorkning och hypoxi och har utmärkta optiska egenskaper för mikroskopi. Imåldring av fluorescerande proteiner är möjlig genom att införa transgener i ägget kammare eller fysikalisk injektion av märkt RNA, protein eller antikroppar ^5-7. Exempelvis möjliggör tillsats av MS2-konstruktioner till genomet hos djur realtid observation av mRNA i oocyter ^8. Dessa konstruktioner tillåter in vivo märkning av mRNA genom användning av MS2 bakteriofag RNA-svängstruktur interaktion med dess höljesprotein ^9.

Här presenterar vi ett protokoll för utvinning av äggstockarna samt isolera enskilda ovarioles och kammare ägg från honan Drosophila. För en detaljerad beskrivning av Drosophila oogenes See Allan C. Spradling (1993, omtryckt 2009) ^10.

Protocol

1. Drosophila beredning före för dissektion (Enligt E. Gavis, Princeton University)

1. Kasta de vuxna från en glest seedade flaska och flytta flaskan till 25 ° C före experimentet. När nya vuxna har börjat växa fram, vänta två dagar.
2. Ta en fluga flaska innehållande ca 10 ml av fast föda och tillsätt 0,5-0,7 gram torrjäst (se tabell) på en 45 graders vinkel. Täck inte hela ytan av flugan mat med jäst.
3. Tillsätt några droppar vatten till jäst, som är tillräcklig för att hydratisera (figur 1A). Placera flaskan i 45 grader och låt ca 3 minuter för jästen att suga upp vattnet (Figur 1B).

Notera: Alternativt förblandning en jäst pasta i en separat behållare och lägg pastan i flaskan med en spatel.

4. Bedöva flugor i flaskan genom att injicera CO _2-gas. När de slutar att flytta, tippa de omedvetna flugorna på CO ₂
5. Isolera 10-15 honor och 5 hanar av den önskade genotypen under ett dissektionsmikroskop med en fin spets pensel (Figur 1D). Manlig är uppenbara genom närvaron av claspers, en mörk utskjutande struktur på sin bakre.
6. Lägg till valda flugor till yeasted flaskan (figur 1E). Rum vid 25 ° C i 24-60 timmar. Inkubera under kortare tidsperioder för en större procent av unga till mitten av kamrarna scen ägg och längre tidsperioder för sena kamrar stadium ägg.

2. Drosophila äggstocken dissektion

1. Placera en liten droppe av Halocarbon Oil på en nr 1,5, 22 x 50 mm täckglas (figur 2A). Ställa det preparerade täckglas till den sida där den inte kommer att vara i vägen.
2. Bedöva flugor i yeasted avskyvärda genom att injicera CO _2-gas och dricks på en CO ₂ pad.
3. Använd skarpa fin nosed pincett för att förstå en individ gödas tik på den främre delen av buken (inte mellan the buken och thorax) (figur 2B-C).
4. Håll hona med tången och visa under ett dissektionsmikroskop, ca 2-3 cm ovanför förberedda täckglaset.
5. Fortfarande håller på den främre, använd en andra uppsättning pincett för att ta bort vävnaden vid extrema bakre delen av kvinnor (figur 2D). Obs: tarmvävnad vanligtvis dra ut med den bakre änden. Torka den avlägsnade vävnaden från tången.
6. Medan du håller honan vid den främre, använd torkas pincett för att försiktigt pressa eller massera buken, som arbetar från den främre till den bakre. Massera buken på samma sätt som tar bort tandkräm från änden av en tub.
7. Två stora opaka strukturer kommer att tryckas från buken och hålla på änden av tången (figur 2E-F). Dessa är de parade äggstockarna.
8. Tryck på äggstockarna på halogenkolvätet oljan på bilden nedan.
9. Upprepa dissekering 1-2 gånger för att ge en totalt 4-6 äggstockarna i oljan på täckglaset (Figure 2G).

3. Isolering av ovarioles

Obs: Varje äggstocken innehåller ungefär 16 ovarioles består av 6 till 10 ägg kammare olika stadier ordnade som pärlor på ett snöre ^10.

Obs: Innan isolera ovarioles, justera ljuskällan på dissekeringsmikroskop så att belysningen slår i en flack vinkel till provet. Detta ger kontrast till provet och medger visualisering av de unga kamrarna steget ägg.

1. I oljan, separera de två äggstockarna genom att ta bort den anslutande vävnaden vid den bakre änden (gamla steg) med slutna pincett (Figur 3A).
2. Orient en individ äggstock med de äldsta steg till vänster och yngsta steg till höger. De unga steg ägg kammare i äggstockarna är transparenta och bildar den mer spetsiga änden av äggstockarna.
3. Med en pincett i den dominerande handen försiktigt tag i bakre delen av en äggstock, företrädesvis genom resterna av the bindväv. Håll äggstocken på plats med pincetten, använd en dissekering sond (eller volfram nål) att retas ut enskilda ovarioles (Figur 3B-D).

Notera: Individuella ovarioles kommer att bryta mellan unga stegen (germarium till steg 10) som de äldre steg är för stora för att separeras från den fullständiga äggstocken.

Anmärkning: punktering ett sent skede oocyt med dissekerande sonden kommer att resultera i cytoplasman läcker in i oljan och gör utvinningen av individuella ovarioles mycket utmanande. Om ett sent skede äggcell punkteras, flytta till en ny äggstock.

4. När väl ovariole är fri från äggstocken, använd dissekerande sonden att dra det till mitten av oljedroppmetoden och orientera i den önskade orienteringen för experimentet. Obs: Ovarioles i olja kommer att lösa och följa glaset.
5. Upprepa denna process (3,3-3,4) tills det är 15-25 enskilda ovarioles. Obs: Detta kan kräva dissektion av multiple äggstockar. Hela processen bör ta mindre än 15 minuter.

OBS: Det är lämpligt att dissekera en äggstock från vardera flera flugor i stället dissekera båda äggstockarna från färre flugor för att öka n antal flugor för experimentet.

Anmärkning: Grov hantering av ovariole kommer att resultera i ohälsosamma oocyter och kan leda till artefakter i experimentet.

Notera: Oocyter börjar visa fenotypiska förändringar på grund av stress 40 minuter efter att dissekerades från äggstocken (jämför figur 7E till F).

6. När ovarioles är på ett adekvat orientering (figur 3E), använd skärande sonden och slutna pincett för att flytta över äggstocksvävnad ur oljan. Detta material kan torkas från tången på en pappershandduk.

4. Isolera enskilda sent stadium ägg kamrar (enligt E. Gavis, Princeton University)

1. Med en pincett i DominANT handen, ta tag i bakre delen av en isolerad äggstock, företrädesvis genom resterna av bindväven. Medan man håller äggstocken på plats med pincetten, införa dissekerande sonden i den bakre änden av äggstocken nära tången (figur 4A). Undvika att punktera någon ägg kamrar genom att sätta sonden mellan slutet av kamrarna stadium ägg.
2. Dra dissekera nålen genom äggstocken tills den kommer ut i tidiga kamrarna stadium ägg (Figur 4B). När du är klar korrekt kommer sonden bort bindväven som håller ovarioles och sena Stegkammare ägg på plats.
3. Upprepa steg 4,2 tills ovarioles sprids ut på täckglaset. Obs: När ägg kamrarna inte längre staplas ovanpå varandra, är detta steg klar.
4. Med hjälp av dissekera sonden, separera sena oocyter för att möjliggöra enkel avbildning (Figur 4C).

Obs: punktera en äggcell, medan dissekera sent kamrarna fas ägg är inte så fördöma som med dissekera individual ovarioles för yngre stadier.

Obs: För etapp 14 ägg kammare, använd pincett för att förstå de dorsala bihang för orientering.

5. Injektionspreparat

Notera: För injektionen av mellansteget oocyter, orientera ovarioles vinkelrätt mot den långa axeln av täckglaset.

1. Slå på imaging mikroskopet [i vårt fall en DeltaVision Core från Tillämpad Precision] och ladda lämplig bildteknik inställningar (Figur 5A-B).
2. Slå på injektionsapparaten (figur 5C).
3. Ladda injektionsnålen med en laddning-spetsen (figur 5D-E). Lösningar som skall injiceras skall centrifugeras kort med hög hastighet för att undvika avlagringar som kan blockera injektionsnålen.
4. Fästa den laddade injektionsnål till injektorn. Var noga med att undvika att bryta nålen (figur 5F).
5. Att hjälpa till med unclogging nålar, placera en liten glasbit 2x10 mm från ett snitt eller trasig täckglas ent ena sidan av oljedroppmetoden innehållande ovarioles. Se till att detta glas fragment är täckt i olja. Detta glas kommer att tjäna att ramma nålspetsen mot för att bryta eller unclogging nålen.

6. Injektion av fluorescerande RNA

Innan du börjar: Sätt upp injektionsanordningen och mikro-manipulator kontroller så att injektionsnålen är placerad över mitten av synfältet.

1. Montera det prov som skall injiceras på mikroskopställningen.
2. Välj 20x målet. Högre eller lägre förstoring mål kan också användas.

Obs: Om du använder en automatiserad steg med punkt besöker kapacitet är det lämpligt att markera alla steg 8-9 oocyter för injektion innan du börjar. Detta medger enkel nu och injektion av valda oocyter.

3. Sänk injektionsnålen tills det når oljan. Centrera nålspetsen över objektivet.
4. Svängbort rummet belysningen och vrid på den ljusstarka-fältet ljus för mikroskopet. Välj den första punkten (äggcellen) på den markerade punkter listan. Samtidigt som du tittar igenom okularen, fokusera på äggcellen (Figur 6A).
5. Sänk nålen manuellt tills den är i samma plan i fokus när äggcellen och synliga intill äggcellen.
6. Använda manipulator kontrollerna, flytta punkten av kanylen tills den är inne i äggcellen. En snabb huggande rörelse är ofta mer framgångsrikt än en långsam förväg. Väl inne mata ut en liten volym från nålen och visuellt bedöma effekterna, upprepa vid behov. Om injektionen är framgångsrik, kommer cytoplasman inuti ägget förskjutas, om detta inte är uppenbart, upprepa. Det är inte nödvändigt att bilden i fluorescens för att bestämma om materialet har injicerats. Efter injektion, ta bort nålen från insidan av äggcellen (Figur 6B-G).
7. Den exakta mängden vätska injiceras är svår att kvantifiera. Att öka den insprutade mängden, anpassar sig efter typenst trycket eller tiden för injektionen pulsen, bryta nålspetsen att öka öppningen något eller använda upprepad injektion pulser.

Obs: Hela injektionen processen bör ta mindre än 10 sekunder när de utförs på rätt sätt. Omfattande stickande eller kvardröjande med nålen insidan för att äggcellen kommer att resultera i allvarliga skador på ägget kammaren.

8. Innan du väljer nästa markerade äggcellen, höja injektionsnålen tillräckligt högt i oljan så att de inte kontakta andra oocyter inom rese vägen.
9. Vid den nya äggcellen, upprepar du steg 6,6. Fortsätt på samma sätt tills alla nödvändiga oocyter injiceras.

Obs: Om ett misstag görs medan du injicerar, gå vidare till nästa märkt äggcellen. Slösa inte tid på skadade oocyter.

Obs: Nålen kan bli tilltäppt under en injektion session. I detta fall röra nålen intill den brutna glasbit i oljan på täckglaset. With glaset och nålen i samma fokalplan, försiktigt bagge nålen i glaset (fig 6H). Testa att nålen är unclogged genom att trycka på injektionsknappen och se om någon vätska lämnar nålspetsen.

10. När alla oocyter har injicerats, manuellt flytta nålen uppåt, ut ur oljan och orientera den ur strålbanan för mikroskopet. Se till att det är i ett säkert orientering, för att undvika ögonskador.

Obs: Om en längre tid har förflutit mellan ägg kammaren isolering och äggcellen injektion oocyter vara svårt att injicera och uppvisar fenotypiska förändringar i samband med stress. Liknande frågor kan uppstå med grov hantering av äggcellen eller injektion av överskott volymer (jämför figur 6I, J, K).

7. Live avbildning experimentell design

1. Välj den första injicerade ägget från listan. Testa att injektionen var inne i ägget genom att avbilda en ram i fluorescens (enar i figur 6G).
2. Konfigurera experimentella parametrar, inklusive: exciteringsvåglängd, emission vägen, excitation tid, Z-stack och tid mellan samlingar. Obs: För mer information om detta, se Parton R., et al. (2010) ^2.
3. Samla data set.

8. Representativa resultat

In vitro syntetiserat Alexa-546 GRK RNA injiceras i en Me31B :: GFP ägg kammare (figur 7A). RNA-lokaliserar till den dorsala främre av oocyten och bildar en kåpa runt kärnan (fig 7B). För fler exempel på RNA lokalisering ser MacDougall N., et al. (2003) ^11.

Mitten och sent stadium oocyter som uttrycker fluorescerande märkt protein (Tau-GFP, figur 7C) eller RNA-system märkning (GRK * mCherry, figur 7D) kan avbildas utan injektion.

Figur 1.

Figur 2.

Figur 3.

Figur 4.

Figur 5.

Figur 6.

Figur 7.

Discussion

Levande cell imaging är en kraftfull analys för att undersöka cellulära processer i realtid. Utöver enkla ljusfält observation har tillsättningen av fluorescerande markörer till proteiner och RNA av intresse leder till många genombrott. Här har vi har skisserat ett protokoll för avbildning enskilda levande oocyter som kan användas i kombination med genetiska och biokemiska analyser.

I detta protokoll förklarar vi också hur experimentellt att manipulera levande oocyter genom injektion. Det finns många möjligheter till materialet för att injicera, inklusive in vitro syntetiserade fluorescerande märkt RNA för analys av förmågan hos en sekundär struktur för att styra RNA-lokalisering (Bali och Davis, opublicerad) och antikroppar som inhiberar funktionen av proteiner ^6. Framtida arbete kommer sannolikt se införandet av andra märkningskrav komponenter och cellulära maskineriet att levande oocyter som gör det möjligt molekylära mekanismer som ska testas.

t "> Bevara livskraften och hälsa vävnaden är viktigt när man arbetar med levande celler. I detta protokoll, vi påpeka ett antal åtgärder som kan leda till stress av ägget kammaren. Till exempel, trots att oljan är överlägsen för avbildning, förlängd kultur i oljan kan leda till stress på ägget kammaren. Detta kan lätt följas under starkt fältexponering genom att undersöka den nukleära morfologi och position, äggcellen membran som snedvrider och bubblan under stress (jämför figur 7E (obelastade) till Figure7F ( stressad)). Steg 9 ägg kamrar visar RNA lokalisering och gränser cellmigrering ¹² över flera timmar. dock en scen 7/8 ägg kammaren kommer att börja uppvisa skadeverkningar i Halo kol-olja efter ca 40 minuter i äggstockarna tas bort från kvinnliga. sent stadium ägg kamrarna, steg 11 till 14, kan utvecklas normalt i antingen olja eller vattenhaltiga medier på grund av utsöndring av äggskalet från follikeln cellerna vid dessa stadier ^13. Det har varit reparted att tillsatsen av insulin till vattenhaltiga insektsmedium kan upprätthålla steg 9 oocyter under upp till 6 timmar ¹⁴ och germaria upp till 14 timmar ^15. I samtliga fall bör aggressiva manövrering av ägget kammaren undvikas, eftersom den betonar de oocyter och minskar dess livskraft. Imaging färre ägg kammare och var noga med att behandla varje är försiktigt det bästa sättet för att säkerställa optimal lönsamhet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning.
Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0)	Any Supplier		A good quality brush is important
Halocarbon Products Corporation, Series 95	Halocarbon Products Corp.		European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil.
Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T
Dumont No.5 - Dumostar	Fine Science Tools	11253-20	"Biologie" tip is also good but more fragile
Dissecting probe	Fine Science Tools	10140-01
Dissecting microscope	Olympus Corporation	SZ61
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)	European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads
KimCare	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Microscope- DeltaVision	Applied Precision	DC-CORE
Micromanipulator	Burleigh	Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300	http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo)
Injection apparatus	Tritech Research, Inc.	MINJ-1	Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips
Injection needle	Eppendorf	930000043	Different tips are better for different applications
Loading tips 20μl	Eppendorf	5242956.003
Dry active yeast	Fleischman’s	#2192