Summary
“
Abstract
活细胞成像是一个重要的技术应用到一些果蝇作为模型来探讨，如轴规格，细胞分化和器官1组织。实验样品的正确准备是至关重要的，往往被忽视，步骤。编制的目标是确保相关生理和建立最佳的成像条件。为了保持组织的活力，这是关键，以避免脱水，缺氧，过热或中等恶化2。
果蝇的卵室是为建立良好的制度，研究有关的问题，而不是有限的，身体图案，基因定位和细胞骨架组织3,4。对于早期和中期阶段的蛋室，安装在卤烃油是良好的生存，它允许氧的自由扩散，防止脱水和缺氧，具有精湛的显微镜的光学性质。 IM通过引进转基因蛋室或物理注射标记的RNA，蛋白质或抗体5-7荧光蛋白老化是可能的。例如，除了对MS2的动物的基因组结构，以使在卵母细胞8 mRNA的实时观察。这些结构允许在体内的基因标记，通过利用其外壳蛋白9的MS2噬菌体RNA茎环互动。
在这里，我们提出了一种提取卵巢，以及雌性果蝇隔离个别卵巢管和蛋商会的协议。详细描述了果蝇卵子见艾伦C. Spradling（1993年，重印2009）10。
Protocol
1。 果蝇准备清扫前（据E. Gavis，普林斯顿大学）
- 丢弃从一个人烟稀少接种瓶的成年人和转让一瓶25°C在实验之前。一旦新的成年人已经开始出现，等待两天。
- 采取蝇小瓶含有固体食物大约10毫升添加0.5-0.7克干酵母（见附表），45度角。不飞食品用酵母覆盖整个表面。
- 酵母，加水几滴足以水合物（图1A）。放置在45度的小瓶，让酵母约3分钟，浸泡水（图1B）。
注：此外，预混料1酵母粘贴在一个单独的容器中，并用锅铲添加粘贴到小瓶。
- 麻醉注射CO 2气体在瓶中的苍蝇。当他们停止移动，刀尖上的CO 2无意识的苍蝇
- 10-15女性在解剖范围和5所需的基因型的男性隔离用细尖的油漆刷（图1D）。男性存在claspers，一个黑暗的突出结构，在他们的后路，是明显的。
- 选择苍蝇添加到yeasted瓶（图1E）。在25°C的地方为24-60小时。孵育短的时间内为更多的年轻％，中期阶段蛋商会和较长时期后期鸡蛋商会。
（2） 果蝇的卵巢解剖
- 放置一个1.5号，22×50毫米的盖玻片（图2A）的卤烃油小滴。将一边准备盖滑，它不会的方式。
- 麻醉注射到CO 2垫CO 2气体和小费在yeasted卑鄙的苍蝇。
- 用锋利的细鼻钳把握养肥个别女性在腹部前（不与日é腹部和胸部）（图2B-C的）。
- 女性用钳子举行，约2-3厘米以上的准备盖玻片，在解剖显微镜下查看。
- 前仍然持有，使用的第二套钳消除极端的女性后方（图2D）的组织。注：肠组织通常会与后端拉。擦拭钳取出的组织。
- 虽然仍保持前的女性，使用擦拭的镊子轻轻挤压或按摩腹部，前赶制的后路。按摩腹部，在同样的方式从管牙膏。
- 从腹部和棒钳（图2E - F）月底将被推迟两个大的不透明结构。这些都是成对的卵巢。
- 触摸到下面的幻灯片上的卤烃油的卵巢。
- 重复剥离1-2次，给予4-6卵巢在盖玻片上的油（FigurË2G）。
3。隔离卵巢管
注：每个卵巢含有约16的6至10个鸡蛋像一个字符串10珠安排的不同阶段商会的卵巢管。
注：隔离卵巢管之前，调整解剖显微镜照明光源，使样品取得浅的角度。这使对比样品，让年轻的阶段蛋商会的可视化。
- 在石油，封闭钳（图3A）在后端（古戏台）通过消除连接组织分离的两个卵巢。
- 东方权左侧和最年轻的阶段最古老的阶段，个体的卵巢。年轻的阶段，在卵巢卵商会是透明的，形成卵巢尖底。
- 一双中占主导地位的手钳，轻轻抓住卵巢后，最好是由残余的日é结缔组织组织。按住钳发生卵巢，用解剖探头（或钨针），梳理出个别的卵巢管（图3B - D）。
注：个人卵巢管会之间的年轻阶段（germarium要举办10），打破旧的阶段是太大，无法从完整的卵巢中分离。
注：穿刺与解剖探头的后期阶段的卵母细胞，将导致入油泄漏的细胞质，使个别卵巢管的提取非常具有挑战性的。如果后期卵母细胞被刺破，移动到一个新的卵巢。
- 一旦卵巢管是免费的卵巢，用解剖的探头，将其拖动到油滴中心和实验所需的方向东方。注：油中的卵巢管会解决，并坚持以玻璃。
- 重复这个过程中（3.3-3.4），直到有15-25个人的卵巢管。注：这可能需要解剖multip乐卵巢。整个过程中应少于15分钟。
注：最好是几个苍蝇，而不是减少苍蝇双侧卵巢解剖实验，以增加N多的苍蝇从解剖各一个卵巢。
注：粗糙处理的卵巢管会导致不健康的卵母细胞，可导致实验中的文物。
注：卵母细胞就会开始显示，由于强调40分钟后，从卵巢解剖（比较图7E对F）的表型变化。
- 一旦卵巢管，在适当的方向（图3E），用解剖的探头和封闭镊子移动的石油过剩的卵巢组织。这种材料可以从镊子上的纸巾擦了擦。
4。隔离个别后期蛋商会（据E. Gavis，普林斯顿大学）
- 与一双镊子在domin蚂蚁的手，抓住一个孤立的卵巢后，最好是由结缔组织的残余。虽然在地方的镊子卵巢，引入后端的卵巢附近的镊子（图4A）的解剖探头。避免后期蛋商会之间插入探头穿刺任何蛋室。
- 转危为安卵巢解剖针，直到它退出在早期阶段蛋商会（图4B）。正确完成后，探测器将删除举行的卵巢管和后期蛋商会在地方的结缔组织。
- 重复步骤4.2，直到盖玻片上的卵巢管蔓延。注：当卵子商会不再堆放在彼此顶部，这一步完成。
- 使用解剖探头，后期卵母细胞分开，以便容易成像（图4C）。
注：穿刺卵母细胞，而解剖后期蛋商会是不是谴责与解剖我年轻的阶段ndividual卵巢管。
注：14阶段蛋商会，使用的镊子，把握方向背附属物。
5。注射剂
注：对于中期阶段的卵母细胞注射，东方的卵巢管垂直于长轴的盖玻片。
- 打开成像显微镜[在我们的例子从应用精密DeltaVision核心和加载适当的成像设置（图5A-B的）。
- 打开的注射器具（图5C）。
- 加载装载尖（图5D-E），注射针头。被注入的解决方案应在高速离心简单，以避免存款，可能会阻止注射针。
- 将装的注射针注射器。照顾，以避免破坏针（图5F）。
- 协助畅通针，从伤口或破盖玻片1放置一个玻璃2X10毫米的小块油中含有的卵巢管下降的一个侧面。确保这个玻璃碎片被油覆盖。这种玻璃将成为打破或畅通针到RAM针尖对。
6。注射荧光RNA
开始之前：建立注射装置和微型机械手的控制等，注射针头，在视野的中心位置。
- 装载的样品被注入显微镜舞台上。
- 选择20X客观。也可用于更高或更低的放大率目标。
注：如果使用点访问功能自动化阶段，它是最好的，以纪念所有阶段开始前8-9注入卵母细胞。这允许容易访问和选定的卵母细胞的注射。
- 降低注射针，直到它触及油。中心在物镜的针尖。
- 转关闭房间的灯打开亮场显微镜的光。选择标记点的名单上的第一点（卵母细胞）。通过目镜的同时，重点对卵母细胞（图6A）。
- 手动降低针，直到它是在同一平面上的卵母细胞和可见光下的卵母细胞作为重点。
- 使用机械手的控制，移动，直到它的卵母细胞内注射针点。往往是一个快速刺向运动较缓慢前进的成功。一旦进入，退出从体积小针和视觉的效果进行评估，需要重复。如果注入成功，将卵母细胞的细胞质内流离失所，如果这不是明显的重复。这是没有必要的材料，以确定是否已注入荧光图像。注射后，取出卵母细胞内（图6B-G）的针。
- 注入流体的确切数额难以定量。为了增加注射量，佐剂ST的压力或注入脉冲的时间，打破了针尖略有增加开放或重复使用注射脉冲。
注意：整个注射过程中应采取正确执行时不到10秒。广泛刺伤或缠绵与针内卵母细胞，将导致严重损害蛋室。
- 在选择下一个显着的卵母细胞，提高高油注射针足够，以免联系其他的卵母细胞在旅行路径。
- 在新的卵母细胞，重复步骤6.6。这样，直到所有所需的卵母细胞注入。
注：如果出现错误，而注射，移动到下一个标记的卵母细胞。不要浪费时间对受损的卵母细胞。
注：针注射会议期间可能会成为堵塞。在这种情况下，将毗邻的玻璃碎片在盖玻片上的油针。风趣h的玻璃，并在同一焦平面的针，轻轻公羊玻璃针（图6H）。测试针推注射按钮，并看到如果任何液体退出针尖畅通。
- 当所有的卵母细胞已注入，手动移动的针，出油和显微镜的光路方向出来。确保它是在一个安全的方向，以避免损伤眼睛。
注：如果长时间蛋室隔离和卵母细胞注射后，卵母细胞将难以注入并表现出与压力相关的表型变化。粗糙处理的卵母细胞或注射过剩体积（比较图6I，J，K），可能会出现类似的问题。
7。实时成像实验设计
- 从列表中选择首先注入卵母细胞。测试注入卵母细胞内成像荧光的一帧（图6G）。
- 配置实验参数，包括：激发波长，发射路径，激发时间，Z-Stack与集合之间的时间。注：欲了解更多这方面的资料，看到帕顿河，等。 （2010）2。
- 收集的数据集。
8。代表结果
在体外合成网站-546 GRK的RNA注射到Me31B :: GFP蛋腔（图7A）。 RNA的定位于背侧前的卵母细胞和细胞核周围形成了一个帽（图7B）。对于RNA的定位更多的例子，见麦克杜格尔N.等。 （2003年）11。
中期和后期卵母细胞表达荧光标记蛋白（TAU-GFP，图7C）或RNA标记系统（GRK * mCherry，图7D）可成像没有注射。
图1。
图2。
图3。
图4。
图5。
图6。
图7。
Discussion
活细胞成像是一个强大的研究细胞过程中实时检测。除了简单明亮的实地观察，除了利益的蛋白质和RNA的荧光标记，导致许多突破。在这里，我们提出了一个成像的个人生活可以结合利用卵母细胞与遗传和生化检测的协议。
在这个协议中，我们也解释如何生活的卵母细胞注射实验操作。有许多材料注入的可能性，包括在体外合成荧光标记的RNA二级结构的能力，以检测RNA的直接定位（Ball和戴维斯，未发表）和抗体，抑制蛋白质的功能6。今后的工作中可能会看到其他标签组件的引进和蜂窝机械生活的卵母细胞，使分子机制进行测试。
T“保活细胞组织的活力和健康是必不可少的工作。在这个协议中，我们指出了一些步骤，可导致蛋室的压力。例如，尽管石油是优越的成像，延长石油文化可以导致蛋室强调，这可以很容易地在明亮的领域暴露监督检查核的形态和位置，卵母细胞的细胞膜会扭曲和压力下泡（比较图7E（重读）Figure7F（强调））第一阶段9个蛋商会表明RNA的定位和边界细胞迁移的12多个小时。然而，7/8阶段蛋商会将被删除卵巢约40分钟后开始表现出晕碳油的不良影响女性。晚期蛋商会，阶段11日至14日，可以正常发展，因为从这些阶段在13毛囊细胞分泌蛋壳要么油或水介质中。它已被回购rted，除了水的昆虫媒介的胰岛素可以维持长达6小时14和germaria 14小时15阶段9卵母细胞。在所有情况下，积极机动的蛋室应避免，因为它强调的卵母细胞，并减少其可行性。成像少蛋室和照顾对待每一个轻轻的最佳方式是，以确保最佳的可行性。Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由威康信托高级研究奖学金一，戴维斯支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning. | |||
| Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0) | Any Supplier | A good quality brush is important | |
| Halocarbon Products Corporation, Series 95 | Halocarbon Products Corp. | European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil. |
|
| Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T | |
| Dumont No.5 - Dumostar | Fine Science Tools | 11253-20 | "Biologie" tip is also good but more fragile |
| Dissecting probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| CO2 pad |  Genesee Scientific |
59-114 (789060 Dutscher) | European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads |
| KimCare | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
| Microscope- DeltaVision | Applied Precision | DC-CORE | |
| Micromanipulator | Burleigh | Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300 | http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo) |
| Injection apparatus | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips |
| Injection needle | Eppendorf | 930000043 | Different tips are better for different applications |
| Loading tips 20μl | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
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