הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ'יימברס הדמיה חיים

Summary

Abstract

הדמיה תא חי הוא טכניקה חשוב ליישם מספר של רקמות תסיסנית המשמשים מודלים לחקור נושאים כגון מפרט ציר, התמיינות תאים ו organogenesis ^1. הכנה נכונה של דגימות הניסוי הוא מכריע, לעיתים קרובות מוזנחים, צעד. מטרת ההכנה היא להבטיח התאמה פיזיולוגית ולקבוע תנאים אופטימליים הדמיה. כדי לשמור על הכדאיות רקמות, חיוני כדי למנוע התייבשות, הידרדרות היפוקסיה, התחממות יתר או בינוני ^2.

תא הביצה תסיסנית היא מערכת מבוססת היטב לבחינת שאלות הנוגעות, אך לא רק, על דפוסים הגוף, לוקליזציה mRNA וארגון cytoskeletal ^3,4. עבור בתאי ביצה המוקדמות ו באמצע הבמה, גובר בשמן halocarbon טוב להישרדות כי היא מאפשרת דיפוזיה ללא חמצן, מונע התייבשות היפוקסיה ויש לו תכונות אופטיות מעולה במיקרוסקופ. Imההזדקנות של חלבונים ניאון ניתן באמצעות הכנסת transgenes לתוך תא ביצית או הזרקת הפיזי של רנ"א, חלבונים שכותרתו או נוגדנים ^5-7. לדוגמה, תוספת של MS2 בונה על הגנום של בעלי חיים המאפשרת תצפית בזמן אמת של mRNAs ב הביצית ^8. מבנים אלו מאפשרים על תווית vivo של ה-mRNA באמצעות ניצול האינטראקציה bacteriophage MS2 RNA גזע לולאה עם חלבון המעיל שלה ^9.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להוצאת השחלות, כמו גם בידוד ovarioles בודדים ותאי ביצה מ תסיסנית הנשי. לתיאור מפורט של תסיסנית oogenesis הכס אלן ג Spradling (1993, נדפס 2009) ^10.

Protocol

1. תסיסנית הכנה לפני לנתיחה (לפי א 'Gavis, אוניברסיטת פרינסטון)

1. מחק את המבוגרים מן הבקבוק זרע בדלילות ולהעביר את הבקבוק עד 25 ° C לקראת הניסוי. ברגע מבוגרים חדשים החלו לצוץ, לחכות יומיים.
2. קח בקבוקון המכיל כ 10 מ"ל זבוב של מזון מוצק להוסיף 0.5-0.7 גרם שמרים יבשים (ראו טבלה) על זווית של 45 מעלות. אין לכסות את כל פני השטח של אוכל לטוס עם שמרים.
3. הוסף כמה טיפות של מים ושמרים, די מימה (איור 1 א). מניחים את הבקבוקון על 45 מעלות ולאפשר כ 3 דקות שמרים כדי לספוג את המים (איור 1 ב).

הערה: לחילופין, שמרים premix להדביק בכלי נפרד ולהוסיף את העיסה כדי בקבוקון עם מרית.

4. להרדים את הזבובים בבקבוקון על ידי הזרקת גז CO _2. כאשר הם מפסיקים לנוע, רוקן את הזבובים לא מודעים על CO ₂
5. לבודד 10-15 נקבות ו 5 זכרים של הגנוטיפ הרצוי לפי היקף לנתח עם מברשת צבע יפה היטה (1D איור). גברים הם ברורים על ידי נוכחות של claspers, מבנה בולט כהה, ב האחורי שלהם.
6. הוסף זבובים שנבחרו בקבוקון yeasted (איור 1E). המקום של 25 מעלות צלזיוס במשך 24-60 שעות. דגירה לפרקי זמן קצרים יותר עבור אחוז גדול יותר של צעירים עד אמצע ביצים בתאי הבמה ובתקופות ארוכות יותר עבור בתאי ביצה בסוף שנות במה.

2. תסיסנית לנתיחה השחלה

1. מניחים טיפה קטנה של שמן halocarbon על מס '1.5, 22 x 50 מ"מ מכסה תלוש (איור 2 א). הגדר את תלוש כיסוי מוכן לצד שם זה לא יהיה בדרך.
2. להרדים את זבובים נתעב yeasted על ידי הזרקת CO ₂ גז עצה על כרית ₂ CO.
3. השתמש חדות בסדר חוטם מלקחיים לתפוס אדם פיטמה נקבה ב הקדמי של הבטן (לא בין הדואר הבטן בית החזה) (איור 2 ב-C).
4. להחזיק את הנקבה עם מלקחיים ולהציג תחת מיקרוסקופ לנתח, בערך 2-3 ס"מ מעל coverslip מוכן.
5. עדיין מחזיק ב הקדמי, להשתמש בקבוצה השנייה של מלקחיים כדי להסיר את הרקמה על האחורי הקיצוני של הנקבה (איור 2 ד). הערה: רקמת גוט בדרך כלל לשלוף עם תום האחורי. נגב את רקמת להסיר את מלקחיים.
6. בעודו מחזיק את הנקבה על הקדמי, השתמש מלקחיים שנמחקו כדי ללחוץ בעדינות או לעסות את הבטן, עובד הקדמי לכיוון האחורי. לעסות את הבטן באופן זהה הסרת משחת השיניים מהקצה של הצינור.
7. שני מבנים אטומים גדולים יהיה דחף מהבטן המקל בצד של מלקחיים (איור 2E-F). אלו הם השחלות לזווג.
8. לגעת השחלות על הנפט halocarbon בשקופית הבאה.
9. חזור על לנתיחה 1-2 פעמים כדי לתת סך של 4-6 השחלות בשמן על coverslip (Figurה 2G).

3. בידוד ovarioles

הערה: השחלה מכילה כ 16 ovarioles מורכב של 6 עד 10 חדרי ביצת בשלבים שונים המסודרים כמו חרוזים על חוט ^10.

הערה: לפני לבודד את ovarioles, להתאים את מקור האור על מיקרוסקופ לנתח כך הארה פוגעת בזווית שטוחה המדגם. זה נותן לעומת המדגם מאפשר הדמיה של בתאי ביצה צעירים הבמה.

1. בשמן, להפריד את שתי השחלות על ידי הסרת רקמת חיבור בקצה האחורי (שלבים ישנים) עם מלקחיים סגורים (איור 3 א).
2. אוריינט השחלה אדם עם בשלבים המבוגר ביותר בשלב שמאל הצעיר ימינה. הביצה צעירים בשלב חדרי בשחלה הם שקופים ויוצרים הקצה המחודד יותר של השחלה.
3. עם זוג מלקחיים ביד הדומיננטית, בעדינות לתפוס האחורי של השחלה, רצוי על ידי שרידי הדואר חיבור רקמות. בעוד מחזיק את השחלה במקום עם מלקחיים, להפעיל בדיקה לנתח (או מחט טונגסטן) כדי להקניט את ovarioles בודדים (איור 3 ב-D).

הערה: ovarioles אישיות ישבור בין בשלבים הצעירים (germarium לשלב 10) כמו בשלבים מבוגרים יותר הם גדולים מדי כדי להיפרד השחלה מלא.

הערה: ניקוב הביצית בשלב מאוחר עם החללית לנתח תגרום הציטופלסמה דולף לתוך השמן ולעשות להפקת ovarioles בודדים מאוד מאתגר. אם הביצית בשלב מאוחר הוא ניקב, לעבור השחלה טרי.

4. לאחר ovariole ללא השחלה, השתמש בדיקה לנתח לגרור אותו למרכז הירידה בנפט המזרח בכיוון הרצוי עבור הניסוי. הערה: Ovarioles בשמן יישב לדבוק הזכוכית.
5. חזור על תהליך זה (3.3-3.4) עד שיש 15-25 ovarioles בודדים. הערה: זה עשוי לדרוש דיסקציה של multipלה טמפ השחלות. כל התהליך אמור לקחת פחות מ -15 דקות.

הערה: מומלץ לנתח שחלה אחת לכל מספר מ זבובים ולא לנתח את שתי השחלות מ זבובים פחות להגדיל את מספר n של זבובים על הניסוי.

הערה: טיפול אגרסיבי מדי של ovariole תגרום ביציות לא בריאים והוא יכול להוביל חפצים בניסוי.

הערה: ביציות יתחילו להציג שינויים פנוטיפי בשל הלחץ 40 דקות לאחר גזור מן השחלה (השוו 7E איור ל-F).

6. לאחר ovarioles הם בכיוון נאותה (איור 3E), השתמש בדיקה הניתוח, מלקחיים סגורות להעביר עודפי רקמת השחלה מן השמן. חומר זה יכול להימחק מן מלקחיים על גבי מגבת נייר.

4. בידוד הפרט בסוף שנות ביצה הבמה חדרי (לפי א 'Gavis, אוניברסיטת פרינסטון)

1. עם זוג מלקחיים ב dominלעומת הנמלה, אחוז האחורי של השחלה מבודד, רצוי על ידי שרידי רקמות חיבור. בעוד מחזיק את השחלה במקום עם המלקחיים, להציג בדיקה לנתח את הקצה האחורי של השחלה הקרוב את מלקחיים (איור 4 א). הימנע ניקוב כל חדרי ביצים ידי הוספת בדיקה בין חדרי ביצה בסוף שנות הבמה.
2. משוך את איזמל המנתחים דרך השחלה עד יציאתו את הביצה לתאי המוקדמות הבמה (איור 4B). כאשר נעשה בצורה נכונה, בדיקה תסיר את רקמת החיבור מחזיק את ovarioles ומאוחר ביצים בתאי שלב למקום.
3. חזור על שלב 4.2 עד ovarioles פרושים על coverslip. הערה: כאשר בתאי ביצה נערמים כבר לא על גבי השני, שלב זה יושלם.
4. באמצעות בדיקה לנתח, להפריד בין ביציות המאוחרות, כדי לאפשר הדמיה קל (איור 4C).

הערה: ניקוב הביצית תוך לנתח בסוף שנות ביצה חדרי הבמה הוא לא מגנה כמו לנתח אניovarioles ndividual לשלבים צעירים יותר.

הערה: 14 חדרי הבמה ביצים, להשתמש במלקחיים כדי לתפוס את הנספחים הגב להתמצאות.

5. הזרקת הכנה

הערה: הזרקה של ביציות הבמה באמצע, המזרח ovarioles בניצב לציר הארוך של שובר את הכיסוי.

1. הפעל את המיקרוסקופ הדמיה [במקרה שלנו Core DeltaVision מ יישומי Precision] ו לטעון את ההגדרות המתאימות הדמיה (איור 5 א ', ב').
2. להפעיל את מנגנון הזרקה (איור 5 ג).
3. טען את מחט הזריקה עם קצה טוען (איור 5D-E). פתרונות להיות מוזרק יש centrifuged בקצרה במהירות גבוהה, כדי למנוע הפקדות שעשויות לחסום את המזרק.
4. צרף את המחט הזרקת טעון כדי ההזרקה. תשמרי על עצמך כדי לא להפר את המחט (איור 5F).
5. כדי לסייע עם מחטים איך לנקות, להוסיף קטע קטן של מ"מ זכוכית 2x10 מחתך או coverslip שבורלא צד אחד של טיפה שמן המכיל את ovarioles. ודא זה שבר זכוכית מכוסה בשמן. זכוכית זה ישמש ל-RAM קצה המחט נגד לשבירת או איך לנקות את המחט.

6. הזרקת RNA ניאון

לפני שתתחיל: הגדרת מנגנון הזרקת מיקרו המניפולטורים בקרות כאלה מחט הזריקה ממוקם מעל מרכז שדה הראייה.

1. הר המדגם להיות מוזרק על הבמה מיקרוסקופ.
2. בחר את המטרה 20x. מטרות ההגדלה גבוה יותר או נמוך יכול לשמש גם.

הערה: אם אתם משתמשים בשלב אוטומטית עם יכולת נקודת ביקור מומלץ לסמן כל שלב 8-9 ביציות עבור זריקה לפני תחילת. זה מאפשר ביקור קל הזרקת ביציות שנבחרו.

3. מנמיכים את מחט הזריקה עד שהוא נוגע הנפט. מרכז המחט עצה על העדשה אובייקטיבי.
4. לפנותאת האורות בחדר ולהדליק את האור הבהיר שדה של המיקרוסקופ. בחר את הנקודה הראשונה (הביצית) ברשימת נקודות ניכר. בעוד לעבור oculars, התמקדו הביצית (איור 6 א).
5. מנמיכים את המחט באופן ידני עד שהוא באותו המטוס של המוקד כמו הביצית וליד גלוי הביצית.
6. באמצעות הפקדים הפעלה, להעביר את חוד המחט הזרקת עד שהוא בתוך הביצית. תנועת דקירה מהירה בדרך כלל מוצלחת יותר מראש איטי. פעם אחת בפנים, להוציא נפח קטן מהמחט מבחינה חזותית להעריך את ההשפעות, לחזור לפי הצורך. אם הזריקה בהצלחה, הציטופלסמה בתוך הביצית ייעקרו ממקומם, אם זה לא ברור, חזור. זה לא צריך תמונה הקרינה כדי לקבוע אם החומר כבר הזריק. לאחר ההזרקה, להוציא את המחט מתוך הביצית (איור 6 ב-G).
7. הסכום המדויק של הנוזל מוזרק קשה לכמת. כדי להגביר את עוצמת הקול מוזרק, adjuרחוב לחץ או שעה של דופק זריקה, לשבור את קצה המחט כדי להגדיל את הפתיחה מעט או להשתמש פולסים הזרקה חוזרות ונשנות.

הערה: תהליך ההזרקה כל צריך לקחת פחות מ -10 שניות כאשר מבוצע כהלכה. רב דקירה או משתהה עם המחט בתוך הביצית תגרום נזק חמור תא הביצה.

8. לפני בחירת הביצית ניכרת הבאה, להעלות את מחט הזריקה מספיק גבוהה בשמן כדי לא ליצור קשר עם ביציות אחרים בנתיב הנסיעה.
9. על הביצית החדש, חזור על שלב 6.6. להמשיך בדרך זו עד שכל ביציות הנדרשים מוזרקים.

הערה: אם זו טעות הוא עשה תוך כדי הזרקה, מעבר הביצית המסומן הבא. אל תבזבזו זמן על ביציות פגומות.

הערה: המחט עשוי להיות סתומים במהלך הפגישה זריקה. במקרה זה, להזיז את המחט בסמוך פיסת זכוכית שבורה בשמן על coverslip. שנינותH זכוכית מחט המטוס מרחק אותו, בעדינות לתקוע את המחט לתוך כוס (איור 6 שעות). בדוק כי המחט מתפנה על ידי לחיצה על לחצן הזרקת ולראות אם הנוזל יוצא כל קצה המחט.

10. כאשר כל ביציות היה מוזרק, באופן ידני להעביר את המחט, מתוך הנפט לכוון אותו אל מחוץ לנתיב קרן של המיקרוסקופ. ודא כי היא בכיוון בטוח, כדי למנוע פגיעה בעין.

הערה: אם תקופה ממושכת של זמן שחלף בין בידוד ביצה קאמרית הזרקת ביצית, ביציות יהיה קשה להכניס ולהציג שינויים פנוטיפי הקשורים ללחץ. בעיות דומות עלולות להתעורר עם טיפול אגרסיבי מדי של הביצית או הזרקת כמויות עודפות (השוו 6I דמויות, J, K).

7. חיים הדמיה עיצוב ניסיוני

1. בחר את הביצית שהוחדר 1 מהרשימה. מבחן הזרקה היה בתוך הביצית על ידי מסגרת 1 הדמיה הקרינה ( באיור של 6G).
2. להגדיר את הפרמטרים של הניסוי, כולל: אורך גל עירור, נתיב הפליטה, הזמן עירור, Z-מחסנית זמן בין אוספים. הערה: לקבלת מידע נוסף על זה ר 'ר' פרטון, et al. (2010) ^2.
3. לאסוף את ערכת הנתונים.

8. נציג תוצאות

במבחנה מסונתז Alexa-546 grk RNA מוזרק Me31B :: GFP תא הביצה (7 א איור). RNA localizes כדי הקדמי הגב של הביצית ויוצר שווי סביב הגרעין (7 ב איור). לדוגמאות נוספות של לוקליזציה RNA לראות מקדוגל נ ', et al. (2003) ^11.

ביציות בשלב אמצע ומאוחר המבטאים חלבון הנקרא ניאון (טאו-GFP, איור 7C) או מערכות רנ"א תיוג (grk * mCherry, איור 7 ד) ניתן הדמיה ללא הזרקה.

באיור 1.

= "Jove_content">

איור 2.

איור 3.

באיור 4.

איור 5.

איור 6.

איור 7.

Discussion

הדמיה תא חי הוא assay עוצמה לבחינת תהליכים תאיים בזמן אמת. בנוסף תצפית פשוטה בתחום בהיר, הוספת תוויות ניאון כדי חלבונים RNAs של עניין יש להוביל לפריצות דרך רבות. כאן אנו התוויתי פרוטוקול ביציות הדמיה חיים בודדים שניתן לנצלם בשילוב עם מבחני גנטיים ביוכימיים.

בפרוטוקול זה, אנחנו גם מסבירים כיצד לתפעל באופן ניסיוני ביציות החיים בזריקה. קיימות אפשרויות רבות עבור חומר להזריק, כולל חוץ גופית ב-RNA מסונתז שכותרתו ניאון assay את היכולת של המבנה משני לוקליזציה RNA ישירה (כדור ו דייוויס, לא פורסם) וכן נוגדנים המעכבים את הפונקציה של חלבונים ^6. העבודה העתידית צפויה לראות את המבוא של רכיבים אחרים תיוג ומכונות הסלולר ביציות חיים המאפשרים המנגנונים המולקולריים להיבדק.

t "> שמירה על יכולת הקיום והבריאות של רקמה חיונית בעבודה עם תאים חיים. בפרוטוקול זה, אנו מציינים מספר צעדים שיכולים להוביל ללחץ של תא הביצה. לדוגמה, על אף היותו שמן מעולה עבור הדמיה, תרבות המורחבת בשמן יכול להוביל ללחץ על תא הביצה. זה ניתן לפקח בקלות על ידי בחינת המורפולוגיה עמדה גרעינית, קרום הביצית אשר לעוות ו בועה תחת לחץ (איור להשוות 7E (מוטעמות) כדי Figure7F תחת חשיפה לשדות בהיר ( הדגיש)). שלב 9 בתאי ביצה להראות לוקליזציה RNA של התא הגבול ההגירה מעל ¹² שעות מרובות. עם זאת, בשלב 7/8 תא הביצה תתחיל להציג תופעות לוואי בשמן פחמן הילה לאחר כ 40 דקות של השחלה סולקו מן נשים. מאוחרת ביצה הבמה חדרי, בשלב 11-14, יכול להתפתח בדרך כלל בשמן או בתקשורת מימית בגלל הפרשת מעטפת הביצית מתאי זקיק בכל השלבים האלה ^13. זה כבר reported כי תוספת של אינסולין עד בינוני חרק מימית יכול לשמור 9 ביציות הבמה עד 6 שעות ¹⁴ ו germaria עד 14 שעות ^15. בכל המקרים, תמרון אגרסיבי של תא הביצה יש להימנע, כפי שהוא מדגיש את ביציות ומפחית את יכולת הקיום שלה. הדמיה פחות בתאי ביצה ולדאוג לטיפול בכל בעדינות היא הדרך הטובה ביותר להבטיח את יכולת הקיום האופטימלי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning.
Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0)	Any Supplier		A good quality brush is important
Halocarbon Products Corporation, Series 95	Halocarbon Products Corp.		European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil.
Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T
Dumont No.5 - Dumostar	Fine Science Tools	11253-20	"Biologie" tip is also good but more fragile
Dissecting probe	Fine Science Tools	10140-01
Dissecting microscope	Olympus Corporation	SZ61
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)	European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads
KimCare	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Microscope- DeltaVision	Applied Precision	DC-CORE
Micromanipulator	Burleigh	Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300	http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo)
Injection apparatus	Tritech Research, Inc.	MINJ-1	Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips
Injection needle	Eppendorf	930000043	Different tips are better for different applications
Loading tips 20μl	Eppendorf	5242956.003
Dry active yeast	Fleischman’s	#2192