Summary
Abstract
Canlı hücre görüntüleme gibi eksen özellikleri, hücre farklılaşması ve organogenez 1 gibi konuları araştırmak için model olarak kullanılan Drosophila dokuların bir dizi uygulanan önemli bir tekniktir. Deney örneklerinin Doğru hazırlık çok önemli, ihmal, bir adımdır. Hazırlık amacı fizyolojik uygunluğu sağlamak ve optimal görüntüleme koşulları oluşturmaktır. Doku canlılığını korumak için, dehidratasyon, hipoksi, aşırı ısınma veya orta bozulma 2 önlemek için önemlidir.
Drosophila yumurta odası beden desenleme, mRNA lokalizasyon ve hücre iskeleti organizasyonu 3,4 ile sınırlı ilişkin soruları inceleyerek değil, iyi kurulmuş bir sistemdir. Erken ve orta dönem yumurta odaları için, halokarbon petrol montaj bu, oksijen serbest difüzyon sağlar dehidratasyon ve hipoksi önler ve mikroskopi için mükemmel optik özelliklere sahip olduğunu hayatta kalmak için iyidir. Imfloresan proteinlerin yaşlanma yumurta odası veya etiketli RNA, protein ya da 5-7 antikorların fiziksel enjeksiyon transgenlerin getirilmesi ile mümkündür. Örneğin, hayvanların genomuna MS2 yapıları Ayrıca yumurta 8'de mRNA'lar gerçek zamanlı gözlem sağlar. Bu yapıları da 9 kat protein ile MS2 bakteriyofaj RNA kök döngü etkileşim kullanımı yoluyla mRNA in vivo etiketleme için izin verir.
Burada, biz de dişi Drosophila tek tek ovaryolleri ve yumurta odaları izole olarak yumurtalıkların çıkarılması için bir protokol mevcut. Drosophila oogenez see Allan C. Spradling (1993, 2009 basıldı) 10 ayrıntılı bir açıklama için.
Protocol
Diseksiyon için önce 1. Drosophila hazırlığı (E. Gavis, Princeton Üniversitesi Göre)
- Seyrek ekilmiş şişe yetişkin atın ve ° C deneme öncesinde 25 şişe aktarın. Yeni yetişkin çıkmaya başladı sonra, iki gün bekleyin.
- Katı gıda yaklaşık 10 ml içeren bir sineğin şişeye atın ve 45 derecelik bir açı üzerinde kuru maya 0.5-0.7 gram (bkz. tablo) ekleyin. Maya ile sinek yiyecek tüm yüzeyi örtmeyin.
- Hidrat (Şekil 1A) için yeterli, maya için su birkaç damla ekleme. 45 derece şişe yerleştirin ve maya için yaklaşık 3 dakika su (Şekil 1B) kadar emmek için izin verir.
Not: Alternatif olarak, premix bir ayrı bir kapta yapıştırın maya ve bir spatula ile flakonuna salçayı ilave edin.
- CO 2 gazı enjekte edilerek şişe içinde sinekler uyutmak. Onlar hareket durdurduğunuzda, CO 2 üzerine bilinçsiz sinekler bahşiş
- Ince uçlu bir boya fırçası (Şekil 1D) ile bir diseksiyon kapsamında 10-15 kadın ve istenen genotip 5 erkek izole edin. Erkeklerde claspers varlığında, bunların arka tarafında koyu renkli bir çıkıntı yapı ile belirgindir.
- Mayalı flakon (Şekil 1E) seçilen sinekler ekleyin. 24-60 saat boyunca 25 ° C 'de yer. Orta aşamada yumurta odaları ve geç dönem yumurta odaları için daha uzun süreler için genç daha büyük bir yüzde daha kısa sürelerde inkübe edin.
2. Drosophila over diseksiyonu
- Bir No 1,5, 22 x 50 mm kapak kayma (Şekil 2A) üzerine halokarbon yağı, küçük bir damla yerleştirin. Bu şekilde olmayacak tarafına hazırlanmış kapak kayma ayarlanır.
- Bir CO 2 ped üzerine CO 2 gazı ve ucu enjekte mayalı aşağılık içinde sinekler uyutmak.
- (Değil tarihleri arasında bireysel bir karnın ön az kadın besiye kavramak için keskin ince burunlu forseps kullanmae karın ve göğüs) (Şekil 2B-C).
- Forseps ile kadın tutun ve kabaca 2-3 cm hazırlanmış coverslip yukarıda, bir mikroskop altında görmek.
- Hala ön az tutarak, kadın aşırı posterior (Şekil 2D) de doku çıkarmak için forseps ikinci bir set kullanabilirsiniz. Not: Gut doku genellikle posterior ucundan dışarı çeker. Forseps kaldırıldı doku silin.
- Hala ön kısmındaki kadın tutarken, yavaşça gerisinde ön çalışarak, karın sıkmak veya masaj sildi forseps kullanabilir. Bir tüp ucundan diş macunu kaldırılmasıyla aynı şekilde karın masaj yapın.
- İki büyük opak yapıları forseps (Şekil 2E-F) ucundaki karın ve sopa ile itilmiş olacaktır. Bu eşleştirilmiş yumurtalıklar vardır.
- Aşağıdaki slaytta halokarbon yağı üzerine yumurtalıklar dokunun.
- (Figür coverslip üzerine yağda 4-6 yumurtalıkların toplam vermek için diseksiyon 1-2 kez tekrarlayıne 2G).
3. Yalıtımlı ovaryolleri
Not: Her bir ovaryum bir dize 10 boncuk gibi dizilmiş farklı aşamalarında 6 ile 10 yumurta odalarından oluşan yaklaşık 16 ovaryolleri içerir.
Not: Ön ovaryolleri izole etmek aydınlatma örnek sığ bir açıyla çarptığı, böylece mikroskop üzerinde ışık kaynağı ayarlayın. Bu örnek bir kontrast sağlar ve genç aşamada yumurta odaları görselleştirme sağlar.
- Yağ olarak, kapalı forseps (Şekil 3A) ile arka ucunu (eski aşamaları) azından bağlayan doku kaldırarak iki yumurtalık ayırmak.
- Sağa sola ve genç sahneye en eski aşamaları ile Orient bireysel over. Overde genç aşamada yumurta odaları şeffaf ve yumurtalık daha sivri ucunu oluşturur.
- Dominant el forseps bir çift ile, hafifçe tercihen th kalıntılarından, bir yumurtalık arka kavramake bağ dokusu. Forseps ile yerde over tutarken, bireysel ovaryolleri (Şekil 3B-D) didiklemek için (veya tungsten iğne) Bir kesme prob kullanın.
Not: eski aşamalarında tam yumurtalıktan ayrılması için çok büyük olduğu gibi bireysel ovaryolleri genç aşamaları (germarium 10 sahneledi) arasında kıracak.
Not: diseksiyon prob ile geç evre oosit batırılarak yağ sızması sitoplazma neden ve bireysel ovaryolleri çıkarılması çok zor hale getirecek. Geç bir aşamada oosit delinirse, taze bir yumurtalık taşımak.
- Ovariole over ücretsizdir sonra, deneme için istenen yönde yağ damlası ve doğunun merkezine sürükleyin diseksiyon prob kullanın. Not: yağda ovaryolleri yerleşmek ve cama yapışır.
- 15-25 bireysel ovaryolleri kadar bu süreci (3,3-3,4) tekrarlayın. Not: Bu multip diseksiyonu gerektirebilirle yumurtalıklar. Tüm süreç 15 dakikadan az sürer.
Not: Daha çok deney için sineklerin n sayısını artırmak için daha az sinek her iki yumurtalık diseksiyon daha birçok sineklerden bir yumurtalık her teşrih tavsiye edilir.
Not: ovariole Kaba işleme sağlıksız oosit neden olur ve deneyde eserler yol açabilir.
Not: Oosit over (F Şekil 7E karşılaştırın) diseke edildikten sonra 40 dakika stres nedeniyle fenotipik değişiklikleri görüntülemek için başlayacaktır.
- Bir kez ovaryolleri yeterli bir oryantasyon (Şekil 3E) vardır, yağ fazlalığı yumurtalık dokusu dışına taşımak için diseksiyon prob ve kapalı forseps kullanabilir. Bu malzeme bir kağıt havlu üzerine forseps silinebilir.
4. Yalıtımlı bireysel geç dönemde yumurta odaları (E. Gavis, Princeton Üniversitesi Göre)
- Domin forseps bir çift ilekarınca yandan, tercihen bağ dokusunun kalıntıları tarafından, izole edilmiş bir yumurtalık posterior kavramak. Forseps ile yerde over tutarken, forseps yakın over (Şekil 4A) arka ucunu diseksiyon prob tanıtmak. Geç dönemde yumurta odacıkları arasındaki probu takarak herhangi bir yumurta odaları delinmesiyle kaçının.
- Erken evre yumurta odaları (Şekil 4B) az çıktığında kadar over ile diseksiyon iğnesi çekin. Doğru yapıldığı zaman, sonda yer ovaryolleri ve geç dönem yumurta odaları tutan bağ dokusu kaldıracaktır.
- Ovaryolleri coverslip üzerine serilen kadar 4.2 adımı yineleyin. Not: Yumurta odaları artık birbirlerinin üstüne yığılmış zaman, bu adımı tamamlandı.
- Anatomi prob kullanarak, kolay görüntüleme (Şekil 4C) izin vermek için geç oosit ayırın.
Not: İleri evre yumurta odaları diseksiyon sırasında bir oosit delme i diseksiyon gibi kınayan gibi değilgenç aşamaları için ndividual ovaryolleri.
Not: Sahne 14 yumurta odaları için yönlendirme için dorsal uzantıları kavramak için forseps kullanabilir.
5.. Enjeksiyon hazırlığı
Not: orta evre oositlerin enjeksiyon için, şark ovaryolleri dik kapak kayma uzun eksenine.
- [Olgumuzda Uygulamalı Hassas bir DeltaVision Çekirdek] görüntüleme mikroskop açın ve uygun görüntüleme ayarları (Şekil 5A-B) yükleyin.
- Enjeksiyon aparatı (Şekil 5C) açın.
- Bir yükleme ucu (Şekil 5D-E) ile enjeksiyon iğnesi yükleyin. Enjekte edilecek Çözümler enjeksiyon iğnesi engelleyebilir birikmeleri önlemek için yüksek hızda kısaca santrifüj edilmelidir.
- Enjektör için yüklenen enjeksiyon iğnesi takın. Iğne (Şekil 5F) bozulmaması için özen gösterin.
- Tıkanıklıkları açar iğne yardımcı olmak için, bir kesik veya kırık coverslip bir cam 2x10 mm'lik küçük bir parça yerovaryolleri içeren yağ damla t bir tarafı. Bu cam parçası petrole bulanmış olduğundan emin olun. Bu cam iğne kırılma veya tıkanıklıkları açar için karşı ram iğne ucu kadar hizmet verecek.
6. Floresan RNA Enjeksiyon
Başlamadan önce: enjeksiyon cihazı ve bir iğne görüş alanının merkezi üzerinde konumlandırılmış bu tür mikro-manipülatör kontrolleri ayarlayın.
- Mikroskop sahnede enjekte edilecek örnek monte edin.
- 20x hedefi seçin. Daha yüksek veya daha düşük bir büyütme amaçları da kullanılabilir.
Not: nokta Ziyaret yeteneği ile otomatik bir sahne kullanılarak Eğer enjeksiyon için 8-9 oosit başlamadan önce tüm sahneye işaretlemek için tavsiye edilir. Bu kolay Ziyaret ve seçilmiş oosit enjeksiyon için izin verir.
- Bu yağ değene kadar enjeksiyon iğnesi indirin. Objektif lens üzerinden Merkezi'nde iğne ucu.
- ÇevirmekOdanın lambalarını kapatın ve mikroskop için parlak alan ışığı açın. İşaretli noktaları listesinde ilk noktaya (oosit) seçin. Oküler bakarken, oosit (Şekil 6A) odaklanır.
- Bu oosit ve oosit görünür gelecek gibi odak aynı düzlemde kadar elle iğne indirin.
- Bunun içindeki yumurta olduğu kadar, manipülatör kullanılarak kontroller, enjeksiyon iğne noktası hareket eder. Hızlı bir bıçaklama hareketi genellikle yavaş bir ilerleme daha başarılı olur. İçeri girdikten sonra, iğnenin küçük bir hacim çıkarın ve görsel etkilerinin değerlendirilmesi, gerektiği gibi tekrarlayın. Enjeksiyon başarılı olursa bu, tekrar belirgin değilse, oosit içine sitoplazma, yerinden edilecektir. Bu malzeme enjekte edilmiş olup olmadığını belirlemek üzere floresans görüntü için gerekli değildir. Enjeksiyondan sonra, oosit (Şekil 6B-G) içindeki iğne çıkarılır.
- Enjekte edilen sıvı miktarını kesin olarak ölçmek için zordur. Enjekte edilen hacim, adju artırmak içinenjeksiyon nabız basıncı veya zaman st, biraz açılış artırmak veya tekrarlanan enjeksiyon darbeleri kullanmak iğne ucu bölünürler.
Not: düzgün çalıştırıldığında tüm enjeksiyon işlemi 10 saniyeden daha az almalıdır. Bıçaklama veya oosit için iğne içinde olan kalıcı kapsamlı yumurta odasına ciddi hasara neden olur.
- Sonraki işaretli oosit seçmeden önce, böylece seyahat yoldaki diğer oosit temas etmeyecek yağ enjeksiyon iğnesi yeterince yüksek yükseltmek.
- Yeni oosit anda, adım 6.6 tekrarlayın. Gerekli tüm oositler enjekte kadar bu sekilde devam ediyor.
Not: katarken, bir hata yapılırsa, sonraki işaretlenmiş oosit geçmek. Hasarlı oositlerde zaman kaybetmeyin.
Not: iğne enjeksiyonu oturumu sırasında tıkanmış olabilir. Bu durumda, coverslip üzerindeki yağ içinde cam parçası kırık iğne bitişik hareket eder. Zekâh aynı odak düzlemi içinde cam ve iğne, yavaşça cam (Şekil 6H) içine iğne koç. Iğne enjeksiyon düğmesini iterek ve herhangi bir sıvı çıkar iğne ucu olmadığına bakarak unclogged olduğunu test edin.
- Tüm oositler enjekte edilmiştir zaman, elle mikroskop için ışın yolu petrol ve şark dışarı dışarı, iğne yukarı hareket ettirin. Bunu göz hasarı önlemek için, güvenli bir yönelim olduğundan emin olun.
Not: Uzun bir süre yumurta odasına izolasyon ve oosit enjeksiyon arasında geçmiş ise, oosit stresle ilişkili fenotipik değişiklikler ekleme ve sergilemek zor olacak. Benzer sorunları oosit veya aşırı hacimli enjeksiyon (Şekil 6i karşılaştırmak, J, K) kaba işleme ile ortaya çıkabilir.
7. Görüntüleme deneysel tasarım Canlı
- Listeden ilk enjekte oosit seçin. Enjeksiyon floresans görüntüleme bir çerçeveden (a tarafından yumurta içinde olduğu TestiŞekil 6g s).
- Dalgaboyu, emisyon yolu, uyarılma süresi, Z-yığını ve koleksiyonları arasında zaman: dahil, deneysel parametreleri, yapılandırın. Not: Bu ile ilgili daha fazla bilgi için bkz: Parton R., ve ark. (2010) 2.
- Veri seti toplayın.
8. Temsilcisi Sonuçlar
Alexa-546 GRK RNA sentez in vitro bir Me31B :: GFP yumurta haznesi (Şekil 7A) içine enjekte edildi. RNA oosit dorsal anterior lokalize ve çekirdeğin etrafında bir kap (Şekil 7B) oluşturur. RNA yerelleştirme daha fazla örnek için MacDougall N., ve ark. (2003) 11.
Floresan etiketli proteini (Tau-GFP, Şekil 7C) veya RNA etiketleme sistemleri (GRK * mCherry, Şekil 7D) ifade Orta ve geç evre oosit enjeksiyonu olmadan görüntülenebilir.
Şekil 1..
Şekil 2.
Şekil 3.
Şekil 4.
Şekil 5.
6 Şekil.
Şekil 7.
Discussion
Canlı hücre görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücresel süreçler incelenmesi için güçlü bir tahlil oluşturmaktadır. Basit parlak saha gözlem ek olarak, proteinler ve ilgi RNA'lar için flüoresan etiketlerin Ayrıca çok önemli gelişmeler yol açmıştır. Burada genetik ve biyokimyasal testler ile birlikte kullanılabilir görüntüleme bireysel yaşam oositler için bir protokol özetlediğim.
Bu protokol, biz de deneysel enjeksiyon yoluyla yaşam oosit işlemek için nasıl açıklayabilir. Doğrudan bir RNA Lokalizasyon (Ball ve Davis, yayınlanmamış) ve proteinlerin 6 işlevini inhibe antikorlar deneyi için ikincil bir yapının özelliği flüoresan etiketli RNA sentez in vitro dahil olmak üzere enjekte etmek için malzeme için pek çok olasılık, bulunmaktadır. Gelecekteki çalışmalar olasılıkla diğer etiketleme bileşenleri ve moleküler mekanizmaları test edilmesi sağlanarak yaşam oosit hücresel makine tanıtımı göreceksiniz.
t "> canlı hücreler çalışırken dokusunun canlılığını ve sağlık esastır. korunması bu protokol, biz yumurta odasının strese yol açabilecek bir dizi adım işaret. Örneğin, petrol görüntüleme için üstün olmasına rağmen, petrol genişletilmiş kültür yumurta odasında stres neden olabilir. Bu kolay (Figure7F için Şekil 7E (stressiz) karşılaştırmak (stres altında deforme ve bleb edecek nükleer morfoloji ve konumu, oosit zarı inceleyerek parlak alan maruziyeti altında izlenebilir )) vurguladı. Sahne 9 yumurta odaları RNA lokalizasyon ve çoklu saat boyunca sınır hücre migrasyonu 12 gösteriyor. Ancak, bir sahne 7/8 yumurta odasına kaldırılıyor over yaklaşık 40 dakika sonra halo karbonlu yağ kötü etkileri sergilemeye başlayacak kadın. Geç aşamada yumurta odaları, 14 sahne 11, çünkü bu aşamalar 13 folikül hücrelerinden yumurta kabuğu salgılanması yağı veya sulu ortam ya da normal gelişebilir. Bu repo oldusulu böcek orta insülin Ayrıca 6 saate 14 ve germaria kadar 14 saat 15 için sahne 9 oosit koruyabilirsiniz rted. Bu oosit vurguluyor ve canlılığı azaltır gibi tüm durumlarda, yumurta odasının agresif manevralar, kaçınılmalıdır. Görüntüleme yumurta odaları az ve tedavi etmek için özen her yavaşça optimum canlılığı sağlamak için en iyi yoldur.Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma I. Davis için bir Wellcome Trust Kıdemli Araştırma Bursu ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning. | |||
| Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0) | Any Supplier | A good quality brush is important | |
| Halocarbon Products Corporation, Series 95 | Halocarbon Products Corp. | European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil. |
|
| Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T | |
| Dumont No.5 - Dumostar | Fine Science Tools | 11253-20 | "Biologie" tip is also good but more fragile |
| Dissecting probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| CO2 pad |  Genesee Scientific |
59-114 (789060 Dutscher) | European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads |
| KimCare | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
| Microscope- DeltaVision | Applied Precision | DC-CORE | |
| Micromanipulator | Burleigh | Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300 | http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo) |
| Injection apparatus | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips |
| Injection needle | Eppendorf | 930000043 | Different tips are better for different applications |
| Loading tips 20μl | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
References
- Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol. Biol. 420, 1-25 (2008).
- Parton, R. M., Valles, A. -M., Dobbie, I. D., Davis, I. Pushing the Limits of Live Cell Imaging in Drosophila. Live Cell Imaging: A Laboratory. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 387-418 (2010).
- Johnston, D. Moving messages: the intracellular localization of mRNAs. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (5), 363-375 (2005).
- Jansen, R. mRNA Localization: Message on the Move. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 247-256 (2001).
- Van De Bor, V., Hartswood, E., Jones, C., Finnegan, D., Davis, I. gurken and the I factor retrotransposon RNAs share common localization signals and machinery. Dev. Cell. 9 (1), 51-62 (2005).
- Delanoue, R., Herpers, B., Soetaert, J., Davis, I., Rabouille, C. Drosophila Squid/hnRNP helps Dynein switch from a gurken mRNA transport motor to an ultrastructural static anchor in sponge bodies. Dev. Cell. 13 (4), 523-538 (2007).
- Jaramillo, A. M., Weil, T. T., Goodhouse, J., Gavis, E. R., Schupbach, T. The dynamics of fluorescently labeled endogenous gurken mRNA in Drosophila. J. Cell. Sci. 121 (Pt. 6), 887-894 (2008).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous mRNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr. Biol. 13, 1159-1168 (2003).
- Bertrand, E. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol. Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).
- MacDougall, N., Clark, A., MacDougall, E., Davis, I. Drosophila gurken (TGFalpha) mRNA localizes as particles that move within the oocyte in two dynein-dependent steps. Dev. Cell. 4 (3), 307-319 (2003).
- Tekotte, H., Tollervey, D., Davis, I. Imaging the migrating border cell cluster in living Drosophila egg chambers. Dev. Dyn. 236 (10), 2818-2824 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R., Davis, I., Gavis, E. R. Changes in bicoid mRNA anchoring highlight conserved mechanisms during the oocyte-to-embryo transition. Curr. Biol. 18, 1055-1061 (2008).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
