Summary
Il
Abstract
Imaging cellulare Live è una tecnica importante applicata ad un certo numero di tessuti Drosophila utilizzati come modelli per studiare argomenti come specifica asse, la differenziazione cellulare e organogenesi 1. Corretta preparazione dei campioni sperimentali è cruciale, spesso trascurata, passo. Lo scopo della preparazione è quello di garantire rilevanza fisiologica e di creare le condizioni ottimali di imaging. Per mantenere la vitalità del tessuto, è fondamentale per evitare la disidratazione, ipossia, deterioramento surriscaldamento o terreno 2.
La camera di Drosophila uovo è un sistema ben stabilito per esaminare questioni relative, ma non limitata, a patterning corpo, localizzazione mRNA e l'organizzazione del citoscheletro 3,4. Per le camere di uova prime e mid-stage, montaggio in Halocarbon è buono per la sopravvivenza, in quanto permette di libera diffusione di ossigeno, previene la disidratazione e ipossia e ha eccellenti proprietà ottiche per la microscopia. Iminvecchiamento di proteine fluorescenti è possibile mediante l'introduzione di transgeni nella camera di iniezione dell'uovo o fisica di RNA marcati, proteine o anticorpi 5-7. Ad esempio, aggiunta di MS2 costrutti al genoma di animali permette l'osservazione in tempo reale del mRNA nell'oocita 8. Questi costrutti consentono di etichettatura in vivo dell'mRNA attraverso l'utilizzo delle interazioni MS2 circuito batteriofago staminali RNA con la sua proteina di rivestimento 9.
Qui, presentiamo un protocollo per l'estrazione delle ovaie e isolare ovarioles individuali e camere uova dalla femmina Drosophila. Per una descrizione dettagliata di Drosophila oogenesi cfr Allan C. Spradling (1993, ristampa 2009) 10.
Protocol
1. Drosophila preparazione preliminare per la dissezione (Secondo E. Gavis, Princeton University)
- Eliminare gli adulti da una bottiglia poco seminati e trasferire il flacone a 25 ° C in anticipo del vostro esperimento. Una volta che nuovi adulti hanno cominciato ad emergere, aspettare due giorni.
- Prendete un flacone contenente circa 10 ml fly di cibo solido e aggiungere 0,5-0,7 grammi di lievito secco (vedi tabella) su un angolo di 45 gradi. Non coprire l'intera superficie del cibo mosca con il lievito.
- Aggiungere poche gocce d'acqua per il lievito, sufficiente per idratare (Figura 1A). Posizionare il flacone a 45 gradi e consentire circa 3 minuti per il lievito di assorbire l'acqua (Figura 1B).
Nota: In alternativa, premiscela un lievito pasta in un contenitore separato e aggiungere la pasta alla fiala con una spatola.
- Anestetizzare le mosche nel flacone iniettando CO 2 gas. Quando si interrompe il movimento, punta le mosche inconsci sul CO 2
- Isolare 10-15 femmine e 5 maschi del genotipo desiderato in un ambito dissezione con un pennellino a punta di vernice (Figura 1D). I maschi sono evidenti dalla presenza di appendici, una struttura scuro sporgente, a loro posteriore.
- Aggiungi mosche selezionati al flaconcino yeasted (Figura 1E). Posto a 25 ° C per 24-60 ore. Incubare per periodi di tempo più brevi per una percentuale maggiore di giovani nelle camere a metà stadio di uova e periodi di tempo più lunghi per camere di ritardo stadio di uova.
2. Drosophila dell'ovaio dissezione
- Mettere una piccola goccia di olio su un alocarburo No. 1.5, 22 x 50 coprioggetto mm (Figura 2A). Impostare la slittamento preparato coperchio sul lato dove non sarà in modo.
- Anestetizzare le mosche in vile yeasted iniettando CO 2 gas e punta su un CO 2 pad.
- Utilizzare taglienti fine-naso pinze per afferrare un individuo ingrassato femminile la parte anteriore dell'addome (non tra the addome e torace) (Figura 2B-C).
- Tenere la femmina con le pinze e visualizzare sotto un microscopio da dissezione, circa 2-3 cm sopra il vetrino preparato.
- Sempre tenendo al anteriore, utilizzare una seconda serie di pinze per rimuovere il tessuto alla estrema posteriore della femmina (Figura 2D). Nota: il tessuto Gut di solito tirare fuori con l'estremità posteriore. Pulire il tessuto rimosso dalle pinze.
- Mentre ancora in mano la femmina al anteriore, utilizzare le pinze spazzato per spremere delicatamente o massaggiare l'addome, lavorando anteriore verso la parte posteriore. Massaggiare l'addome nello stesso modo come la rimozione dentifricio dalla estremità di un tubo.
- Due grandi strutture opache sarà spinta con l'addome e bastone sulla estremità della pinza (Figura 2E-F). Queste sono le ovaie accoppiati.
- Toccare le ovaie sul Halocarbon nella diapositiva seguente.
- Ripetere la dissezione 1-2 volte per un totale di 4-6 ovaie nell'olio sul coprioggetto (Figure 2G).
3. Ovarioles isolamento
Nota: Ogni ovaio contiene circa 16 ovarioles composte da 6 a 10 camere uovo di diverse fasi disposte come perle di una collana 10.
Nota: prima di isolare il ovarioles, regolare la sorgente luminosa sul microscopio da dissezione modo che l'illuminazione colpisce con un angolo piccolo al campione. Questo dà contrasto con il campione e consente la visualizzazione delle camere giovani stadio di uova.
- Nel olio, separare le due ovaie rimuovendo il tessuto connettivo all'estremità posteriore (stadi vecchi) con pinza chiusa (Figura 3A).
- Orient un ovaio individuo con le più antiche fasi alla sinistra del palco e il più giovane a destra. I giovani camere stadio di uovo nelle ovaie sono trasparenti e costituiscono la fine più appuntita delle ovaie.
- Con un paio di pinze in mano dominante, afferrare delicatamente il posteriore di un ovaio, preferibilmente con i resti del the tessuto connettivo. Tenendo l'ovario in posizione con le pinzette, utilizzare una sonda dissezione (o ago di tungsteno) per prendere in giro fuori ovarioles individuali (Figura 3B-D).
Nota: ovarioles individuali si romperà tra le fasi di giovani (germarium di mettere in scena 10), gli stadi più vecchi sono troppo grandi per essere separato dal ovaio pieno.
Nota: si fora un ovocita in ritardo palco con la sonda dissezione si tradurrà in perdite nel citoplasma l'olio e fare l'estrazione di singoli ovarioles molto impegnativo. Se un ovocita fase avanzata viene forato, passare a un ovaio fresco.
- Una volta che il ovariole è libero dell'ovaio, utilizzare la sonda dissezione per trascinare al centro della goccia di olio e orientare l'orientamento desiderato per l'esperimento. Nota: Ovarioles in olio si sistemerà e aderire al vetro.
- Ripetere questo processo (3,3-3,4) fino a quando ci sono 15-25 ovarioles individuali. Nota: Questo può richiedere la dissezione di multipLe ovaie. L'intero processo dovrebbe prendere meno di 15 minuti.
Nota: Si consiglia di sezionare un ovaio ciascuno da mosche diverse, piuttosto che sezionare entrambe le ovaie da un minor numero di mosche per aumentare il numero n di mosche per l'esperimento.
Nota: la gestione approssimativa della ovariole si tradurrà in ovociti sani e può portare ad artefatti nell'esperimento.
Nota: Gli oociti inizieranno a visualizzare i cambiamenti fenotipici dovuti a stress 40 minuti dopo essere stato sezionato dall'ovaio (confronta 7E figura a F).
- Una volta ovarioles sono in un orientamento adeguato (Figura 3E), utilizzare la sonda e la dissezione pinza chiusa per spostare eccesso di tessuto ovarico dal petrolio. Questo materiale può essere cancellato dalla pinza su un tovagliolo di carta.
4. Isolamento dei singoli stadi tardivi camere d'uovo (Secondo E. Gavis, Princeton University)
- Con una coppia di pinze in Dominant mano, afferrare la parte posteriore di un ovaio isolato, preferibilmente con i resti del tessuto connettivo. Tenendo l'ovario in posizione con le pinze, introdurre la sonda dissezione nell'estremità posteriore dell'ovaio vicino alle pinze (Figura 4A). Evitare la puntura camere a uovo inserendo la sonda tra le camere tardo stadio di uova.
- Estrarre l'ago attraverso la dissezione ovaio finché uscite dei primi camere stadio di uova (Figura 4B). Se fatto correttamente, la sonda verrà rimosso il tessuto connettivo che detiene le ovarioles e tardo camere stadio di uova in atto.
- Ripetere il punto 4.2 fino alla ovarioles sono steso sul vetrino. Nota: Quando camere uova non sono più impilati uno sopra l'altro, questo passaggio è completo.
- Utilizzando la sonda dissezione, separare gli ovociti fine di consentire un facile per l'imaging (Figura 4C).
Nota: Puntura un ovocita, mentre la dissezione fine camere stadio di uova non è come una condanna come con i dissezioneovarioles ndividual per i più giovani stadi.
Nota: Per stage 14 camere d'uovo, usare le pinze per afferrare le appendici dorsali per l'orientamento.
5. Iniezione di preparazione
Nota: Per l'iniezione degli ovociti stadio metà, orientare il ovarioles perpendicolarmente all'asse longitudinale del coprioggetto.
- Accendere il microscopio di imaging [nel nostro caso un Core DeltaVision da Applied Precision] e caricare le impostazioni di imaging appropriate (Figura 5A-B).
- Accendere il dispositivo di iniezione (Figura 5C).
- Caricare l'ago per iniezione con una punta di carico (Figura 5D-E). Le soluzioni da iniettare deve essere centrifugati brevemente ad alta velocità per evitare depositi che potrebbero bloccare l'ago di iniezione.
- Applicare l'ago caricato iniezione all'iniettore. Fare attenzione per evitare di rompere l'ago (Figura 5F).
- Per assistere con aghi unclogging, mettere un piccolo pezzo di vetro, 2x10 millimetri da un taglio o rottura di un vetrinot un lato della goccia olio contenente i ovarioles. Assicurarsi che questo frammento di vetro coperti di olio. Questo vetro servirà a ram la punta dell'ago contro per la rottura di stasare l'ago.
6. Iniezione di fluorescenza dell'RNA
Prima di iniziare: Sistemare il dispositivo di iniezione e micro-manipolazione di tali controlli che l'ago per l'iniezione è posizionata sopra il centro del campo visivo.
- Montare il campione da iniettare sul microscopio scena.
- Selezionare l'obiettivo 20x. Obiettivi di ingrandimento superiori o inferiori possono anche essere utilizzati.
Nota: Se si utilizza una fase automatizzata con possibilità di visitare il punto è consigliabile segnare tutta la fase di 8-9 ovociti per l'iniezione prima di cominciare. Ciò consente un facile e per visitare iniezione di ovociti selezionati.
- Abbassare l'ago di iniezione fino a toccare l'olio. Centrare la punta dell'ago sulla lente dell'obiettivo.
- Girarespegnere le luci in camera e accendere la luce in campo chiaro per il microscopio. Selezionare il primo punto (ovocita) sulla lista marcato punti. Mentre si guarda attraverso gli oculari, concentrarsi su l'ovocita (Figura 6A).
- Abbassare l'ago manualmente fino a che è nello stesso piano di messa a fuoco come l'oocita e visibile successivo l'uovo.
- Utilizzando i controlli manipolatore, spostare il punto di iniezione dell'ago finché è all'interno del ovocita. Un movimento veloce accoltellamento è spesso più successo di un progresso lento. Una volta all'interno, espellere un piccolo volume dall'ago e valutare visivamente gli effetti, ripetere come richiesto. Se l'iniezione è riuscita, il citoplasma all'interno dell'ovocita sarà spostato, se ciò non sia evidente, ripetizione. Non è necessario immagine in fluorescenza per determinare se il materiale è stato iniettato. Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago dall'interno l'ovocita (Figura 6B-G).
- L'esatta quantità di fluido iniettato è difficile quantificare. Per aumentare il volume iniettato, regost la pressione o il tempo dell'impulso di iniezione, rompere la punta dell'ago per aumentare l'apertura leggermente o utilizzare impulsi di iniezione ripetute.
Nota: Il processo di iniezione intero dovrebbe richiedere meno di 10 secondi quando viene eseguito correttamente. Ampia lancinante o persistente, con l'interno ago per ovocita provocherà gravi danni alla camera di uovo.
- Prima di selezionare il successivo ovocita marcata, sollevare l'ago di iniezione ad alta abbastanza nell'olio per non entrare in contatto oociti altri nel percorso di viaggio.
- Al ovocita nuovo, ripetere il punto 6.6. Proseguire in questo modo fino a che tutti gli ovociti necessari vengono iniettati.
Nota: Se viene commesso un errore durante l'iniezione, passare al successivo ovocita segnato. Non perdere tempo su ovociti danneggiati.
Nota: L'ago può ostruirsi nel corso di una sessione di iniezione. In questo caso, spostare l'ago adiacente al pezzo di vetro rotto nell'olio sul vetrino. Spiritoh il vetro e l'ago nello stesso piano focale, delicatamente ariete l'ago nel bicchiere (Figura 6H). Verificare che l'ago è unclogged premendo il pulsante di iniezione e vedere se il liquido esce dalla punta dell'ago.
- Quando tutti gli oociti sono stati iniettati, spostare manualmente l'ago, dall'olio e orientarla fuori del percorso del fascio per il microscopio. Assicurarsi che sia in un orientamento sicuro, per evitare danni agli occhi.
Nota: Se un lungo periodo di tempo trascorso tra l'isolamento delle uova da camera e l'iniezione degli ovociti, ovociti sarà difficile da iniettare ed esporre cambiamenti fenotipici associati a stress. Problemi simili possono sorgere con la gestione approssimativa del ovocita o iniezione di volumi in eccesso (confrontare 6I figure, J, K).
7. Live disegno sperimentale di imaging
- Selezionare la ovocita prima iniettato dalla lista. Test che l'iniezione era dentro l'ovocita per immagini un fotogramma in fluorescenza (as in Figura 6G).
- Configurare i parametri sperimentali, tra cui: lunghezza d'onda di eccitazione, percorso emissione, tempo di eccitazione, Z-stack e il tempo tra le collezioni. Nota: per ulteriori informazioni su questo, vedere Parton R., et al. (2010) 2.
- Raccogliere il set di dati.
8. Risultati rappresentativi
In vitro sintetizzato Alexa-546 Grk RNA iniettata in un Me31B :: GFP uovo camera (Figura 7A). L'RNA localizza anteriore dorsale dell'ovocita e forma un tappo attorno al nucleo (Figura 7B). Per ulteriori esempi di localizzazione di RNA vedere MacDougall N., et al. (2003) 11.
Ovociti stadio metà e alla fine esprimono proteina fluorescente marcato (Tau-GFP, Figura 7C) o sistemi di tagging RNA (GRK * mCherry, Figura 7D) può essere ripreso senza iniezione.
Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4.
Figura 5.
Figura 6.
Figura 7.
Discussion
Imaging cellulare Live è un potente test per l'esame processi cellulari in tempo reale. Oltre a semplice osservazione campo luminoso, l'aggiunta di etichette fluorescenti per proteine e RNA di interesse ha portato a molte innovazioni. Qui abbiamo delineato un protocollo di ovociti viventi imaging individuali che possono essere utilizzati in combinazione con analisi genetiche e biochimiche.
In questo protocollo, spieghiamo anche come manipolare sperimentalmente ovociti viventi mediante iniezione. Ci sono molte possibilità per materiale da iniettare, anche in vitro sintetizzato fluorescenti RNA etichettati per saggiare la capacità di una struttura secondaria di RNA diretta localizzazione (Ball e Davis, inedito) e gli anticorpi che inibiscono la funzione delle proteine 6. I lavori futuri si potrebbe vedere l'introduzione di componenti di etichettatura e altri macchinari cellulare di ovociti di vita che consentano meccanismi molecolari da testare.
t "> Preservare la vitalità e la salute del tessuto è essenziale quando si lavora con cellule vive. In questo protocollo, si segnala una serie di passi che possono portare allo stress della camera di uovo. Ad esempio, nonostante l'olio essere superiore per l'imaging, cultura estesa nell'olio, possono generare stress sulla camera uovo. Questo può essere facilmente monitorato in condizioni di esposizione campo chiaro esaminando la morfologia nucleare e la posizione, la membrana dell'ovocita che distorcere e bleb sotto stress (cfr. Figura 7E (non accentata) a Figure7F ( sottolineato)). Fase 9 camere uovo mostrano la localizzazione di RNA e la migrazione delle cellule oltre confine 12 ore più. Tuttavia, una fase 7/8 da camera uovo inizierà a mostrare effetti negativi in olio di carbonio halo dopo circa 40 minuti di ovaio viene rimosso dal di sesso femminile. tardo camere d'uovo, Stadio 11 a 14, può svilupparsi normalmente in petrolio o mezzi acquosi causa della secrezione del guscio d'uovo dalle cellule del follicolo in queste fasi 13. E 'stato repoRIPO che l'aggiunta di insulina per mezzo acquoso insetto può mantenere fase 9 ovociti fino a 6 ore e 14 germaria fino a 14 ore 15. In tutti i casi, manovra aggressiva della camera uovo deve essere evitata, come sottolinea gli ovociti e riduce la sua redditività. Imaging meno camere d'uovo e avendo cura di trattare ciascuno è delicatamente il modo migliore per garantire la redditività ottimale.Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una borsa di ricerca Wellcome Trust Senior I. Davis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning. | |||
| Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0) | Any Supplier | A good quality brush is important | |
| Halocarbon Products Corporation, Series 95 | Halocarbon Products Corp. | European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil. |
|
| Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T | |
| Dumont No.5 - Dumostar | Fine Science Tools | 11253-20 | "Biologie" tip is also good but more fragile |
| Dissecting probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| CO2 pad |  Genesee Scientific |
59-114 (789060 Dutscher) | European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads |
| KimCare | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
| Microscope- DeltaVision | Applied Precision | DC-CORE | |
| Micromanipulator | Burleigh | Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300 | http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo) |
| Injection apparatus | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips |
| Injection needle | Eppendorf | 930000043 | Different tips are better for different applications |
| Loading tips 20μl | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
References
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