Summary
زرع نخاع العظام يوفر وسيلة لتغيير التركيب الوراثي للخلايا نخاع العظام المستمدة. إذا يعبر عن الجينات ذات الأهمية في كل من خلايا نخاع العظام والخلايا المشتقة نخاع العظم غير المشتقة، يمكن زرع نخاع العظام تغيير خلايا نخاع العظام المستمدة إلى التركيب الوراثي مختلفة دون تغيير التركيب الوراثي غير العظام نخاع الخلية مشتقة.
Abstract
لفهم دور الجينات في تطوير التهاب القولون، قارنا ردود البرية من نوع الفئران والجينات في المصالح الفئران خروج المغلوب لنقص التهاب القولون. إذا يعبر عن الجينات في المصالح في كل من خلايا نخاع العظام والخلايا المشتقة نخاع العظام المستمدة غير للمضيف، ولكن من الممكن التفريق بين دور الجينات في المصالح في خلايا نخاع العظام ونخاع المستمدة غير العظام مشتقة من خلايا نخاع العظام تقنية الزرع. لتغيير التركيب الوراثي نخاع العظام المستمدة من الفئران الخلية، تم تدمير النخاع العظمي الأصلي من الفئران المتلقية من قبل التشعيع وبعد ذلك استبدال نخاع العظام المانحة الجديدة من النمط الجيني مختلفة. عندما تم زرع العظام من النوع البري المانحة الفئران الفئران خروج المغلوب لنخاع، يمكن أن تولد الفئران خروج المغلوب مع التعبير الجيني من النوع البري في خلايا نخاع العظام المستمدة. بدلا من ذلك، تم زرعها عند الفئران خروج المغلوب المانحة نخاع العظم للفئران المستفيدة من النوع البري والبرية من نوع الفئران دون الجينات في المصالح معربا عنمن نخاع العظم تم إنتاج الخلايا المشتقة. ومع ذلك، قد زرع نخاع العظم لا يكون 100٪ كاملة. ولذلك، تستخدم مجموعة من الجزيئات نحن (CD) التمايز (CD45.1 وCD45.2) كعلامات من الخلايا المانحة والمتلقية لتتبع نسبة من الخلايا المانحة نخاع العظام في الفئران المستمدة المستفيدة ونجاح زرع نخاع العظام. واستخدمت البرية من نوع الفئران مع الفئران خروج المغلوب وراثى CD45.1 مع CD45.2 الوراثي. بعد التشعيع من الفئران المتلقية، وغرست في خلايا نخاع العظام من المانحين الأنماط الوراثية في الفئران المتلقية. وعندما نخاع العظام الجديدة المجددة للاستيلاء على حصانتها، تحدى الفئران عن طريق وكيل الكيميائية (ديكستران كبريتات الصوديوم، 5٪ DSS) للحث على التهاب القولون. نحن هنا كما أظهرت طريقة للحث على التهاب القولون في الفئران وتقييم دور الجينات في المصالح وأعرب عن خلايا نقي العظم المشتقة. إذا كان الجين في المصالح من خلايا العظام المستمدة تلعب دورا هاما في تطور هذا المرض (مثل القولونيةTIS)، يمكن النمط الظاهري من الفئران المتلقية مع زرع نخاع العظام غيرت بشكل كبير. في نهاية التجارب التهاب القولون، ونخاع العظام المستمدة وصفت الخلايا في الدم ونخاع العظام مع الأجسام المضادة ضد CD45.1 وCD45.2، ويمكن استخدامها على نسبة الكمية من وجودها لتقييم نجاح زرع نخاع العظام بواسطة التدفق الخلوي. يجب ناجحة زرع نخاع العظام تظهر الغالبية العظمى من النمط الجيني المانحة (في فترة من علامة جزيء CD) على النمط الجيني المستلم في كل من نخاع العظام والدم من الفئران المتلقية.
Protocol
1. قبل بدء أنت بين الاعتبارات الفنية
- نوصي باستخدام كل C57/BL6 البرية من نوع الفئران والفئران خروج المغلوب للتجربة لأنه يمكن شراؤها الفئران مع جزيئات CD المقابلة من الباعة الماوس كبيرة.
- لأنه من الصعب تتبع الفئران البرية من نوع الفئران خروج المغلوب وتستمد الخلايا المانحة بعد زرع نخاع العظام، فمن الضروري استخدام CD45.1 الفئران لتمثيل البرية من نوع الفئران. (WT CD45.1 الفئران C57/SJL الأسهم المختبرات جاكسون # 002014).
- معظم المستعمرات الماوس هي CD45.2. الفئران خروج المغلوب لدينا تنتمي إلى التركيب الوراثي CD45.2 (بدلا من ذلك CD45.2 الفئران WT المصدر: جاكسون المختبرات الأسهم # 000664). لا يمكن أن يؤديها تحديد النمط الجيني CD45.1 أو CD45.2 باستخدام التدفق الخلوي من نخاع العظم والدم المحيطي على النحو المذكور في المادة 7 في هذا البروتوكول.
- لقد خطر الفئران بعد التشعيع الحصانة. الحفاظ على الفئران في منشأة خالية من مسببات الأمراض.
- يتطلب تشغيل irradiator الأمن الخاصة clearancه والتدريب. لتوفير الوقت في عمليات التدريب والموافقة، فمن الأفضل أن يتعاون مع مختبر مع فني مؤهل قادر على تشغيل irradiator.
- العديد من المؤسسات لديها مختبرات قياس التدفق الخلوي مع الفنيين من ذوي الخبرة. للحد من مشاكل مع عملية التدفق الخلوي، فمن الأفضل لمناقشة تجربة الخلوي الخاص بك خطة التدفق مع فني من ذوي الخبرة قبل البدء.
- تم تعيين الفئران بهذه الطريقة (10 الفئران في كل مجموعة):
| مجموعة | متبرع بنخاع العظام إلى المتلقي | علاج | |
| A | BM تبادل | CD45.1 WT CD45.2 إلى KO | DSS التهاب القولون |
| B | التحكم في المياه العادية | ||
| C | BM تبادل | CD45.2 KO لWT CD45.1 | DSS التهاب القولون |
| D | التحكم في المياه العادية | ||
| E | زيف | CD45.1 WT CD45.1 إلى WT | DSS التهاب القولون |
| F | التحكم في المياه العادية | ||
| G | زيف | KO KO CD45.2 لCD45.2 | DSS التهاب القولون |
| H | التحكم في المياه العادية |
يظهر الرسم التوضيحي A * موجز لبروتوكول تجريبي في الشكل 1.
2. المتلقي الفئران تشعيع
- هي ولدت الفئران ويحتفظ بها في الممرض خالية المرفق. مكان الفئران في فطيرة تشعيع تعقيمها مع فلتر. مكان واحد الماوس في كل فتحة من فطيرة التشعيع. وضع الكعكة في irradiator وتأكد من أن القرص الدوار وفطيرة يتجهون.
- بدوره على مضخة الهواءللتهوية. إغلاق باب irradiator وقفله.
- أشرق على الفئران مع 1،000 راد (أي ما يعادل 10 غراي) حوالي 10 دقيقة (اعتمادا على مصدر الإشعاع ونصف الحياة). من هذه النقطة الزمنية، هي الفئران المشععة المناعية للخطر ويكون ضعف جهازهم المناعي ضد العدوى. بعد التشعيع، واتخاذ فطيرة من معلومات ووضعه في وعاء معقم لنقل إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية في منشأة للحيوانات. تجنب تعريض الفئران لبيئة خارجية لتقليل فرصة الإصابة بالمرض.
- في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، نقل الفئران في أقفاص الماوس تعقيمها مع الفراش تعقيمها (4 الفئران في قفص إضافة الماء المعقم جديدة مع التعليق sulfatrim - 3،12 مل لكل 100 مل من الماء).
- التفاف زجاجة مياه مع رقائق الألومنيوم والمضادات الحيوية هي الحساسة للضوء. يهز لخلط الزجاجة جيدا قبل حل sulfatrim التحميل إلى القفص.
3. استخراج المانحة نقي العظم
- التضحية الفئران مع ثاني أكسيد الكربون أو isoflurتعصب وتزج في حل ثم اللايسول 1:200. رش الفئران مع الايثانول 70٪ إلى الجلد الرطب وتشريح العظام مفتوحة.
- نقع في الصكوك تشريح الايثانول 70٪ للتعقيم.
- أداء تشريح في خزانة السلامة الأحيائية. استخدام أدوات معقمة لفضح تشريح العضد، عظم الفخذ، الساق وعظام الشظية، وخالية من ربط العضلات والأربطة.
- خفض فتح طرفي العظام لإظهار نخاع العظام الأحمر. عقد العظام مع ملقط. مسح نخاع العظام الأحمر خارجا مع PBS الباردة مع حقنة مل 3 و الإبر 25G إلى طبق بيتري. طرد من كلا طرفي العظام لانتاج خلايا نخاع العظام أكثر.
- استخدام 6 مل المحاقن والإبر 18G1 / 2 لكسر الأحمر المقابس نخاع العظام بواسطة طموح المتكررة وطرد. نقل نخاع العظام مع 50 مل أنابيب الصقر.
- تدور نخاع العظم عليها في 1،800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، إعادة تعليق بيليه من قبل vortexing لثانية 5-10.
- تمييع 10X العازلة تحلل RBC مع الماء المعقم. إعلاند تحلل RBC 1X العازلة (5 مل لكل الماوس المانحة)، ومرة أخرى لمدة 5 دوامة ثانية والحفاظ 3 دقائق بالضبط في درجة حرارة الغرفة.
- بعد 3 دقائق، وملء الأنابيب مع 20 مل PBS الباردة لوقف تحلل والمزيج. صب المحتوى من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون مباشرة إلى 50 عضوا جديدا أنبوب فالكون مل.
- شطف الأنابيب الأصلي مع 5 مل من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى مصفاة الخلية أيضا. أعلى ما يصل الى 50 مل PBS مع والمزيج.
4. عد خلايا العظام متبرع بنخاع
- إضافة 100 ميكرولتر من اللون الأزرق التريبان إلى أنبوب إيبندورف و 100 ميكرولتر من التعليق نخاع العظم لأنبوب إيبندورف والمزيج. ماصة الخليط الملون الخلية إلى عدادة الكريات.
- يتم احتساب مبلغ إجمالي عدد الخلايا عن طريق خلايا نخاع العظام الذين يعيشون في أنابيب فالكون = عدد الخلايا غير ملوثين في 16 المربعات X 2 (بسبب تخفيف الأزرق التريبان) × 10000 × 50 مل
- تدور أسفل خلايا نخاع العظام في 50 مل أنابيب الصقر في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة طاف. تستندعلى إجمالي عدد الخلايا، وإعادة تعليق بيليه مع PBS ل1 × 8 10 خلايا لكل مل
5. التسريب على الفئران المتلقي
- تدفئة الفئران المتلقية على وسادة الحرارة وتحت مصباح الاحترار. وضع المتلقي في الفئران restrainer. حقن 1 × 10 7 خلية لكل ميكرولتر 100-200 الماوس في الوريد.
- ويجب أن يتم حقن نخاع العظام بين 4-24 ساعة المانحة بعد التشعيع.
- الحفاظ على ما يصل إلى 4 حقن الفئران في قفص. الحفاظ على الفئران المتلقية حقن في أقفاص تعقيمها بالماء المضادات الحيوية لمعاملة لأول 4 أسابيع في منشأة الممرض الحيوانية مجانا والسماح للفئران استعادة الحصانة. أقفاص التغيير، والمضادات الحيوية المعاملة الماء والغذاء كل 4 أيام للحفاظ على النظافة.
6. تحريض التهاب القولون التهاب القولون وتقييم
- 4 أسابيع بعد زرع نخاع العظام وأشعة، والتحول إلى المياه العادية دون المضادات الحيوية والحفاظ على الفئران لمدة 2 أسابيع أخرى لاستعادة وضعها الطبيعيالقناة الهضمية الدقيقة.
- 6 أسابيع بعد الحقن نخاع العظم، وقياس وزن الجسم الأولي. يتم إعطاء بعض الفئران 5٪ كبريتات ديكستران في مياه الشرب libitum الإعلانية للحث على التهاب القولون. يتم إعطاء بعض الفئران العادية مياه الشرب فقط مجموعات المراقبة العادية.
- 5 أيام في وقت لاحق، سحب الدم المحيطي، ونقل إلى أنابيب مغلفة الهيبارين (Vacutainer) ونضع في الجليد. تجمع الدم في الفترة من 4 إلى 1 أنبوب الفئران. الجمع بين 300 ميكرولتر من الدم مع 300 ميكرولتر من العازلة تلطيخ الخلايا = 600 ميكرولتر. تقسيم الدم إلى أنابيب إيبندورف 5، مع 100 ميكرولتر لكل.
- التضحية الفئران مع ثاني أكسيد الكربون أو isoflurane. تقييم الضرر عشرات العيانية (يرجى الرجوع إلى منشور آخر للحصول على تفاصيل الفيديو [جوف] 1). قياس الجسم تغير الوزن. قياس طول الأمعاء وسمك مع الفرجار الرقمية. مراقبة الملمس البراز (من الصعب، لينة أو دموية). تحديد الدم في البراز غامض مع Hemooccult. تشريح الأنسجة القولون وإصلاح في الفورمالين لH & E تلطيخ.
- تشريح عظم الفخذ 1 بوشمال شرق في الماوس، استخراج نخاع العظام ونخاع العظام مسح مع PBS الباردة عن طريق إبرة 25G و 1 مل حقنة. نخاع العظام سباحة 4 إلى 1 المقابس أنبوب ونضع في الجليد.
- صب نخاع العظم لطبق بتري، والقص المكونات نخاع العظم إبرة 18G مع و5 مرات عدة حقنة مل المكونات حتى لا نخاع العظم موجودا.
- تدور إلى أسفل مع 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في C. ° 4 إزالة طاف و resuspend مع 600 ميكرولتر العازلة الخلية تلطيخ. تقسيم نخاع العظم معلق لأنابيب إيبندورف 5، مع 100 ميكرولتر لكل.
7. فحص الجودة من زرع نخاع العظام بواسطة قياس التدفق الخلوي
- تسمية كل أنابيب عينة من الدم أو نخاع العظم # 1-5:
- إعداد خليط الأجسام المضادة لكل منهما أنبوب في الظلام.
رقم 1 لم الأجسام المضادة
# 2 30 ميكرولتر نمط إسوي FITC السيطرة + 30 ميكرولتر PE نمط إسوي السيطرة + 15 ميكرولتر CD16/32 حظر
# 3 30 ميكرولتر FITC CD45.1 أب + 15 ميكرولتر CD16/32 حظر
# 4 30 ميكرولتر PECD45.2 أب + 15 ميكرولتر CD16/32 حظر
# 5 30 ميكرولتر FITC CD45.1 أب + 30 ميكرولتر PE CD45.2 أب + 15 ميكرولتر CD16/32 حظر
| تضيف شيئا إلى الدم أو عينة نخاع العظم # 1 |
| إضافة 5 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة رقم 2 لكل الدم أو عينة نخاع العظم # 2 |
| إضافة 3 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة رقم 3 لكل الدم أو عينة نخاع العظم # 3 |
| إضافة 3 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة رقم 4 إلى كل دم أو عينة نخاع العظام # 4 |
| إضافة 5 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة رقم 5 لكل الدم أو عينة نخاع العظم # 5 |
- نضع في الظلام في الثلج لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 2 مل العازلة تحلل RBC 1X إلى كل أنبوب. نضع في الظلام على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- تدور أسفل الخلايا في 1،500 دورة في الدقيقة، 5 دقائق في 4 درجات مئوية. (GH 3.8 الدوار، 1،500 دورة في الدقيقة = 350 XG) إزالة طاف. إعادة تعليق بيليه مع 500 ميكرولتر العازلة الخلية تلطيخ في فترة وجيزة، ثم دوامة مظلمة. تحقق من CD45.1 (تمثل WT) وCD45.2 (تمثل KO) في الدم وعينات immunostained نخاع العظام بواسطة التدفق الخلوي. حدد FITC لتمثيل WT CD45.1 وPE لتمثيل KO CD45.2.
- تحليل نتائج التدفق الخلوي بواسطة برنامج FlowJo. حساب نسبة FITC: PE PE أو نسبة: نسبة FITC لتحديد ما إذا الوراثي هو التركيب الوراثي السائد المانحة في الدم ونخاع العظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يجب إذا كان الجين في المصالح تلعب دورا هاما في الخلايا المناعية خلال تطوير التهاب القولون، والفئران تلقي نخاع العظم من النمط الجيني المختلفة من خلال زرع نخاع العظم (WT إلى KO KO أو لWT) لديها تغيير في الاستجابة للالتهاب القولون DSS. واحدة من أهم المعايير لتحديد شدة التهاب القولون هو تلطيخ H & E من أنسجة القولون. يمكن القولون التغييرات بنية الأنسجة وعلامات التهاب تقييم كميا بواسطة H & E نظام التسجيل الأنسجة. يمكن للمعايير H & E الأنسجة نموذج التسجيل لالتهاب القولون وجدت هنا DSS 2. وبدلا من ذلك، يمكن أيضا أن التهاب القولون الناجم عن المواد الكيميائية الناجمة عن trinitrobenzene حمض السلفونيك (TNBS). ويمكن الاطلاع على أساليب الحث التهاب القولون TNBS H & E ومعايير التسجيل في الأنسجة منشور السابقة 3. ويمكن تحليل الأنسجة الفرق بين مجموعات من نقاط الطالب تي الاختبارات.
قد يكون الفئران بشكل ملحوظتحسن أو تدهور التهاب القولون عند الفئران مقارنة مع العظم زرع نخاع الشام (WT لWT أو KO KO ل). إذا كان الجين في المصالح تلعب دورا هاما في التهاب القولون عن طريق خلايا نخاع العظام المستمدة، ينبغي أن الفئران مع نخاع العظم تبادل الاستجابة تختلف اختلافا كبيرا من الفئران مع العظام الشام زرع نخاع.
لطراز التهاب القولون DSS، قد يتم تقييم الأنسجة تغير بتسجيله الأنسجة (انظر الشكل 4). قد تغير ملموس في درجة الأنسجة تشير إلى تطور التهاب القولون بوساطة الجينات في المصالح من خلايا نخاع العظام المستمدة. على سبيل المثال، هو جين cathelicidin الببتيد المضادة للميكروبات والمضادة للالتهابات (الجينات في المصالح في حالتنا) 4. دون زرع نخاع العظام، cathelicidin الفئران KO المتقدمة عموما أسوأ من التهاب القولون البرية من نوع الفئران لم استجابة لمفاجآت صيف دبي. نقل من البرية من نوع نخاع العظام (WT) لخروج المغلوب cathelicidin (KO) الفئران يؤدي إلى التهاب القولون تحسن في حين transfusi على من نخاع العظام من خروج المغلوب cathelicidin (KO) الفئران على الفئران البرية من نوع (WT) يؤدي إلى التهاب القولون سوءا عند التعرض لمفاجآت صيف دبي (الشكل 2).
للتحقق من التعبير عن الجينات الفائدة من، ينبغي التعبير مرنا من الجينات الفائدة من (على سبيل المثال. cathelicidin) من نخاع العظام المانحة من النوع البري قابلة للرصد في الأنسجة (أو غيرها) من القولون cathelicidin نقص الفئران خروج المغلوب بعد المستفيدة العظام زرع نقي. ومن المهم أيضا أن تعرف ما إذا يتم تقليل التعبير عن الجينات الفائدة من الفئران المتلقية في البرية من نوع التبرع بعد نخاع العظام خروج المغلوب الفئران.
ويمثل engraftment الناجح لنخاع العظام من المانحين نسبة مسيطرة من نمط إسوي CD المانحة على نمط إسوي CD المستلم في كل من الخلايا الدموية المحيطية ونخاع العظام من الفئران المتلقية. نخاع العظم أفضل من وضع العلامات يظهر CD45.1 وCD45.2 في التدفق الخلوي والدم لديها الكثير من الخلايا غير ملوثين (الشكل 2 و 3).
"jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 1. البروتوكول التجريبي لزرع نخاع العظام.
الشكل 2. بيانات التدفق الخلوي من نخاع العظام من الفئران المتلقية بعد زرع نخاع العظام. وY-المحور يظهر FITC التي تحمل علامات CD45.1 إشارة وX-PE-المحور يظهر المسمى CD45.2 الإشارة. ويعرف ناجحة زرع العظام من خلال تغيير النمط الجيني CD45.1 أو CD45.2 في نخاع العظام والدم على حد سواء من الفئران المتلقية. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
س: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 3. بيانات التدفق الخلوي من الدم من الفئران المتلقية بعد زرع نخاع العظام. وY-المحور يظهر FITC التي تحمل علامات CD45.1 إشارة وX-PE-المحور يظهر المسمى CD45.2 الإشارة. ويعرف ناجحة زرع العظام من خلال تغيير النمط الجيني CD45.1 أو CD45.2 في نخاع العظام والدم على حد سواء من الفئران المتلقية. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 4. تقييم التهاب القولون في الفئران بعد زرع نخاع العظام. (A) نموذج H & E صور كولون مع nأرمال الأنسجة والتهاب القولون DSS. (B) عشرات علم الأنسجة. ويمكن التأكد من نجاح تحريض التهاب القولون DSS من زيادة كبيرة في الأنسجة نقاط بعد يوم 5 من العلاج DSS. بعد تبادل لنخاع العظام الوراثي مختلفة، ينبغي أن تتغير بشكل كبير درجة الأنسجة. هذا يشير إلى تغير مسار التهاب القولون بواسطة الجينات ذات الفائدة، للتعبير عن الخلايا في نخاع العظام المستمدة. يتم تمثيل البيانات عن طريق الخطأ ± متوسط مستوى الوسائل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا زرع نخاع العظم نهج مناسبة للبحوث المناعة التهاب القولون، والعدوى، والسرطان، والسمنة وأمراض أخرى. هناك حاجة لذلك زرع نخاع العظم عند تجربة أعرب عن الجينات في المصالح في كل من نخاع العظم والخلايا المشتقة نخاع العظام المستمدة غير ويشتبه الجين في المصالح للتوسط المرض عن طريق الخلايا إما من السكان. على سبيل المثال، يظهر مضادات الميكروبات الببتيد cathelicidin التهاب القولون الحاد لتعديل. ولكن يتم التعبير عن ذلك في كل من الخلايا الظهارية وخلايا المناعة (مثل الضامة). ثم استخدمنا زرع العظام لتحديد السكان من الخلايا التي ينظم التهاب القولون الحاد في الفئران. تم تغيير كبير في شدة التهاب القولون بعد تغيير الأنماط الجينية العظام نخاع cathelicidin عبر زرع نخاع العظام. ثم يمكننا أن نستنتج أن cathelicidin أعرب في خلايا نخاع العظام المستمدة يلعب دورا هاما في التهاب القولون الحاد تحوير استجابة لمفاجآت صيف دبي.
أماه العظامالخلايا المشتقة rrow وعادة ما تشمل خلايا الدم الحمراء، خلايا الدم البيضاء والصفائح الدموية. زرع نخاع العظم تغيير التركيب الوراثي لهذه الخلايا دون غيرها. تحدث أفقيا، ويمكن التفريق هذه التجربة فقط دور الجينات في المصالح من خلايا نخاع العظام المستمدة مقابل غير نخاع العظم الخلايا المشتقة. ولكن يمكن أن هذه التجربة لا زيادة تحديد السكان التي من نخاع العظام المستمدة الخلايا يتوسط يتم اشتقاق التهاب القولون وجميع خلايا الدم الحمراء، خلايا الدم البيضاء والصفائح الدموية من نخاع العظام. مصير خلايا نخاع العظام المستمدة هاجروا إلى نقطتين خلال التهاب القولون هي منطقة نشطة ومثيرة للجدل من البحث. بعد زرع نخاع العظام والتهاب القولون تحريض الفئران، فمن المرجح أن بعض خلايا نخاع العظام المستمدة موجودة والخلايا اللمفاوية وmyofibroblasts في كولون 5. واقترح تقرير آخر أن نخاع العظام والخلايا المشتقة بمثابة الخلايا الاصلية لاتساع الأوعية الدموية في بطانة عملية الانتعاش 6. هناك أيضا evidencوترتبط ه نخاع العظام تظهر الخلايا المشتقة مع تمايز الخلايا الظهارية في المرضى الذين يعانون من التهاب القولون 7. لا يمكننا استبعاد احتمال أن بعض خلايا نخاع العظام المستمدة قد تفرق إلى خلايا أخرى من الخلايا المناعية وتلعب أدوارا نموذجية تحوير في التنمية التهاب القولون. ومع ذلك، ونخاع العظام المستمدة الوحيدات / البلاعم السكان المهم للحماية من الضرر الناجم عن المواد الكيميائية المخاطية القولون 8،9. هذا التقرير يتفق مع الحقائق التي لدينا cathelicidin أعرب من خلايا نخاع العظام المستمدة ينظم التهاب القولون DSS بينما يفرز من cathelicidin حيدات / الضامة 4.
من ناحية أخرى، هناك العديد من الطرق لتتبع نجاح زرع نخاع العظام. يمكن تحليل التدفق الخلوي من CD45.1 وCD45.2 المورثات توفر طريقة كمية لتحديد نسبة العظام المانحة خلايا نخاع الخلايا الجذعية المشتقة في الفئران المتلقية. نخاع العظام المستمدة الخليةيمكن ليالي تفرق في أنواع متعددة من الخلايا 10. عندما تدفق تحليل الخلوي غير ممكن، فمن الممكن استخدام الفئران الذكور المانحة (XY كروموسوم) وأنثى الفئران المتلقية (XX الصبغي) 11. فإن الفئران تحمل الكروموسومات Y المانحة فريدة من نوعها في الجسم من الفئران الإناث XX المتلقي فقط. ويمكن تحديد كروموسوم Y من الفلورسنت في الموقع التهجين 11. وبالإضافة إلى ذلك، قد المناعية من CD45.2، CD45.1 و / أو الجينات في المصالح في الأنسجة يكون من الضروري تصور خلايا نخاع العظام المستمدة المانحة.
ولكن عادة ما يتم تحليل التدفق الخلوي CD45 وكروموسوم Y في الموقع التهجين بعد إجراءات تم التضحية الفئران. لمراقبة الموقع من الخلايا المانحة في الفئران المتلقية تستخدم لدراسة الأمراض المزمنة مثل السرطان دون التضحية الفئران، فمن الممكن استخدام الأخضر الفئران المعدلة وراثيا بروتين فلوري والفئران المانحة 12. ولذلك، يفسد العظام المانحةيمكن تتبع الخلايا المشتقة صف في الجسم من الفئران المتلقية غير الغازية تحت التصوير عالية الدقة البصرية تحت التخدير عابرة ويمكن القيام بذلك مرارا وتكرارا.
ليس كل الفئران لديها ناجحة زرع نخاع العظم 13. لاحظنا ~ 10-20٪ من الفئران تموت في الأسابيع الأولى 2 بعد التشعيع بسبب فقر الدم أو الإصابة. ولذلك، ينبغي إعداد أكثر مما يجب الفئران في بداية التجربة. على سبيل المثال، يجب عليك إعداد 10 الفئران في كل مجموعة في بداية التجربة إذا كنت تتوقع 8 الفئران في كل مجموعة المتاحة في نهاية التجربة التهاب القولون. أيضا، تأكد من إزالة الفئران الميتة في أقرب وقت ممكن. ويرتبط سرعة إعادة بمنأى عن الأرقام على الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظام التي غرست في الفئران المتلقية 14. ولذلك، فإنه من الأهمية بمكان أن يكون عدد كاف من خلايا نخاع العظام حية (1 × 10 7 خلايا في الماوس) التي غرست في الفئران المتلقية لنجاح العظام نخاع TRansplantation.
لقد خطر الفئران المتلقية بعد التشعيع الحصانة. وينبغي أن يتم تشريح الفئران المانحة وإجراءات إعداد نخاع العظام في نفس المستوى تجارب زراعة الخلايا. استخدام الأدوات المعقمة والحاويات، ينبغي تطبيق تقنيات معالجة العقيم. في جميع التجارب، PBS تحتوي ينبغي استخدام 1٪ البنسلين الستربتوميسين، و 10 الهيبارين U / مل خلال التعامل مع الكوسا العظام. جميع الكواشف الخلية الصف الثقافة. ويمكن الاطلاع على مناقشة تقنية إضافية في إشارة 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الطيار والجدوى منحة دراسة من جامعة كاليفورنيا-CURE سنتر، والتهاب القولون كرون ومؤسسة جائزة الوظيفي أمريكا التنمية (# 2691) والمعهد الوطني للصحة NIDDK K01 (DK084256) لتمويل هون واي KOON.
وساعد عملية التشعيع نخاع العظام من ليفين وبرنار سكوت مطبخ مركز UCLA للبحوث الإيدز ماوس / مرفق الإنسان الأساسية الوهم. وساعد تدفق الخلوي بواسطة عملية منشأة UCLA الأساسية المتجهات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell staining buffer | Biolegend | #420201 | |
| 10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 | |
| FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 | |
| PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 | |
| PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 | |
| FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 | |
| Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 | |
| 40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 | |
| PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 | |
| Heparin | Fisherbrand | #BP2425 | |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) | |
| Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) | |
| Vaccutainer | BD | #8000813 | |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 | |
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II | |
| Flow cytometer test-tube | Falcon | #352052 | |
| Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
References
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
- Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
- Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
- Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
- Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
- Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
- Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
- Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
- Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. Gut. , (2012).
- Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
- Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
- Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
- Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).
