Summary
在这份报告中，我们展示了染色和分析步骤，新鲜全血进行列举主要的先天免疫和适应性白细胞种群的表型分析。执行这些程序在多中心临床试验的背景下，我们强调的注意事项。
Abstract
外周血白细胞的超低温保存的被广泛用来保存在临床试验中的细胞的免疫应答的评估，为便于和标准化的免疫学评估提供了许多优点，但在此过程中的有害影响已被观察到一些细胞亚群，如粒细胞，B细胞和树突状细胞1-3。含量测定新鲜的白 细胞在体内的细胞状态，给出了更准确的图片，但往往是难以执行的背景下，大规模的临床试验。新鲜的细胞检测是依赖于志愿者的承诺和时限，如果费时，他们的应用程序可以是不切实际的，由于实验室工作人员的工作时间要求。此外，在多个中心进行试验时，与要执行的检测的资源和培训实验室可能不会被位于足够接近临床站点。为了解决这些问题，我们已经开发开发了一个11-色抗体染色面板，可以使用Trucount管（Becton Dickinson公司，圣何塞，加利福尼亚州）的表型和外周血内列举主要的白细胞种群，得到更强大的细胞类型特异性的信息比检测诸如全血细胞计数（CBC）或分析与市售面板设计Trucount管，染色只有少数细胞类型。染色过程很简单，只需要100微升新鲜全血，需时约45分钟，使其成为可行的标准的血液处理实验室执行。它改编自BD Trucount管技术数据表（ 8/2010 ）。在中央检测实验室，可以在散装提前准备染色的抗体鸡尾酒，运到现场处理实验室。可以是固定的彩绘管冻结装运中央多色流式细胞仪分析检测实验室。从这种染色面板生成的数据可以被用来追踪干预有关的白细胞浓度随着时间的推移的变化，并可以很容易地得到进一步的发展，以评估特定细胞类型的兴趣的激活状态。在这份报告中，我们展示了使用血液处理实验室技术人员进行染色新鲜的全血和步骤来分析这些染色样品在中央检测实验室支持的多中心临床试验的程序。视频详细信息的过程，因为它是在艾滋病疫苗试验网络（HVTN）的临床试验抽血的背景下进行。
Protocol
注：为了保护从光的荧光标记的抗体在生物安全柜的灯不亮，执行所有步骤。
1。抗体染色面板准备
- 于表1中可以发现的抗体染色面板。抗体浓度应与全血通过滴定定义，并使用相同的流式细胞仪，将用于获得染色表型样本的设备和程序。
- 一旦确定适当的染色滴度，所有的抗体结合成一个单一的混合物，的锁帽筒。添加流洗涤缓冲液（2％热灭活的小牛血清的Dulbecco PBS），使总体积为100μl。缩放的混合物被染色的样本的数目。该混合物在4℃下，可以存储多达八个星期。
2。染色法
- 如果采集的血液是被用于其他目的，在广告CONDITION（供电状态）这个实验中，设定的等份，留出更多的时间敏感的程序进行，将剩下的血。的等分试样可以在室温下贮存长达4小时静脉穿刺后没有显着的细胞的损失。
- 验证在Trucount管和标签的管，以确定被染色的样品的底部，有一个完整的珠粒料。 HVTN临床试验，实验室数据管理系统（前沿科学和技术研究基金会，纽约州Amherst）用于标记和跟踪染色样品。
- 记录的所有试剂的批号和到期日期。记录的Trucount的管珠计数管包装袋上的制造商所提供的数，确保包装袋上的批号相符的批号管。
- 使用反向移液管准确移液管100微升的全血到Trucount管，上面的金属固定器。避免弄脏血液向下侧的管。
- 在黑暗中在室温下（15-30℃）15分钟，孵育Trucount管。
- 如果有必要，10×FACS裂解液的等分试样稀释到1X使用DIH 2 O。添加900微升1×FACS裂解溶液的试管。
- 盖上管盖和涡彻底在低速下混合约15秒。向下推盖牢固地插入锁定与实验室膜管和密封的位置上。
- 管存放在-65°C至-95°C，直到样品是准备运送到中央分析实验室，或在内部进行分析。样品是稳定的在这个阶段，在至少四个星期。如果运输或化验IMMEdiately，该步骤可以被省略。
3。航运
注：以下说明利用的绝缘运输系统的SAF-T-PAK，专门用于运输B类豁免生物活性物质，根据国际航空运输协会（IATA）的规定。如果分析的样品在相同的位置，作为染色发生，到第4条。
- 样品可立即发货染色后，一旦被冻结在-65°C到-95°C。各管缠绕在染色标本中完全箔和地点。将染色标本盒里面多袋防漏的吸收材料。
- 特卫强袋和密封防漏胶袋，内容收入囊中的空气尽可能少。
- 将样品包（二次包装内的标本）内的棕色盒子内。
- 将内部的褐色B牛里面的泡沫塑料胸部，确保到缩进以防止移位。
- 填充泡沫塑料胸部用干冰（约8公斤），将盖子盖紧，放在胸前。
- 装运箱和船舶用胶带牢牢生物物质，B类（UN3373）用适当的干冰（UN1845）标记的;按照国际航空运输协会PI-650的说明。
- 一旦收到，样本被存储在-65℃至-95℃，直到对它们进行分析。
4。解冻和流式细胞仪分析
- 从冷冻机中取出染色的样品的流式细胞仪上收集之前，在黑暗中在室温下解冻。如果在一个以上的样品收集数据，规范流程，所有的管子惊人的融化，使管不是停留在室温下超过1小时，每。
- 应配备适当的过滤器，例如在BD LSR使用四个激光流式细胞仪获得的样品II。使用标准的流式细胞仪的校准和荧光补偿方法进行数据收集4。
注意：不要设置5在收集过程中的散射或侧面散射阈值。 Trucount珠可以尽可能最低的低于阈值设置这些参数造成的一个子集珠在分析过程中不占。如果需要的仪器设置阈值，设置尽可能低的青色通道的阈值。因为CD45 +白细胞染色与面板将是青色，Trucount珠还发出荧光，在上午青色通道，这应该可以适当地收集所有相关数据。
- 涡样品管，持续5秒，然后再装上流式细胞仪。 Trucount珠荧光高度的多种渠道。在收集过程中发现高双阳性的人口是PE Cy5和APC（结肠门珠RS是最容易区分的珠子从细胞可能会有所不同，这取决于仪器）。选择您的停止门珠门，并记录数据，直到至少有20,000收购珠。
- 使用合适的软件分析数据，作为FlowJo（Treestar，亚什兰，OR）等。 图1显示了用于分析不同的白细胞人口从有代表性的控制抽血的门控方案。
5。 Trucount计算
- 每个Trucount管含有荧光微球的冻干颗粒。在添加液体的管，和涡旋，珠粒应成为同样分布在整个样品。珠颗粒的数量略有不同批号和管的储物袋上可以找到。
- 栅极Trucount珠和如在图1中所示的细胞群，以确定事件计数为每个人口。的事件的数量的比较我n的珠珠最初的总数在管的栅极连接到将允许您确定样品收集的，然后可以被用来确定的绝对浓度（ 即 ，细胞/微升），为每个人口的比率。可以使用下面的公式，用于此目的：细胞浓度（细胞/微升的全血）= [＃人口事件/（＃珠事件/＃总珠球团）] / 100微升。
6。代表性的成果
图1。使用的浇注方案的主要白细胞人口数据从健康志愿者代表进行分析。 A）Trucount珠（I）的门控，排除细胞。粒（二）所划定并的lympohcytes和单核细胞分为3 popluations：CD14阴性淋巴细胞（ⅲ），（ⅳ）所有CD14阴性细胞，和非淋巴细胞（ⅴ）。 B）CD14阴性细胞是门控区分CD4 +Ť细胞（六），CD8 + T细胞（七），乙细胞（八），CD56明亮的NK细胞（九），CD56昏暗的NK细胞（X），和CD56阴性NK细胞（十一）。 C）所有的CD14阴性细胞的门控来区分髓系（xii）及浆细胞（ⅹⅲ）的树突状细胞。 D）非，lympocytes的选通，区分非古典（十四），中级（十五），古典（十六）单核细胞。 点击此处查看大图 。
使用我们提出的面 板，也可以加以区分的更具体的，未示出在图1中（ 例如 ，NKT细胞或嗜中性粒细胞）的细胞亚群，和门控方案可以扩展或修改，以满足特定的学习需要。某些门控步骤所示，该方法是独特的。特别需要注意的，包括栅极和排除栅极周围绘制Trucount珠放置在另一个上面，一个栅极珠粒进行计数，和一个排除珠粒从蜂窝的分析（ 图1A）。此外，淋巴细胞，单核细胞和粒细胞，因为不容易被区分全血中，因为它们是在外周血单核细胞的前向散射和侧向散射光，浇注使用这些细胞CD45表达和侧向散射光往往是必要的（ 图1A）。在部分地块高CD16的表达（ 图1C和图1D）是有区别的，不能分离淋巴细胞和单核细胞CD45和侧向散射光的污染粒细胞（圆圈内）。污染的粒细胞的数量通常是很小的，并且它们不干扰与单核细胞和NK细胞的门控。
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Discussion
在这份报告中，我们提出了一个珠列举流式细胞仪新鲜全血中的白细胞人口为基础的方法，并覆盖所需的参数的多中心临床试验中使用的集中样品分析。这种方法的基础上，优化的BD Trucount协议，并允许其可靠的多中心临床试验中使用的设置。染色法很简单，大约需要45分钟来执行，使血液处理实验室技术人员来执行它，并冻结和运送样本到中央分析实验室进行分析是可行的。该试验仅需要100微升的全血，这消除了需要的时间和成本密集的外周血单个核细胞处理，并使用少得多的体积比标准的表型检测。此外，通过使用新鲜的全血，该试验中，更准确地描述了的细胞在体内的状态，并消除上观察到一些细胞类型的有害影响冻存小号1-3。这种染色方法产生的细胞浓度的精确测量，但区分比CBC和其他计数方法的显着更多的细胞类型与额外的好处。关键是取得准确和一致的结果，仔细规范的协议中的关键步骤，并利用一种文档系统，跟踪所有的步骤，使所发现的任何异常情况，可以上溯到错误的来源。
有多个在整个过程中的关键步骤，从该试验中获得的数据的质量的影响。首先，标准化的治疗和处理血液的时间被吸引到它是染色的时间是很重要的，类似于先前已报道的PBMC处理6。我们获得一致的数据，当血液被存储在收集管在临床现场，并在环境温度下输送到处理实验室，染色在4小时内抽血，和染色样品，然后用干冰运输中心检测实验室。此外，通过抗体鸡尾酒中心实验室，并把它发送到现场处理实验室，我们保证站点之间的一致性，可以测试每个控制抽血前的鸡尾酒，用它来染色试验样品。重要的是，中央检测实验室规范这个过程。因此，我们建议，一旦构成抗体滴定到优化的分离之间的正和负的人口7，相同的特定的抗体可以用于所有样品的染色在临床试验中，以保持一致的每个标记的染色水平。如果这不是可能的（ 例如 ，从抗体，该抗体制造商的供应量不足），每一个新的特定的抗体应适当滴定，以确保的流式细胞仪的数据将被使用以前的特定得到的相媲美。中心实验室，现场处理实验室必须非常小心，运输和储存的抗体鸡尾酒在4°C，避免光线照射，以减少可能发生的退化，尤其是串联染料8-9。
用这个方法获得的数据的准确性取决于几个的流式细胞仪上的染色程序和样品采集过程中的关键步骤。特别需要注意的，是必不可少的;准确的反向移液的血到Trucount管的血液量小的差异计算浓度的细胞亚群可以有很大的影响。在低速涡旋增加抗体的鸡尾酒后，BD FACS裂解彻底混合的试剂也很重要。同样，涡旋式，彻底免除珠均匀分布在整个收购前的样品是必不可少的准确计数10。流式细胞仪分析设置上略有变化，对采集到的数据也有很大的影响，所以CAreful要注意的流式细胞仪的校准和设置，日常使用4。
还应当指出，而初步数据表明，冻结的染色样品似乎并不影响获得的细胞浓度（数据未示出），这还没有彻底测试。虽然这是一个潜在的问题，仍然可以进行比较样本之间的所有样本都以一致的方式处理，只要有信心。
仔细的样品跟踪整个染色和分析是特别重要的，尤其是当被处理数百个样品的上下文中的临床试验。一旦数据被获取和分析开始，关键是尽可能多样品之间的标准化分析门。的荧光某些人群可能会出现一些变化，尤其是在不同的志愿者，但标准的浇口位置应设置APPLI电缆为许多样品尽可能。任何转移的大门，从标准位置时确定的细胞计数发生变化样本之间的，应当记录，并考虑。
这种染色方法进行了优化，使用一种抗体染色面板列举的主要白细胞子集，但程序和面板可以很容易地修改，以满足特定的学习需要。相反，Trucount技术数据表程序，建议使用50微升的血液，我们提出的方法，用100微升。通过使用较大的血容量，更多的事件被收购时，在分析过程中，这是非常有用的研究与外周血中的浓度相对较低，如树突状细胞的细胞群。虽然以前的研究列举的树突状细胞群，通过Trucount使用50μl和100μl血液卷11-12，报告指出，合理的精度依赖于获得至少400阳性Ê人口事件，这通常可以只使用50微升血液13时，与树突状细胞是困难的。所用的血液量可以进一步调整为特定的细胞类型或染色板，以满足分析要求。同样，染色面板可以被修改，以集中在某些类型的细胞，从而使为当前未区分由此处所示的面板（ 例如 ，额外的NK细胞的子集或调节性T细胞）的更具体的细胞亚群的枚举。一个单一的面板的使用简化了染色的协议和与多个面板，如标示法染色样品减少错误。虽然多个面板的使用增加了成本和潜在错误，针对特定的细胞类型的单独的面板允许更详细的表型和/或夹杂物的活化标记物，和它们的使用，可以容易地实现在多中心临床试验中，同时考虑到考虑盘ussed。
| 标记 | 荧光基团 | 公司 | 克隆 |
| CD45 | 我青色 | BD Biosciences公司 | 2D1 |
| CD3 | FITC | BD Biosciences公司 | SK7 |
| CD8 | PerCP Cy5.5标记 | BD Biosciences公司 | SK1 |
| CD4 | AX700 | BD Biosciences公司 | RPA-T4 |
| HLA-DR | ECD | Beckman Coulter公司 | IMMU-357 |
| CD14 | V450 | BD Biosciences公司 | MφP9 |
| CD19 | PE | <TD> BD Biosciences公司HIB19 | |
| CD16 | APC-H7 | BD Biosciences公司 | 3G8 |
| CD56 | PE CY7 | BD Biosciences公司 | NCAM16.2 |
| 表面CD11c | APC | BD Biosciences公司 | B-LY6 |
| CD123 | PE Cy5的 | BD Biosciences公司 | 9F5 |
表1抗体染色面板，以确定所有主要的外周血白细胞的人口。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢他们协助发展这种方法，手稿和视频杰西卡·琼斯，埃里卡·克拉克，康斯坦茨Ducar，唐娜·史密斯，罗伊·刘易斯，百合Apedaile，乔安妮·威斯纳，德文·亚当斯，科里·麦克贝恩和斯蒂芬Voght。
这项工作是由比尔和梅林达·盖茨基金会CAVD授予38645（MJM）和美国国立卫生补助UM1 AI068618和U01 AI069481（MJM）的支持。 EA-N。由美国国立卫生研究院资助T32 AI007140支持。我们感谢詹姆斯·B·彭德尔顿慈善信托基金的慷慨设备捐赠。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 | |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 | |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
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