Summary
ويمكن استخدام اثنين من التقنيات لإنشاء هذا النموذج : حقن الخلايا السرطانية تعليق في الحائط الأعور أو زرع قطعة من ورم تحت الجلد على الأعور. هذا النموذج هو مفيد لدراسة التطور الطبيعي لسرطان القولون والمستقيم واختبار عوامل علاجية جديدة ضد سرطان القولون والمستقيم.
Abstract
الورم تحت الجلد التقليدية النموذج هو أقل من مثالية لدراسة سرطان القولون والمستقيم. نماذج الماوس مثلي من سرطان القولون والمستقيم ، والتي تتميز الخلايا السرطانية المتزايدة في مواقعها الطبيعية ، وتكرار الأمراض التي تصيب البشر مع الدقة العالية. ويمكن استخدام اثنين من التقنيات لإنشاء هذا النموذج. كلا تقنيات متشابهة وتتطلب تخدير الماوس والبطن عن التعرض للالأعور. أسلوب واحد ينطوي على حقن الخلايا السرطانية تعليق القولون الأعور في الحائط. first تزرع الخلايا السرطانية في الثقافة ، وعندما تحصد subconfluent وأعد تعليق خلية واحدة. يتم حقن كمية صغيرة من الخلايا ببطء لتجنب تسرب. تقنية أخرى تتضمن زرع قطعة من ورم تحت الجلد على الأعور. والموت الرحيم والفأر مع وجود ورم في السابق تحت الجلد والقولون والمستقيم هو إزالة الورم باستخدام تقنية معقمة. يتم تقسيم قطعة الورم إلى أجزاء صغيرة لزرعها لآخر الماوس. قبل الزرع ، معطوب طفيفة الأعوري الجدار لتسهيل تسلل خلية الورم. والوقت لتطوير أورام الكبد الأولية والانبثاث تختلف تبعا للتقنية ، خط الخلية ، وأنواع الماوس المستخدمة. هذا نموذج الفأر مثلي مفيد لدراسة تطور طبيعي لسرطان القولون والمستقيم واختبار وكلاء علاجية جديدة ضد سرطان القولون والمستقيم.
Protocol
أولا تحضير خلية
- تزرع خلايا سرطان القولون والمستقيم في الثقافة وحصادها عندما subconfluent.
- ويتم إعداد تعليق خلية واحدة في الفوسفات مخزنة المالحة ويحرص على الجليد.
II. ورم التحضير
- والموت الرحيم والفأر مع وجود ورم القولون والمستقيم في السابق تحت الجلد.
- إزالة ورم تحت الجلد باستخدام تقنية معقمة وتنقسم الى قطع 2-3 ملم
- وتحفظ القطع ورم في الفوسفات مخزنة المالحة على الجليد.
III. إعداد الماوس
ملاحظة : في مختبرنا استخدام استنشاق نحن isoflurane لتخدير الماوس ، بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أن استخدام حقن المخدر لتحقيق التأثير نفسه
- ويتم تقييم عمق التخدير باستخدام قرصة أخمص قدميه. وينبغي أن يكون هناك أي انسحاب منعكس مع قرصة أخمص قدميه.
- يمكن إعطاء المضادات الحيوية عند هذه النقطة.
- يتوضع بشكل صحيح الماوس تخدير ، والذي كان يحلق في السابق.
- وهيأهم البطن بمحلول betadine.
- ورايات البطن وموقع الجراحة بطريقة عقيمة.
رابعا. البطن
- وقدم نيك صغير في الجلد
- وأدرك عضلات جدار البطن ورفعوا
- ودخلت في تجويف البطن ويتم استخدام شفرة واحدة من مقص لدفع محتويات داخل البطن بعيدا
- ويمتد الشق إلى 2-3 سم
خامسا التعرض للالأعور
- يتم التعرف على الأعور مع حقيبتها المنتهية المكفوفين وexteriorized
- غير معزولة عن بقية الأعور من الماوس باستخدام قبل قطع ، شاش معقم
- وتستخدم المياه المالحة الدافئة للحفاظ على رطوبة الأعور
سادسا. حقن الخلايا في جدار الأعوري
- ويستخدم 27 أو إبرة G أدق لحقن وحدة تخزين 50 ميكرولتر من الخلايا في جدار الأعوري
- تتم إزالة الإبرة
- ويتم تفتيش في موقع الحقن لضمان عدم تسرب
- يتم إرجاع الأعور إلى تجويف البطن
سابعا. زرع ورم على الأعور
ملاحظة : بالإضافة إلى حقن الخلايا في جدار الأعور ، وهو نهج بديل يتمثل في زرع ورم على الأعور
- يتم وضع الرقم 8 غرزة على الأعور باستخدام 6-0 أو 7-0 خياطة الحجم
- معطوب طفيفة الجدار الأعوري
- ثم ، يتم وضع قطعة ورم
- يرتبط بانخفاض غرزة
- يتم إرجاع الأعور إلى تجويف البطن
ثامنا. اختتام الماوس جدار البطن والاسترداد
- إغلاق جدار البطن باستخدام الماوس ثلاث غرز توقف باستخدام 3-0 أو 4-0 خياطة الحجم
- بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام غرزة بسيطة تشغيل
- يمكن أن تعطى المسكنات بعد الجراحة وبلعة السوائل في هذه النقطة
- ولا يسمح للماوس على التعافي من التخدير.
ملاحظة : مع التخدير استنشاق هذا يستغرق عادة 30 ثانية
تاسعا. النتائج -- الورم الرئيسي والانبثاث الكبد
الورم الرئيسي -- تظهر في الموقع (أ) والدليل على اتساع الأوعية الدموية مع (B) ؛ على تلطيخ H & E ، والأورام والغازية محليا (C)
الانبثاث الكبد -- أظهرت السابقين فيفو (D)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن نماذج الماوس ورم تحت الجلد من السهل إنشاء ورصد ، فمن الواضح أن هذا النموذج لا يمكن نسخ الموقع الأصلي التشريحية لسرطان القولون والمستقيم. بسبب الاختلاف في المكروية ، وقد تبين أن خلايا سرطان القولون والمستقيم النامي تحت الجلد لتغيير النمط الظاهري ، وتقريبا دائما تفشل في التقدم وتنتشر 1،2. في الواقع ، يمكن للاستجابة الورم للعلاج تختلف بشكل كبير اعتمادا على ما إذا كان يتم زرع الخلايا السرطانية في خارج الرحم (تحت الجلد) مقابل 3 موقع مثلي. نماذج الماوس مثلي من سرطان القولون والمستقيم ، والتي تتميز الخلايا السرطانية المتزايدة في مواقعها الطبيعية ، وتكرار الأمراض التي تصيب البشر مع الدقة العالية. الطريقتين لإنشاء هذا النموذج لديها مزايا وعيوب فريدة من نوعها. حقن تعليق خلية في الجدار الأعور يدخل خلايا سرطان القولون والمستقيم والتي ظلت تنمو مسبقا في المختبر في بيئة متجانسة ويمكن القول. قد يكون خفض محتمل الخلايا الغازية أو النقيلي بعد العديد من المقاطع في الثقافة. زرع قطعة من ورم تحت الجلد يقدم المزيد من السكان غير متجانسة من الخلايا السرطانية التي تم وضعها في الجسم الحي. ومع ذلك ، تحتوي على خلايا الأورام اللحمية ، وكثيرا ما نخرية الأجزاء التي قد تؤثر على ثبات هذا النموذج (الاتصالات الشخصية ، I. فيدلر ، أندرسون). من الناحية التقنية ، فقد وجدت أن لدينا مختبر حقن تعليق خلية في الجدار الأعور هو أكثر صعوبة ويحمل مخاطر الحقن داخل اللمعة والتسرب في مرحلة ما بعد الحقن. ومن المثير للاهتمام ، وقد وصفت نموذج الفأر مثلي من سرطان المستقيم الذي لا يتطلب فأرة البطن 4. الفئران هي تخدير وهابط الغشاء المخاطي المستقيم مع الضغط الرقمي. يتم حقن كمية صغيرة من خلايا سرطان القولون والمستقيم في تعليق خلية واحدة submucosally. الأولية ، وسرطانات المستقيم لدى الفئران الغازية وضع في وقت مبكر من اسبوع واحد بعد الحقن ، ولكن أيا من الفئران تطوير الانبثاث الكبد والكتاب لم يعلق على وتيرة metasases الرئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
قسم الجراحة في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو
ريمون شاهين ، MD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line used | ||
| Phosphate Buffered Saline | BioWhittaker | 17-512F | also sold by a number of other vendors |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430790 | |
| 6 well plates with lid | BD Biosciences | 353046 | |
| Iris forceps, straight, serrated tips | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | best to have a pair of these instruments |
| Iris dissecting scissors, straight, sharp | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| Needle Holder (regular) | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| Needle Holder (Castroviejo) | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex |
| 6-0 or 7-0 suture | for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| 3-0 or 4-0 suture | for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| Anesthetic machine / Isoflurane | J.A. Baulch and Associates | 3206 | also sold by a number of other vendors |
| Heating Pad, disposable, 6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| Tape, orange, 13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | for restraining anesthetized mouse |
| Pro-Cord/Cordless Trimmer | Oster Professional Products | 78997-010 | for shaving mouse fur |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | may also be purchased at any medical supply store |
| 2 x 2 gauze, 3-ply | Johnson & Johnson | 7635 | may also be purchased at any medical supply store |
| Sterile Field, Barrier, 16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | may also be purchased at any medical supply store |
| Cotton tipped applicators, 6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | may also be purchased at any medical supply store |
| Syringe, 10 cc, Luer lock tip | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip | BD Biosciences | 309602 | |
| 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 30 G needle | BD Biosciences | 305106 |
References
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
