Summary
Deux techniques peuvent être utilisées pour établir ce modèle: l'injection d'une suspension de cellules cancéreuses dans le mur caecal ou la transplantation d'un morceau de tumeur sous-cutanée sur le caecum. Ce modèle est utile pour étudier l'évolution naturelle du cancer colorectal et le test de nouveaux agents thérapeutiques contre le cancer colorectal.
Abstract
Le modèle de tumeur sous-cutanée traditionnelle est de moins de idéales pour étudier le cancer colorectal. Des modèles de souris orthotopique de cancer colorectal, qui disposent de plus en plus les cellules cancéreuses à leur emplacement naturel, de reproduire la maladie humaine avec une grande fidélité. Deux techniques peuvent être utilisées pour établir ce modèle. Les deux techniques sont similaires et nécessitent une anesthésie de la souris et la laparotomie pour l'exposition du caecum. Une technique consiste à injection d'une suspension de cellules du cancer colorectal dans le mur caecal. Les cellules cancéreuses sont d'abord mises en culture, récoltés quand subconfluentes et préparée comme une suspension cellulaire unique. Un petit volume de cellules est injecté lentement pour éviter les fuites. L'autre technique consiste à la greffe d'un morceau de tumeur sous-cutanée sur le caecum. Une souris avec une tumeur sous-cutanée préalablement établi colorectal est euthanasié et la tumeur est enlevée en utilisant une technique stérile. La pièce est divisée tumorale en petits morceaux pour la transplantation d'une autre souris. Avant la transplantation, le mur du cæcum est légèrement endommagé afin de faciliter l'infiltration des cellules tumorales. Le temps de développer des tumeurs primaires et des métastases hépatiques varie en fonction de la technique, la lignée cellulaire, et des espèces de souris utilisée. Ce modèle de souris orthotopique est utile pour étudier l'évolution naturelle du cancer colorectal et le test de nouveaux agents thérapeutiques contre le cancer colorectal.
Protocol
Préparation des cellules I.
- Cellules du cancer colorectal sont mis en culture et récoltés lors subconfluentes.
- Une suspension cellulaire unique est préparé en tampon phosphate salin et conservé sur glace.
II. Préparation tumeur
- Une souris avec une tumeur sous-cutanée préalablement établi colorectal est euthanasié.
- La tumeur est enlevée sous-cutanée à l'aide technique stérile et divisées en 2-3 morceaux mm
- Les morceaux de tumeur sont conservés dans un tampon phosphate salin sur la glace.
III. Préparation de la souris
Remarque: Dans notre laboratoire, nous utilisons inhalation d'isoflurane à anesthésier la souris, ou alternativement, on peut utiliser des anesthésiques injectables pour obtenir le même effet
- La profondeur de l'anesthésie est évaluée à l'aide pincement de l'orteil. Il ne faut pas retirer reflex avec pincement de l'orteil.
- Les antibiotiques peuvent être donnés à ce point.
- La souris anesthésiées, qui a été préalablement rasée, est correctement positionné.
- L'abdomen est préparée avec une solution de Betadine.
- L'abdomen et du site opératoire sont drapées d'une manière stérile.
IV. Laparotomie
- Une petite incision est faite dans la peau
- La musculature paroi abdominale est saisi et soulevé
- La cavité abdominale est entré et une seule lame des ciseaux est utilisé pour pousser le contenu intra-abdominal suite
- L'incision est prolongée à 2-3 cm
Exposition V. du cæcum
- Le caecum avec sa pochette finissant aveugle est identifié et extériorisé
- Le cæcum est isolé du reste de la souris en utilisant une pré-coupés, gaze stérile
- Saline chaude est utilisée pour conserver l'humidité du caecum
VI. L'injection de cellules dans le mur caecum
- Un G 27 ou une aiguille fine est utilisée pour injecter un volume de 50 ul de cellules dans le mur caecal
- L'aiguille est retirée
- Le site d'injection est inspecté pour s'assurer qu'aucun des fuites
- Le caecum est retourné à la cavité abdominale
VII. La transplantation de la tumeur sur le caecum
Remarque: En plus de l'injection de cellules dans le mur caecal, une approche alternative consiste à transplanter des tumeurs sur le cæcum
- Un chiffre de 8 points est placé sur le caecum en utilisant 6-0 ou 7-0 de suture de taille
- Le mur du cæcum est légèrement endommagé
- Ensuite, la pièce tumeur est positionné
- Le point est lié bas
- Le caecum est retourné à la cavité abdominale
VIII. Fermeture de la paroi abdominale de souris et de récupération
- Le mur de la souris abdominale est refermée en utilisant trois points de suture interrompue en utilisant 3-0 ou 4-0 de suture de taille
- Alternativement, on peut utiliser un simple point courir
- Post-opératoire des analgésiques et un bolus de liquide peut être donnée à ce stade
- La souris est autorisé à remettre de l'anesthésie.
Remarque: avec des anesthésiques inhalés cela prend généralement 30 secondes
IX. Résultats - tumeur primitive et métastase hépatique
Tumeur primitive - montré in situ (A) et avec des preuves de la néovascularisation (B); sur la coloration H & E, les tumeurs sont localement invasives (C)
Métastases hépatiques - montré ex vivo (D)
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Discussion
Bien que des modèles de souris de tumeurs sous-cutanées sont faciles à établir et à surveiller, il est clair que ce modèle ne peut pas répliquer le site original anatomique du cancer colorectal. En raison de la différence dans le micro, les cellules du cancer colorectal poussant sous la peau a été démontré que le changement de leur phénotype et échouent presque toujours au progrès et à métastaser 1,2. En fait, la réponse tumorale au traitement peut varier considérablement selon que les cellules cancéreuses sont implantées dans une grossesse ectopique (sous-cutanée) par rapport à l'emplacement orthotopique 3. Des modèles de souris orthotopique de cancer colorectal, qui disposent de plus en plus les cellules cancéreuses à leur emplacement naturel, de reproduire la maladie humaine avec une grande fidélité. Les deux techniques pour établir ce modèle ont des avantages et des inconvénients. L'injection d'une suspension cellulaire dans le mur caecal introduit cellules du cancer colorectal qui ont été précédemment croissante dans un environnement in vitro et sont sans doute homogène. Les cellules peuvent avoir réduit le potentiel invasif ou métastatique, après plusieurs passages en culture. La transplantation d'un morceau de tumeur sous-cutanée présente une population plus hétérogène de cellules cancéreuses qui ont été établies in vivo. Cependant, les tumeurs contiennent des cellules stromales et ont fréquemment des portions nécrosées qui peuvent affecter la cohérence de ce modèle (communication personnelle, I. Fidler, MD Anderson). Du point de vue technique, notre laboratoire a constaté que l'injection d'une suspension de cellules dans le mur caecal est plus difficile et comporte des risques de l'injection intraluminale et la fuite après l'injection. Fait intéressant, un modèle de souris orthotopique de cancer du rectum a été décrit qui ne nécessite pas de souris laparotomie 4. Les souris sont anesthésiées et la muqueuse rectale est un prolapsus avec une pression digitale. Un petit volume de cellules du cancer colorectal en suspension seule cellule est injecté sous-muqueuse. Primaire, cancers invasifs du rectum chez les souris développent dès la première semaine après l'injection, mais aucune des souris de développer des métastases hépatiques et les auteurs n'ont pas de commentaires sur la fréquence des metasases poumon.
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Acknowledgments
Département de chirurgie, Université de Californie à San Francisco
Raymond Shaheen, MD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line used | ||
| Phosphate Buffered Saline | BioWhittaker | 17-512F | also sold by a number of other vendors |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430790 | |
| 6 well plates with lid | BD Biosciences | 353046 | |
| Iris forceps, straight, serrated tips | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | best to have a pair of these instruments |
| Iris dissecting scissors, straight, sharp | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| Needle Holder (regular) | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| Needle Holder (Castroviejo) | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex |
| 6-0 or 7-0 suture | for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| 3-0 or 4-0 suture | for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| Anesthetic machine / Isoflurane | J.A. Baulch and Associates | 3206 | also sold by a number of other vendors |
| Heating Pad, disposable, 6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| Tape, orange, 13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | for restraining anesthetized mouse |
| Pro-Cord/Cordless Trimmer | Oster Professional Products | 78997-010 | for shaving mouse fur |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | may also be purchased at any medical supply store |
| 2 x 2 gauze, 3-ply | Johnson & Johnson | 7635 | may also be purchased at any medical supply store |
| Sterile Field, Barrier, 16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | may also be purchased at any medical supply store |
| Cotton tipped applicators, 6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | may also be purchased at any medical supply store |
| Syringe, 10 cc, Luer lock tip | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip | BD Biosciences | 309602 | |
| 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 30 G needle | BD Biosciences | 305106 |
References
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
