Summary
שתי טכניקות שניתן להשתמש בהם כדי לבסס את המודל הזה: הזרקה של השעיה תא סרטני בקיר cecal או השתלה של פיסת גידול תת עורי על cecum. מודל זה שימושי לחקר התפתחות טבעית של סרטן המעי הגס בדיקות סוכני טיפולית חדשה נגד סרטן המעי הגס.
Abstract
המודל הגידול המסורתי תת עורי הוא פחות אידיאלי לחקר סרטן המעי הגס. מודלים העכבר orthotopic של סרטן המעי הגס, אשר תכונה תאים סרטניים הגדלים במיקום הטבעי שלהם, לשכפל מחלות אנושיות עם איכות גבוהה. שתי טכניקות שניתן להשתמש בהם כדי לבסס את המודל הזה. טכניקות שניהם דומים דורש הרדמה העכבר laparotomy לחשיפה של cecum. אחת הטכניקות כולל הזרקה של השעיה סרטן המעי הגס התא בקיר cecal. תאים סרטניים גדלים הראשון תרבות, שנקטפו כאשר subconfluent ומוכן כמו השעיה תא בודד. נפח קטן של תאים מוזרק באיטיות, כדי למנוע דליפה. השיטה האחרת כרוכה השתלה של פיסת גידול תת עורי על cecum. עכבר עם גידול הוקמה בעבר המעי הגס תת עורית היא להרדים את הגידול הוסר באמצעות טכניקה סטרילית. היצירה הגידול מחולק לחתיכות קטנות להשתלה עכבר אחר. לפני ההשתלה, הקיר cecal ניזוק קלות כדי להקל על חדירת תאים סרטניים. הזמן לפתח גידולים ראשוניים גרורות בכבד ישתנו בהתאם הטכניקה, שורת תאים, ומינים העכבר בשימוש. זה מודל העכבר orthotopic שימושי לחקר התפתחות טבעית של סרטן המעי הגס בדיקות סוכני טיפולית חדשה נגד סרטן המעי הגס.
Protocol
I. הכנה Cell
- בתאי סרטן המעי הגס גדלים בתרבות שנקטפו כאשר subconfluent.
- ההשעיה תא בודד הוא הכין פוספט שנאגרו מלוחים ושמרה על הקרח.
השנייה. גידול הכנה
- עכבר עם גידול הוקמה בעבר המעי הגס תת עורית היא מורדמים.
- הגידול הוסר תת עורית באמצעות טכניקה סטרילית מחולק 2-3 חתיכות מ"מ
- חתיכות הגידול נשמרים פוספט שנאגרו מלוחים על הקרח.
ג. עכבר הכנה
הערה: במעבדה שלנו אנו משתמשים בשאיפה isoflurane להרדים את העכבר, לחילופין, ניתן להשתמש בזריקות הרדמה כדי להשיג את אותו אפקט
- עומק ההרדמה היא הוערכה באמצעות צביטה הבוהן. לא צריך להיות שום לסגת רפלקס עם קמצוץ הבוהן.
- אנטיביוטיקה יכולה להינתן בשלב זה.
- עכבר הרדים, אשר היה מגולח בעבר, ממוקם כראוי.
- הבטן היא prepped עם פתרון בבטאדין.
- הבטן אתר כירורגי הם עטופים בצורה סטרילית.
IV. Laparotomy
- ניק קטן עשוי בעור
- שרירי הבטן הקיר הוא תפס והרים
- חלל הבטן הוא נכנס להב יחיד של המספריים משמש לדחוף את התוך בטני תוכן משם
- החתך מורחב 2-3 ס"מ
V. חשיפה של cecum
- Cecum עם כיס סיום עיוור שלו מזוהה exteriorized
- Cecum הוא מבודד משאר של העכבר בעזרת מראש לחתוך, גזה סטרילית
- מלוחים חם משמש כדי לשמור על לחות cecum
VI. הזרקה של תאים לתוך החומה Cecal
- G 27 או מחט עדינה משמש להזריק נפח 50 μL של תאים לתוך הקיר cecal
- המחט מוסרת
- הזריקה נבדק כדי להבטיח שאין דליפה
- Cecum הוא חזר אל חלל הבטן
VII. השתלה של גידול על גבי cecum
הערה: בנוסף הזרקת תאים לתוך הקיר cecal, גישה חלופית היא השתלת הגידול אל cecum
- דמות של תפר 8 מושם על cecum באמצעות 6-0 או 7-0 תפר בגודל
- הקיר cecal ניזוק קלות
- לאחר מכן, פיסת הגידול ממוקם
- תפר הוא כבול
- Cecum הוא חזר אל חלל הבטן
VIII. דופן הבטן עכבר סגירת ושחזור
- הקיר עכבר בטן סגור באמצעות שלושה תפרים קטע באמצעות 3-0 או 4-0 תפר בגודל
- לחלופין, אפשר להשתמש תפר פועל פשוט
- לאחר הניתוח משככי כאבים וכן בולוס נוזלים יכולה להינתן בשלב זה
- העכבר הוא מותר להתאושש מן ההרדמה.
הערה: עם הרדמה נשאפים זה בדרך כלל לוקח 30 שניות
IX. תוצאות - הגידול הראשוני ו גרורות בכבד
הגידול הראשוני - הראו באתרו (A) עם עדות neovascularization (ב); על צביעת H & E, גידולים פולשניים מקומי (C)
גרורות בכבד - הראו לשעבר vivo (ד)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות העכבר מודלים תת עורית גידול קל להקים לפקח, ברור כי מודל זה לא יכול לשכפל את האתר האנטומי המקורי של סרטן המעי הגס. בשל השוני microenvironment, תאים סרטן המעי הגס גדל מתחת לעור הוכחו לשנות הפנוטיפ שלהם כמעט תמיד נכשלים התקדמות גרורות 1,2. למעשה, תגובת הגידול לטיפול יכולים להשתנות באופן דרמטי, תלוי אם התאים הסרטניים מושתלים חוץ רחמי (תת עורית) לעומת המיקום orthotopic 3. מודלים העכבר orthotopic של סרטן המעי הגס, אשר תכונה תאים סרטניים הגדלים במיקום הטבעי שלהם, לשכפל מחלות אנושיות עם איכות גבוהה. שתי טכניקות להקים מודל זה יש יתרונות וחסרונות ייחודיים. הזרקה של השעיה תא בקיר cecal מציגה בתאי סרטן המעי הגס אשר היו בעבר גדל בסביבה במבחנה הומוגניות לטעון. תאים יכול להיות מופחת פוטנציאל פולשני או גרורתי לאחר מספר קטעים בתרבות. השתלה של פיסת תת עורית מציגה גידול האוכלוסייה הטרוגנית יותר של תאים סרטניים שהוקמו in vivo. עם זאת, גידולים בתאי סטרומה מכילים לעתים קרובות יש חלקים נמקי אשר עשויים להשפיע על עקביות של מודל זה (תקשורת אישית, אני פידלר, MD Anderson). מבחינה טכנית, במעבדה שלנו מצא כי הזרקה של השעיה תא בקיר cecal קשה יותר ונושא הסיכונים של הזרקת intraluminal ו דליפה לאחר ההזרקה. מעניין לציין, כי במודל העכבר orthotopic של סרטן הרקטום תוארה שאינה דורשת עכבר laparotomy 4. עכברים מורדמים ואת צניחת רירית החלחולת הוא עם לחץ דיגיטלי. נפח קטן של תאים סרטן המעי הגס ההשעיה תא יחיד מוזרק submucosally. ראשית, סרטן פי הטבעת לפתח פולשני בעכברים מוקדם ככל שבוע לאחר ההזרקה, אך אף אחד העכברים לפתח גרורות בכבד המחברים לא הגיב על תדירות metasases ריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחלקה לכירורגיה, אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו
ריימונד שאהין, MD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line used | ||
| Phosphate Buffered Saline | BioWhittaker | 17-512F | also sold by a number of other vendors |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430790 | |
| 6 well plates with lid | BD Biosciences | 353046 | |
| Iris forceps, straight, serrated tips | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | best to have a pair of these instruments |
| Iris dissecting scissors, straight, sharp | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| Needle Holder (regular) | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| Needle Holder (Castroviejo) | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex |
| 6-0 or 7-0 suture | for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| 3-0 or 4-0 suture | for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| Anesthetic machine / Isoflurane | J.A. Baulch and Associates | 3206 | also sold by a number of other vendors |
| Heating Pad, disposable, 6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| Tape, orange, 13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | for restraining anesthetized mouse |
| Pro-Cord/Cordless Trimmer | Oster Professional Products | 78997-010 | for shaving mouse fur |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | may also be purchased at any medical supply store |
| 2 x 2 gauze, 3-ply | Johnson & Johnson | 7635 | may also be purchased at any medical supply store |
| Sterile Field, Barrier, 16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | may also be purchased at any medical supply store |
| Cotton tipped applicators, 6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | may also be purchased at any medical supply store |
| Syringe, 10 cc, Luer lock tip | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip | BD Biosciences | 309602 | |
| 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 30 G needle | BD Biosciences | 305106 |
References
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
