Summary

Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

Published: May 29, 2013
doi:

Summary

Come le reti neuronali sono stabiliti nel cervello embrionale è una questione fondamentale nella neurobiologia dello sviluppo. Qui abbiamo combinato una tecnica di elettroporazione con nuovi strumenti genetici, come ad esempio Cre / Lox-plasmidi e PiggyBac-mediata sistema trasposizione del DNA nel romboencefalo aviaria di etichettare interneuroni dorsali e monitorare le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche a vari stadi di sviluppo.

Abstract

Elettroporazione del pulcino embrionale tubo neurale ha molti vantaggi come essere veloce ed efficiente per l'espressione di geni estranei in cellule neuronali. In questo manoscritto forniamo un metodo che dimostra univocamente come l'elettroporazione di DNA nel cervello posteriore aviaria in E2.75, al fine di etichettare specificamente un sottoinsieme di progenitori neuronali, e come seguire le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche in Gran fase avanzata di sviluppo, fino a E14.5. Abbiamo utilizzato nuovi strumenti genetici tra cui specifici elementi enhancer, Cre / Lox – plasmidi base e il sistema di recepimento DNA PiggyBac-mediata di guidare l'espressione della GFP in un sottotipo di cellule romboencefalo (la dorsale più sottogruppo di interneuroni, DA1). Traiettorie e target di DA1 assoni assonale sono seguiti a inizio e fine fasi embrionali in varie regioni del tronco encefalico. Questa strategia contribuisce tecniche avanzate per il targeting di cellule di interesse nel romboencefalo embrionale e per il TRACing formazione circuito a più stadi di sviluppo.

Introduction

Romboencefalo rappresenta un mozzo relè chiave del sistema nervoso comunicando tra il sistema nervoso centrale e periferico tramite ascendente e discendente reti neuronali. Esso regola le funzioni di base tra cui la respirazione, la coscienza, l'udito, e la coordinazione motoria 1-3. Durante lo sviluppo embrionale precoce, la romboencefalo vertebrati viene transitoriamente suddiviso lungo il suo asse antero-posteriore (AP) in rhombomeres ripetitivi, in cui si formano diversi tipi di cellule neuronali e generano molteplici centri nuclei del tronco cerebrale 4. Il cervello posteriore è diviso lungo il suo asse dorso-ventrale (DV) in una piastra basale e alari, in cui progenitori neuronali discrete diventano specificati e differenziano in distinti luoghi DV 3,5,6. Come il primo AP e specifiche DV modelli neuronali sono di istituzione dei circuiterie tronco cerebrale funzionale è in gran parte sconosciuto.

Di acquisire conoscenze su questo fondamentalequestione, gli strumenti sono necessari al fine di etichettare specifici sottoinsiemi di neuroni nel cervello posteriore e presto per tracciarne la traiettoria degli assoni e la connettività nelle fasi più avanzate. Abbiamo precedentemente utilizzati specifici elementi enhancer, e un sistema di espressione condizionale Cre / loxP-based per il monitoraggio traiettoria assonale delle dorsali interneuroni spinali nei primi embrione di pollo 7-9. Nel manoscritto attuale abbiamo preso di mira il cervello posteriore e aggiornato il paradigma sperimentale per l'etichettatura di fine interneuroni romboencefalo embrionali, gli assoni e ai loro obiettivi sinaptici, utilizzando una strategia di elettroporazione modificato e il PiggyBac – trasposizione del DNA mediata. La nostra nuova strategia permette la codifica dei sottotipi neuronali distinti in un lato del cervello posteriore e il tracciamento delle loro proiezioni assonali e siti sinaptici nelle varie fasi embrionali, da 2 a 12 giorni dopo l'elettroporazione. In base a questo metodo, abbiamo etichettato la dorsale più a sottogruppo di interneuroni romboencefalo (dA1/Atoh1 + </sup> celle) e ha rivelato due controlaterale ascendenti modelli di proiezione assonale, ogni deriva da una posizione diversa AP e allunga in un funicolo distinto. sono stati trovati DA1 assoni al progetto e formano sinapsi nei nuclei uditivi, mesencefalo e in strati multipli del cervelletto 10.

La combinazione di pulcino elettroporazione, genetica rintracciamento di neuroni e analisi di siti per proiezioni molto stadi avanzati di sviluppo prevede una piattaforma unica per studiare la formazione di reti neuronali nel cervello e per chiarire i meccanismi molecolari che presiedono circuito.

Protocol

1. Romboencefalo elettroporazione 1.1 gestione Egg Mettere le uova orizzontalmente in un incubatore umidificato (37-38,5 ° C). Gli embrioni sono elettroporati dopo 65-70 ore di incubazione, quando raggiungono 16-17 (HH) stadio (25-30 somiti). Togliere le uova dal termostato, rimangono in posizione orizzontale. 1.2 Preparativi Tirare vetro capillari (0,5 mm di diametro). Collegare piegati a forma di L oro Genetrodes ele…

Representative Results

Questo protocollo è stato recentemente utilizzato per scoprire i modelli assonale e siti di proiezione di DA1 sottogruppo di interneuroni nella romboencefalo pulcino 10. Per etichettare specificamente questi assoni, un elemento enhancer (Atoh1), che è stata precedentemente caratterizzata da specifici per i neuroni spinali DI1 8,12,13, è stato confermato da esprimere in romboencefalo DA1 cellule 10. L'elemento è stato clonato a monte di Cre ricombinasi e co-elettroporato a E2.75 i…

Discussion

In elettroporazione ovo è uno strumento fattibile, affidabile ed efficace per esaminare le specifiche delle cellule e la guida assonale durante pulcino sviluppo del sistema nervoso 20. In questo protocollo si descrive una modalità di elettroporazione in romboencefalo pulcino a E2.75 utilizzando elementi enhancer che consentano l'etichettatura condizionale di interneuroni specifici. Questa strategia è combinato con il sistema di recepimento PiggyBac-mediata di inserire geni estranei ne…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> Ringraziamo il Dott. Yuval Gottlieb-Dror per l'illustrazione elettroporazione. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a DSD presso l'Istituto Nazionale per la Psicobiologia in Israele e dal programma di cooperazione di ricerca Niedersachsen-Israele e da sovvenzioni per AK da The Israel Science Foundation, il Ministero Israele di salute, e il centro di eccellenza del Patrimonio-Legacy Biomedical Science collaborazione.</p>

Materials

Name of Reagent/Equipment Company Catalogue Number
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes BTX, Harvard Apparatus 45-0162
pulse generator, ECM 830 BTX, Harvard Apparatus 45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound Tissue-Tek Sakura 4583 O.C.T. Compound
Nail Polish From Any Commercial Supplier

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Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (75), e50136, doi:10.3791/50136 (2013).

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