Vurdering af gastrisk tømning hos ikke-overvægtige diabetiske mus ved anvendelse af en [ Published: March 23, 2013 doi: 10.3791/50301

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Christopher T. Creedon¹, Pieter-Jan Verhulst¹, Kyoung M. Choi¹, Jessica E. Mason¹, David R. Linden¹, Joseph H. Szurszewski¹, Simon J. Gibbons¹, Gianrico Farrugia¹

¹Enteric Neuroscience Program, Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

Summary

Bestemmelse af ventrikeltømning med en non-invasiv [

Abstract

Gastrisk tømning af mus har været begrænset af den manglende evne til at følge mavetømning ændringer hos det samme dyr, idet de mest almindeligt anvendte teknikker kræver aflivning af dyrene og postmortem genvinding af måltidet ^1,2. Denne fremgangsmåde forhindrer forløbsundersøgelser at bestemme ændringer i ventrikeltømning med alderen og progression af sygdommen. De almindeligt anvendte ^[13 C]-octansyre-breath test for mennesker ³ er blevet modificeret til brug i mus ^4-6 og rotter ⁷ og vi tidligere viste, at denne test er pålidelig og reagerer på ændringer i mavetømning i forbindelse med lægemidler og under diabetisk sygdomsprogression ^8. I denne video præsentation princippet og praktiske gennemførelse af denne modificerede test forklares. Som i den tidligere undersøgelse, er NOD-LTJ mus anvendes, en model for type 1 diabetes ^9. En del af disse mus udvikler symptomer på gastroparese, en komplikation Diabetes karakteriseret ved forsinket gastrisk tømning uden mekanisk obstruktion af maven ^10.

Dette papir viser hvordan man træner musene til test, hvordan man kan forberede testen måltid og få 4 hr ventrikeltømning data og hvordan man analysere de opnåede data. The kulstofisotoperne analysator anvendes i den foreliggende undersøgelse er egnet til automatisk prøvetagning af luftprøver fra op til 12 mus på én gang. Denne teknik tillader den langsgående opfølgning af gastrisk tømning fra større grupper af mus med diabetes eller andre langvarige sygdomme.

Introduction

Dette håndskrift beskriver de tekniske og metodiske overvejelser, der er involveret i ikke-invasiv måling af ventrikeltømning hos mus. Ved at følge protokollen beskrevet her, kan efterforskerne pålideligt og reproducerbart følge ændringer i gastrisk tømning på grund af udvikling af sygdom, studere virkningen af farmakologiske midler på ventrikeltømning og følg reaktion af ventrikeltømning til behandling af underliggende sygdomme eller defekter ^{6,8, 11,12.} I tidligere publikationer, octansyre ånde tests anvendelsen af ¹³ C viste sig at være en nyttig måde at måle mavetømning hos mennesker og dyr ^3,8. Dette papir beskriver i detaljer, de procedurer, der er nødvendige for at få pålidelige data over 6 til 8 måned, der er nødvendige for en forløbsundersøgelse af ventrikeltømning i mus med diabetes. Fordelene ved at følge denne protokol i forhold til tidligere offentliggjorte metoder er, at undersøgeren kan sikres dataene obtained vil være pålidelig og reproducerbar. Endvidere beskrives det automatiserede system til indsamling og analyse af gasprøver her forøger antallet af dyr, der kan følges samtidigt i en undersøgelse. Overordnet er målet med dette oplæg er at identificere de vigtigste faktorer, der vedligeholder tilvænning af musene på prøve og at reducere variation i opnåede resultater.

For in vivo måling af ventrikeltømning, musene fastet natten over og lagt i gennemsigtig plast test kamre med konstant luftstrøm. Efter musene bliver vant til rørene, baseline udåndede ¹³ _CO2-niveauet bestemmes og luftstrømmen justeres i overensstemmelse hermed. Dernæst vi administrerer et testmåltid, der består af æggeblomme blandes med ^13C-mærket octansyre. Fordi musene fastes og trænes, er de generelt spiser test måltid inden 2 min. Den indgivne octansyre ikke absorberes i maven, men vil blive optaget i duodenum end vil blive metaboliseret i leveren til ¹³ CO _2, som udsendes og udåndes, hvilket resulterer i en berigelse af ¹³ _CO2 i den omgivende luft. Luft opsamles med bestemte tidsintervaller og analyseres af kulstofisotoperne analysatoren. Den hastighedsbegrænsende trin i hele denne proces er gastrisk tømning og den pulmonale udskillelse af ¹³ CO ₂ direkte svarer mavetømning af det mærkede måltid.

Figur 1. Skematisk af ventrikeltømning apparat. Efter faste natten over, anbringes musene i gennemsigtige kamre giver dem mulighed for at bevæge sig og dreje frit. Et indløbsrør tillader frisk og konstant luft indstrømning og et udløb fører til isotop analysatoren til måling af ^13C-12C-forhold i den udåndede luft. Kammeret har også en central port til afgivelse af fødevarer, der indeholder ^{[13C]-octansyre.}

Protocol

1. Uddannelse og Tilvænning af Mus

1. Før analyse sætte alle mus i prøvningen kamre i 2-4 timer med konstant luftstrøm for at vænne dem til de testbetingelser. Dette reducerer markant stressniveauet, der ellers kunne forårsage afvigende påvisning af forsinket ventrikeltømning. Behandl musene på samme måde, som hvis ventrikeltømning eksperimentet kører. Forbered æggeblomme (se nedenfor) uden tilsætning af octansyre og foder 0,2 g til hver mus.
2. Gentag denne proces indtil musene er tilstrækkeligt uddannet (typisk 2-3 gange). Musene typisk let habituated så længe de miljømæssige betingelser holdes på det samme.

Bemærk: Ikke-tilvænnede mus fortsætter med at bevæge sig rundt i ca 1 time efter overførsel til kammeret, og defecate og urinere hyppigt, mens tilvænnede mus hurtigt bosætte sig i deres nye omgivelser og hvile roligt.

Nejte: Under eksperimentet: Overvåg dyr for tegn på tab af tilvænning, såsom overskydende vandladning, afføring, manglende interesse i at spise ægget. Hvis dette er tilfældet finder re habituating i et tomt kammer 1-2 gange forud for opnåelse af mavetømning data. Sammenhæng er yderst vigtigt, mens du gør dette eksperiment. At gøre tingene på nøjagtig samme måde hver gang er den eneste måde at få pålidelige og reproducerbare resultater. Dette omfatter giver behandling (fx insulin) hver dag på samme tid, ikke at adskille de mus fra deres bur-hjælpere medmindre det er absolut nødvendigt, faste musene og starter mavetømning prøven på samme tid, og håndtering musene på samme måde.

2. Forberedelse af Isotope indeholdende Test Meal

1. Starte med at afveje 5 g æggeblomme i et 50 ml Falcon-rør. Gentag disse trin hver eksperimentel dag for at forberede en ny test måltid.
2. Der tilsættes 10 ul octansyre med en concentrtion på 2 gl / g til 50 ml Falcon-rør indeholdende ægget og blandes kraftigt i 1 min med en spatel i Falcon-rør.
3. Ægget overføres derpå til et bægerglas og opvarmes over en bunsenbrænder, indtil den størkner, og dens konsistens er egnet til at foretage små kugler. Det tager typisk omkring 30 sek.

Bemærk: kugler af æggeblomme bør veje 0,2 g pr mus. Det er vigtigt at holde den kumulative dosis konstant i alle musene.

3. Start af Experiment

1. Når uddannet og klar til ventrikeltømning, hurtig musene natten over (12 timer) på en metal "mesh-bottom" fastende rack til at forhindre coprophagia. Sørg for, at de har fri adgang til drikkevand. Da diabetiske mus anvendes i den nuværende forsøg, bør de ikke fastet i mere end 16 timer.
2. Start med at oprette de ventrikeltømning kamre. Brug rene kamre og dæksler, der har været lufttørret. Også enhverrør forbinder kamrene til analysatoren eller CO ₂ lufttilførsel skal være fugt fri, vand kan interferere med signalet læses af analysatoren
3. Tilslut kamrene til indløbsrør, der giver en konstant luftstrøm. Derefter forbinde outlet rør fra kamrene til maskinen. Luk rørene og tænde for luftstrømmen.

Bemærk: Påfør en meget lille mængde vaseline i slutningen af dækslet låg, så de lukker nemt og sikkert lukket. Denne tæt forsegling er nødvendig for at indsamle al kuldioxiden produceret af mus.

4. Eksperimentelle procedurer

1. Start ud ved at veje hver mus. Kropsvægt er et mål for deres fortsatte et godt helbred. Placer derefter hver mus i passende kammer. Det er naturligvis vigtigt at have den luft, der strømmer ind i kamrene på nuværende tidspunkt.
2. For at starte målingen, så musene at akklimatisere sig til kamrene før justereING luften niveauer.
3. Når musene synes roligt, kan der gå et par minutter, justere luftmængden for hver mus kammer. Dette kan være forskellige for hver mus. Typisk luftstrømmen justeres ved forsøgets begyndelse for at sikre, udåndet CO ₂ når følsomhedsgrænsen det udstyr bliver brugt, og for at sikre, at niveauet forbliver lav nok til at sikre en sund luft omsætning. Vi bruger de første CO _2-niveauer mellem 1.000 og 1.500 ppm.
4. Hvis har problemer med justeringer, så tjek for utætheder. Derefter gentage processen for hvert af kamrene og se efter en anden runde af målinger for at se, om justeringer af luftstrømmen har rettet det CO _2-niveau. Det er vigtigt at opnå en konstant basislinie læsning før fodring musene. Vi bruger en maskine med en selvkalibrering funktion. Hvis dette ikke er tilfældet Kalibreringen bør kontrolleres.
5. Når dette er opnået, administrere ægget måltidtil den første mus og registrere den tid, hver mus modtager fødevarer.
6. Vi køre proceduren i 4 timer til opnåelse af tilstrækkeligt med henblik på montering af ¹³ CO ₂ berigelse kurve for hver mus. Tjek på musene hver 30-60 min for at sikre, at CO _2-niveauer er stadig sikkert for musene.
7. Fremstille nye kasser med fødevarer inden afslutningen af ​​testen, så musene kan begynde at spise straks efter testen er færdig.

Representative Results

Et repræsentativt datasæt fra tre forskellige mus er vist i figur 2. Den sorte kurven repræsenterer de datapunkter fra en mus med normale mavetømning. Det viser fraktionen af ^13C, som genvindes i den udåndede luft udtrykt som en procentdel af den indgivne dosis per time udtrykt som en funktion af tiden. Den blå kurve er fra en mus med en fremskyndet gastrisk tømning med en T halv værdi af 40 min, og den røde kurve er fra en mus med en forsinket ventrikeltømning med en T halv værdi af 168 min. Som konstateret i et tidligere forsøg i vores laboratorium ^7, normal gastrisk tømning halv tid til en ikke-diabetiske NOD mus alderen 9-15 uger spænder fra 62 til 131 min som repræsenteret ved den grå kasse. Datapunkterne derpå monteret af en ikke-lineær regressionskurve med den følgende ligning ^8:

y = ved ^{b e-ct}

Hvor y er den procentdel af 1/2)

beregnes ud fra en numerisk integration procedure anvendelse af en invers gamma-funktion. Vi har opnået resultater fra flere tusinde undersøgelser med en biologisk intra-muse-variabilitet på omkring 10%.

Figur 2. Repræsentative ventrikeltømning data fra tre forskellige mus med normal (sort kurve), forsinket (rød kurve) og accelereret (blå kurve) ventrikeltømning. Den grå boks fremhæver normale værdier. Ligningen af ​​ikke-lineær regression kurver er vist i kassen.

Discussion

Den beskrevne teknik heri muliggør gentagen og ikke-invasiv in vivo måling af faststof gastrisk tømning hos mus. Dette system har den fordel, at dyrene ikke er fastholdt i målekammeret, så de kan bevæge sig og dreje frit. Da dette er et ukendt miljø, musene stadig nødt til at være uddannet og vant til test kamre for at undgå virkningerne af stress på ventrikeltømning. I almindelighed antager vi de mavetømning data er pålidelige, hvis den intra-mus variabilitet mellem på hinanden følgende mavetømning test er mindre end 10%.

Denne rapport er en mere detaljeret beskrivelse af vores tidligere rapporter om gastriske tømning målinger i mus ^8,11,12 og omfatter yderligere oplysninger om fejlfinding problemer med systemet. Den vigtigste modifikation er anvendelsen af ​​LGR isotop analysatoren til måling gasniveauer. Analyseapparatet vi brugte i den foreliggende undersøgelse måler ¹² CO 13 CO _2, og H ₂ O koncentrationer hvert sekund. De computerstyrede ventiler i multiple-input-enhed automatisk skifte strømmen til detektoren mellem muse kamre hver 25 sek. Derfor 12 mus kan analyseres samtidig med en 5 min interval mellem aflæsninger. Det skal bemærkes, at dataene også kan opnås ved manuel prøveudtagning af den udåndede luft og efterfølgende analyse. Hvis manuelt sampling eller en anden enhed, skal du sørge aflæsninger opnås ved omkring 10 minutters intervaller. Følsomheden af ​​vores system og hyppigheden af ​​prøvetagningen betyder, at de mavetømning kurverne er mere pålidelige, lettere at montere og derfor har vi fundet, at vi få mere reproducerbare data med denne forbedrede fremgangsmåde.

De største faldgruber i denne teknik forekomme når musene ikke spise måltidet inden for den tildelte tid, når musene mister deres tilvænning til kammeret, og når der opstår tekniske problemer med påvisning sysmet. Manglende spise måltidet og tab af tilvænning er normalt en konsekvens af ikke at følge den afgørende skridt for at have en regelmæssig tidsplan for testning. Efter 3 på hinanden følgende prøver adskilt af 7 dage eller mindre, bliver vores mus vant til testen og spise måltidet. Når vant, er pålidelige data opnået, hvis musene testes mindst en gang hver 2 uger for resten af ​​forsøget. Hvis du af en eller anden grund musene er ikke blevet testet for 3 eller flere uger derefter to træningssessioner inden for en uge vil normalt sikre tilvænning. Hvis de personer, der håndterer dyrene skifter derefter omskoling af musene tilrådes, og det er særligt vigtigt at modvirke brugen af ​​stærkt duftende sæber og / eller parfumer med de mennesker, der håndterer mus. Vanskeligheder med detektionssystemet er ofte på grund af de lave niveauer af ¹³ CO ₂ genereret af et lille dyr som en mus. Detektoren skal kalibreres og for nogle detektorer såsom infrarøde baserede systemer, er det meget important at reducere vandindholdet af prøven til et minimum, inden målinger.

Der er få begrænsninger for denne teknik, medmindre den forsøgsansvarlige ønsker at studere mavetømning hyppigere end én gang hver 3 dage i samme mus. Det kan ikke anbefales at faste musen så ofte og så kosten begrænsning på en regelmæssig basis kan ændre gastrisk funktion. Modifikationer af teknikken kan foretages til at måle væske gastrisk tømning, og det er en nyttig potentiel anvendelse af fremgangsmåden.

Andre metoder til måling af mavetømning, herunder scintigrafi eller måling bibeholdt indhold efter et fastlagt tidsrum er signifikant flere begrænsninger, herunder problemer med stress af processen eller som følge af behovet for at dræbe dyret ved afslutningen af ​​hver test. Stressfaktorer omfatter gavage af testen måltid eller fastholdelse af dyret under målingen. Fordelene ved breath testen, at musen frit bevæger sig og ikke bedøveteller bedøvet på nogen måde.

Sammenfattende tillader ^{13C-octansyre} udåndingsprøve studiet af sygdomsprogression med alderen og behandling, og disse data kan derpå korreleres med ændringer i andre fysiologiske parametre og histologisk evaluering hos det samme dyr. Blandt andre anvendelser, også testen tillader undersøgelse af, hvordan lægemidler kan direkte ændre mavetømning og undersøge reaktionen på behandling i dyr, som udvikler ændringer i mavetømning som følge af sygdomme eller andre indgreb.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A source of constant air-supply, flow as well as composition	central air supply in the research facility
130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply	In-house built
Octanoic acid	Cambridge isotope laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
To prepare the egg meal: small beaker 50 ml plastic tube Bunsen burner egg spatula	Any supplier		Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal
Carbon dioxide isotope analyzer	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)