La valutazione di svuotamento gastrico in non-obesi topi diabetici utilizzando un [ Published: March 23, 2013 doi: 10.3791/50301

DOI

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Christopher T. Creedon¹, Pieter-Jan Verhulst¹, Kyoung M. Choi¹, Jessica E. Mason¹, David R. Linden¹, Joseph H. Szurszewski¹, Simon J. Gibbons¹, Gianrico Farrugia¹

¹Enteric Neuroscience Program, Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

Summary

Determinazione di svuotamento gastrico con un non-invasiva [

Abstract

Gastrico studi svuotamento nei topi sono stati limitati dalla incapacità di seguire i cambiamenti di svuotamento gastrico, nello stesso animale, poiché le tecniche più comunemente utilizzate richiedono l'uccisione degli animali e il recupero post-mortem del ^1,2 pasto. Questo approccio evita studi longitudinali per determinare le variazioni di svuotamento gastrico con l'età e la progressione della malattia. Il comunemente usato ^[13 C]-ottanoico breath test con l'acido per l'uomo ³ è stato modificato per l'uso nel topo e nel ratto ^{4-6 7} e abbiamo precedentemente dimostrato che questo test è affidabile e sensibile alle variazioni di svuotamento gastrico in risposta ai farmaci e durante progressione di malattia diabetica ^8. In questo video di presentazione il principio e l'attuazione pratica di questo test modificato è spiegato. Come nel precedente studio, i topi NOD LTJ vengono utilizzati, un modello di diabete di tipo 1 ^9. Una quota di questi topi sviluppano i sintomi di gastroparesi, una complicazione di Diabetees caratterizzata da ritardato svuotamento gastrico senza ostruzione meccanica dello stomaco ^10.

Questo documento dimostra come addestrare i topi per i test, come preparare il pasto di prova e ottenere 4 ore di dati di svuotamento gastrico e come analizzare i dati ottenuti. L'analizzatore isotopo di carbonio utilizzati nel presente studio è adatto per il campionamento automatico dei campioni di aria da un massimo di 12 topi contemporaneamente. Questa tecnica permette di follow-up longitudinale di svuotamento gastrico da grandi gruppi di topi con diabete o altre malattie di lunga durata.

Introduction

Questo manoscritto descrive le considerazioni tecniche e metodologiche implicate nella misurazione non invasiva di svuotamento gastrico nei topi. Seguendo il protocollo qui descritto, gli investigatori in modo affidabile e riproducibile seguire le modifiche di svuotamento gastrico a causa dello sviluppo della malattia, studiare l'impatto di agenti farmacologici sullo svuotamento gastrico e seguire la risposta di svuotamento gastrico per il trattamento di malattie sottostanti o difetti ^{6,8, 11,12.} In precedenti pubblicazioni, l'applicazione di ¹³ C test di respiro acido ottanoico ha dimostrato di essere un modo utile per misurare svuotamento gastrico nell'uomo e negli animali ^3,8. Questo documento descrive in dettaglio, le procedure necessarie per ottenere dati affidabili sul 6-8 mesi necessari per uno studio longitudinale di svuotamento gastrico nei topi con diabete. I vantaggi di seguire questo protocollo rispetto ai metodi precedentemente pubblicati sono che il ricercatore può essere assicurato il richiederlo datid sarà affidabile e riproducibile. Inoltre, il sistema automatizzato per la raccolta e l'analisi dei campioni di gas descritto qui aumenta il numero di animali che possono essere seguiti simultaneamente in uno studio. Nel complesso, l'obiettivo di questo lavoro è quello di identificare i fattori chiave che mantengono assuefazione dei topi al test e che ridurre la variabilità nei risultati ottenuti.

Per la misurazione in vivo di svuotamento gastrico, i topi sono tenuti a digiuno per una notte e messo nelle camere di prova di plastica trasparente con portata costante. Dopo i topi vengono abituati ai tubi, al basale esalato ¹³ CO ₂ livelli sono determinati e flusso d'aria adeguato di conseguenza. Successivamente, l'amministrazione di un pasto di prova costituito da tuorlo d'uovo mescolato con ¹³ C-marcato acido ottanoico. Poiché i topi a digiuno e formati, in genere mangiare il pasto di prova entro 2 minuti. Il somministrato acido ottanoico non viene assorbito nello stomaco, ma sarà ripreso nel duodeno und otterrà metabolizzato nel fegato in ¹³ CO _2, che viene rilasciato ed espirata, con un conseguente arricchimento di ¹³ CO _{2 nell'aria} circostante. Campioni d'aria sono raccolti ad intervalli di tempo determinati ed analizzati mediante l'analizzatore degli isotopi di carbonio. Il rate-limiting passo in questo processo è lo svuotamento gastrico e l'escrezione polmonare di ¹³ CO ₂ corrisponde direttamente con lo svuotamento gastrico del pasto marcato.

Figura 1. Schema dell'apparato svuotamento gastrico. Dopo il digiuno notturno, i topi sono posti in camere trasparenti, che consentano loro di muoversi e girare liberamente. Un tubo di ingresso permette afflusso di aria fresca e costante ed una uscita conduce l'analizzatore per misurare l'isotopo ^{13 C-a-12}Rapporto C nel respiro esalato. La camera dispone anche di una porta centrale per la consegna di prodotti alimentari contenenti ^[13 C]-acido ottanoico.

Protocol

1. Formazione e assuefazione dei Topi

1. Prima dell'analisi, mettere tutti i topi nelle camere di prova per 2-4 ore con flusso d'aria costante, al fine di abituarli alle condizioni di prova. Questo riduce notevolmente i livelli di stress che altrimenti potrebbero causare il rilevamento aberrante di ritardato svuotamento gastrico. Trattare i topi stesso modo se l'esperimento svuotamento gastrico è in esecuzione. Preparare il tuorlo d'uovo (vedi oltre), senza l'aggiunta di acido ottanoico e alimentare 0,2 g per ogni mouse.
2. Ripetere questo processo fino a quando i topi sono sufficientemente formati (in genere 2-3 volte). I topi sono tipicamente abituano facilmente purché le condizioni ambientali sono mantenuti uguali.

Nota: non abituati topi continuano a muoversi per circa 1 ora dopo il trasferimento alla camera, e defecare e urinare frequentemente, mentre i topi abituati rapidamente stabilirsi nel loro nuovo ambiente e distendersi.

Note: Durante l'esperimento: gli animali Monitor per i segni di perdita di assuefazione, come eccesso di minzione, defecazione, mancanza di interesse per mangiare l'uovo. Se questo è il caso considerare nuovamente abituare in una camera vuota 1-2 volte prima di ottenere dati di svuotamento gastrico. La coerenza è molto importante mentre si fa questo esperimento. Fare le cose esattamente nello stesso modo ogni volta che è l'unico modo per ottenere risultati affidabili e riproducibili. Questo include dare trattamento (ad esempio insulina) ogni giorno, allo stesso tempo, non separando i topi dai loro compagni di gabbia se non assolutamente necessario, digiuno i topi e iniziare il test di svuotamento gastrico, allo stesso tempo, e il trattamento di topi stesso modo.

2. Preparazione del Isotope contenenti farina di prova

1. Inizia con peso di 5 g di tuorlo d'uovo in una provetta da 50 ml falco. Ripetere questi passaggi ogni giorno sperimentale per preparare un pasto fresco di prova.
2. Aggiungere 10 ml di acido ottanoico con un Concentrazionezione di 2 pl / g al tubo da 50 ml falco contenente l'uovo e mescolare energicamente per 1 minuto con una spatola nel tubo falcon.
3. L'uovo viene poi trasferito in un bicchiere di vetro e riscaldato su un becco Bunsen fino coagula e la sua consistenza è adatto a fare palline. Questo richiede in genere circa 30 sec.

Nota: Le sfere di tuorlo d'uovo dovrebbe pesare 0,2 g per topo. Questo è importante per mantenere la dose cumulativa costante in tutti i topi.

3. Di iniziare l'esperimento

1. Una volta addestrato e pronto per lo svuotamento gastrico, veloce i topi durante la notte (12 ore) su un metallo "mesh-bottom" rack digiuno per evitare coprofagia. Assicurarsi che hanno libero accesso ad acqua potabile. Poiché topi diabetici sono usati nell'esperimento corrente, non dovrebbero essere tenuti a digiuno per più di 16 ore.
2. Inizia la creazione di camere di svuotamento gastrico. Utilizzare camere pulite e le coperture che sono stati essiccati all'aria. Inoltre, qualsiasitubi che collegano le camere all'analizzatore o l'alimentazione dell'aria CO ₂ deve essere priva di umidità, acqua può interferire con il segnale letto dall'analizzatore
3. Collegare le camere per i tubi di ingresso che forniscono un flusso d'aria costante. Quindi collegare i tubi di scarico dalle camere alla macchina. Chiudere le provette e accendere il flusso d'aria.

Nota: applicare una piccola quantità di vaselina al termine dei coperchi di copertura in modo da chiudere facilmente e sono sigillati in modo sicuro. Questa tenuta è necessario raccogliere tutta l'anidride carbonica prodotta dai topi.

4. Procedure sperimentali

1. Iniziate pesando ogni mouse. Il peso corporeo è una misura della loro salute continua bene. Poi posto ogni topo nella camera appropriata. Naturalmente è importante avere l'aria che fluisce nelle camere in questo momento.
2. Per avviare la misurazione, lasciare che i topi per acclimatarsi alle camere prima di regolarezione dei livelli di aria.
3. Una volta che i topi apparire calmo, che può richiedere alcuni minuti, regolare la portata d'aria per ogni camera del mouse. Questo può essere diverso per ciascun topo. Tipicamente, il flusso di aria viene regolato all'inizio dell'esperimento per assicurarsi che esalato CO ₂ raggiunge livelli rilevabili con qualsiasi apparecchiatura viene utilizzata, e fare in modo che il livello rimane sufficientemente bassa per garantire fatturato sana aria. Usiamo iniziali livelli di CO ₂ tra 1.000 e 1.500 parti per milione.
4. Se ha difficoltà con la regolazione, verificare la presenza di perdite d'aria. Quindi ripetere il processo per ciascuna delle sezioni e guardare per un altro giro di misurazioni per vedere se le rettifiche apportate al flusso d'aria hanno corretto il livello di CO _2. È importante per ottenere una linea di base stabile lettura prima di alimentare i topi. Usiamo una macchina con una funzione di auto calibrazione. Se questo non è il caso di taratura deve essere controllata.
5. Quando questo avviene, somministrare il pasto uovoal primo mouse e registrare il tempo di ciascun topo riceve il cibo.
6. Corriamo il procedimento per 4 ore per ottenere i valori sufficienti per il montaggio del CO ¹³ ₂ curva di arricchimento per ogni mouse. Controllare i topi ogni 30-60 min per assicurarsi che i livelli di CO ₂ sono ancora sicuro per i topi.
7. Preparare nuove scatole contenenti cibo prima della fine della prova lo topi può iniziare a mangiare immediatamente dopo la prova è finita.

Representative Results

A dati rappresentativi indicati da tre topi diverse è mostrato in Figura 2. Il grafico nero rappresenta i punti dati di un mouse con svuotamento gastrico normale. Essa mostra la frazione di ¹³ C che viene recuperato in aria espirata espressa come percentuale della dose somministrata per ora espressa come funzione di tempo. La curva blu è da un topo con un accelerato svuotamento gastrico con un valore di mezzo T di 40 min e la curva rossa è da un mouse con svuotamento gastrico ritardato con un valore di mezzo T 168 min. Come stabilito in un precedente studio nel nostro laboratorio ^7, il normale svuotamento gastrico del primo tempo per un non-diabetico età NOD topo 9-15 settimane varia 62-131 min come rappresentati dal riquadro grigio. I punti di dati vengono poi montati da un non-lineare della curva di regressione con la seguente equazione ^8:

y = a ^{b e-ct}

Dove y è la percentuale del 1/2)

è calcolata da un procedimento di integrazione numerica utilizzando una funzione inversa gamma. Abbiamo ottenuto risultati di diverse migliaia di studi con una biologica intra-mouse variabilità di circa il 10%.

Figura 2. Dati rappresentativi di svuotamento gastrico di tre diversi tipi di mouse con normale (curva nera), ritardo (curva rossa) e accelerata (curva blu) lo svuotamento gastrico. Casella grigia evidenzia valori normali. L'equazione delle curve non lineari di regressione viene visualizzato nella casella.

Discussion

La tecnica qui descritta permette di ripetuti e non invasivo per la misurazione in vivo di svuotamento gastrico solido nei topi. Questo sistema ha il vantaggio che gli animali non sono trattenuti nella camera di misura, permettendo loro di muoversi e ruotare liberamente. Dal momento che questo è un ambiente familiare, i topi hanno ancora bisogno di essere addestrati e abituati alle camere di prova per prevenire gli effetti dello stress sullo svuotamento gastrico. In generale, si assume i dati svuotamento gastrico sono affidabili se la variabilità intra-topo tra prove consecutive svuotamento gastrico è inferiore al 10%.

La presente relazione è una descrizione più dettagliata dei nostri precedenti relazioni su misure di svuotamento gastrico nei topi ^8,11,12 e include ulteriori informazioni sulla risoluzione dei problemi problemi con il sistema. La modifica principale è l'uso dell'analizzatore LGR isotopico per misurare i livelli di gas. L'analizzatore abbiamo usato in questo studio misura ¹² CO 13 CO ₂ e H ₂ O concentrazioni di ogni secondo. Le valvole a controllo computerizzato nell'unità multiple-input automaticamente il flusso al rivelatore tra mouse camere ogni 25 sec. Quindi 12 topi possono essere analizzati simultaneamente con un intervallo di 5 min tra le letture. Va osservato che i dati possono essere ottenuti anche campionamento manuale dell'aria espirata e successiva analisi. Se il campionamento manualmente o con un altro dispositivo, verificare che le letture sono ottenuti a intervalli di circa 10 min. La sensibilità del nostro sistema e la frequenza di raccolta del campione significa che le curve di svuotamento gastrico sono più affidabili, più facile da montare e così abbiamo trovato che ottenere dati più riproducibili con questo metodo migliorato.

Le insidie ​​principali di questa tecnica si verificano quando i topi non riescono a mangiare il pasto entro il tempo assegnato, quando i topi perdono la loro assuefazione alla camera e quando problemi tecnici con il rilevamento system. La mancata per consumare il pasto e la perdita di abitudine sono di solito la conseguenza di non seguire la fase critica di avere un programma regolare per il test. Dopo 3 prove consecutive separati da 7 giorni o meno, i nostri topi si abituano alla prova e mangiare il pasto. Una volta abituati, dati affidabili si ottengono se i topi sono analizzate almeno una volta ogni 2 settimane per il resto dell'esperimento. Se per qualche motivo i topi non sono stati testati per 3 o più settimane, poi due sedute di allenamento in una settimana generalmente garantisce assuefazione. Se il personale che accudisce gli animali cambiano quindi la riqualificazione dei topi è consigliato ed è particolarmente importante per scoraggiare l'uso di saponi molto profumati e / o profumi dalle persone che gestiscono i topi. Difficoltà con il sistema di rilevamento sono spesso a causa dei bassi livelli di ¹³ CO ₂ generate da un piccolo animale come un topo. Il rivelatore deve essere calibrato e per alcuni rivelatori come i sistemi basati infrarossi, è molto important per ridurre il contenuto d'acqua del campione al minimo prima della misura.

Vi sono alcune limitazioni di questa tecnica a meno che il ricercatore intende studiare svuotamento gastrico più di una volta ogni 3 giorni nello stesso mouse. Non è consigliato a digiunare il mouse in modo spesso e quali restrizioni alimentari su base regolare può alterare la funzione gastrica. Modifiche alla tecnica può essere realizzato su misura liquido svuotamento gastrico e che è un utile potenziale del metodo.

Altri metodi per misurare lo svuotamento gastrico, compresi scintigrafia o misurando mantenuto contenuti dopo un tempo fisso hanno limitazioni significativamente più inclusi problemi con lo stress del processo o dovuti alla necessità di uccidere l'animale al termine di ciascuna prova. I fattori di stress sono sonda gastrica del pasto di prova o di ritenuta degli animali durante la misurazione. I vantaggi del test del respiro sono che il mouse è liberi di muoversi e non anestetizzatio sedato in qualsiasi modo.

In sintesi, il ¹³ C-ottanoico breath test acido permette lo studio della progressione della malattia con l'età e il trattamento e questi dati possono poi essere correlato con variazioni di altri parametri fisiologici e valutazione istologica nello stesso animale. Tra altre applicazioni, il test permette anche lo studio di come farmaci possono alterare direttamente svuotamento gastrico e indagare la risposta al trattamento in animali che sviluppano variazioni di svuotamento gastrico dovute a malattia o altri interventi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A source of constant air-supply, flow as well as composition	central air supply in the research facility
130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply	In-house built
Octanoic acid	Cambridge isotope laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
To prepare the egg meal: small beaker 50 ml plastic tube Bunsen burner egg spatula	Any supplier		Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal
Carbon dioxide isotope analyzer	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)