Summary
비 침습적으로 위 비우는의 결정 [
Abstract
쥐 위 비우는 연구는 가장 일반적으로 사용되는 기술은 동물과 식사 1,2의 사후 복구를 죽이는해야하기 때문에 같은 동물의 위 비우는 변경 사항을 따르도록 없다는 의해 제한되었습니다. 이 방법은 나이와 질병의 진행과 위 비우는의 변화를 결정하기 위해 길이 방향의 연구를 방지 할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 [13 C]-octanoic 인간 3 산 숨이 시험은 마우스 4-6와 쥐 7 사용하기 위해 수정 우리는 이미이 시험은 약물에 응답하고 동안 안정적이고 위 비우는 변화에 반응을 보여 주었다되었습니다 당뇨병 질환의 진행 8. 이 비디오 프리젠 테이션에서이 수정 테스트의 원칙과 실제 구현은 설명합니다. 이전 연구에서와 같이, NOD LtJ 마우스는 제 1 형 당뇨병 9 모델을 사용합니다. 이 마우스의 비율은 diabet의 합병증, gastroparesis의 증상을 개발에스 위 (10)의 기계적 방해하지 않고 지연 위의 비우는의 특징.
본 논문은 테스트 식사를 준비하고 4 시간 위 비우는 데이터와 어떻게 얻은 데이터를 분석하는 방법을 구하는 방법, 테스트를 위해 쥐를 훈련하는 방법을 보여줍니다. 본 연구에 사용 된 탄소 동위 원소 분석기는 동시에 12 쥐 최대의 공기 샘플의 자동 샘플링에 적합합니다. 이 기술은 당뇨병이나 다른 오랜 질병으로 생쥐의 큰 그룹의 위 비우는의 종 후속 수 있습니다.
Introduction
이 원고 쥐 위 비우는의 비 침습적 측정에 관련된 기술 및 방법론 고려 사항에 대해 설명합니다. 에 따라 프로토콜이 여기에 설명, 조사가 안정적으로 reproducibly 인한 질병의 발전에 비우는 위의 변화를 추적 할 수, 위 비우는의 약리 대리인의 영향을 연구하고 기본 질병 또는 결함 6,8의 치료 위 비우는의 반응을 따라 11,12. 이전 출판물에서 13 C의 응용 프로그램은 octanoic 산성 숨이 테스트는 사람과 동물 3,8에서 위 비우는을 측정하는 유용한 방법을 표시했습니다.이 보고서는 상세 설명 6-8으로 신뢰할 수있는 데이터를 얻을하는 데 필요한 절차 당뇨병 쥐 위 비우는의 길이 방향 연구에 필요한 개월. 이전에 다음 ID로 출판 방법에 비해이 프로토콜에 따라의 장점은 탐정이 데이터 obtaine을 보장 할 수 아르d는 신뢰할 수 있고 재현 할 수 있습니다. 또한, 수집 및 가스 샘플을 분석 자동화 된 시스템이 여기에 설명 된 연구에서 동시에 추적 할 수있는 동물의 수를 증가합니다. 전반적으로,이 문서의 목표는 테스트에 마우스 habituation와 그 얻은 결과에 변화를 줄일를 유지 주요 요인을 파악하는 것입니다.
위 비우는의 생체 측정의 경우, 마우스는 하루 아침에 금식하고 지속적인 공기 흐름을 투명 플라스틱 시험 챔버에 투입. 마우스가 튜브에 길들여지면, 기본은 2 수준 결정 13 CO를 exhaled과 공기가 적절히 조정. 다음, 우리는 13 C-라벨 octanoic 산을 섞어 계란 노른자로 구성된 테스트 식사를 관리 할 수 있습니다. 마우스가 금식과 훈련되기 때문에, 그들은 일반적으로 2 분 이내에 테스트 식사를 먹습니다. 관리 octanoic 산성은 위장에서 흡수되지 않습니다하지만 십이지장에 연결됩니다D는 주변 공기를 13 CO 2의 농축의 결과로, 출시와 exhaled되어 13 CO 2로 간에서 대사 질 것입니다. 공기 샘플은 결정 시간 간격으로 수집하고 탄소 동위 원소 분석기에 의해 분석됩니다. 이 모든 과정에서 속도 - 제한 단계는 위 비우는와 CO 2는 직접 레이블 식사 위 비우는과 일치하는 13 폐 배설입니다.
그림 1. 위 비우는 장치의 도식. 밤새 금식 한 후, 마우스는 그들이 자유롭게 이동하고 회전 할 수 있도록 투명한 방에 배치됩니다. 입구 관은 신선하고 지속적으로 공기 유입을 허용하고 콘센트는 13 C-에-12을 측정 할 수있는 동위 원소 분석기로 연결의 C 비율은 숨을 exhaled. 챔버는 [13 C]-octanoic 산을 포함하는 음식을 제공을위한 중앙 포트가 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 마우스의 교육 및 Habituation
- 이전 분석에, 테스트 조건으로들이다하기 위해 지속적인 공기 흐름과 2-4 시간의 테스트 챔버에있는 모든 쥐를 넣어. 이 현저하게 다른 지연 위 비우는의 비정상 탐지가 발생할 수 있습니다 스트레스 수준을 줄일 수 있습니다. 마우스에게 위 비우는 실험이 실행 된 경우와 같은 방법으로 취급합니다. octanoic 산을 추가하지 않고 계란 노른자를 (자세한 참조) 준비하고 각 마우스에 0.2 g을 먹이.
- 마우스가 충분히 (일반적으로 2 ~ 3 배) 훈련 때까지이 과정을 반복합니다. 환경 조건이 동일한 보관으로 마우스는 일반적으로 쉽게 오랫동안 길들여 수 있습니다.
참고 : 길들여 마우스를 신속하게 조용히 자신의 새로운 환경과 휴식에 정착하면서 비 길들여 마우스는 챔버로 전송 한 후 약 1 시간 주위를 이동하고 깨끗하게하고 자주 소변을 계속합니다.
아니테 : 실험이 진행되는 동안 : 같은 과도한 배뇨, 깨끗하게 함, 계란을 먹는에 대한 관심의 부족과 같은 habituation의 손실의 징후에 대한 모니터링 동물. 이 경우 사건은 다시 1-2 시간 전에 위 비우는 데이터를 얻어 내려면 빈 챔버에 habituating 생각합니다. 이 실험을하는 동안 일관성은 매우 중요합니다. 사물을 정확하게 같은 방법으로 이렇게하면 때마다 신뢰할 수 있고 재현 할 결과를 얻을 수있는 유일한 방법입니다. 이 자신의 새장 - 친구에서 마우스를 분리하지, 같은 시간에 매일 (예 : 인슐린)하지 않는 한 절대적으로 필요한, 쥐를 금식과 동시에 위 비우는 테스트를 시작하고, 쥐를 취급 동일한 방법으로 치료를 제공 포함되어 있습니다.
2. 테스트 식사를 포함 동위 원소의 작성
- 50 ML 팔콘 튜브에 계란 노른자의 5g을 무게로 시작합니다. 새로운 테스트 식사를 준비하기 위해 각 실험 일이 단계를 반복합니다.
- concentr과 octanoic 산의 10 μl를 추가합니다계란을 포함하는 50 ML 팔콘 튜브 2 μl / g의 ation와 매 튜브에 주걱 1 분 동안 힘차게 섞는다.
- 이 coagulates과 일관성 작은 공을하기에 적합한 때까지 계란 그런 다음 유리 비커로 옮겨와 분젠 버너를 통해 가열합니다. 이것은 일반적으로 약 30 초 정도 소요됩니다.
참고 : 계란 노른자의 공 마우스 당 0.2 g을 무게해야합니다. 이 모든 쥐의 누적 투여 량을 일정하게 유지하는 것이 중요합니다.
3. 실험 시작
- coprophagia을 방지하기 위해 금속 "그물 아래로"금식 랙에 (12 시간) 빠른 쥐가 하룻밤 위 비우는 위해 일단 훈련 준비. 사람들이 식수를 무료로 이용하실 수 있습니다 있는지 확인하십시오. 당뇨병 생쥐가 현재 실험에 사용되므로, 그들은 더 이상 16 시간에 금식하지 않아야합니다.
- 위 비우는 챔버를 설정하여 시작합니다. 공기 건조되었습니다 깨끗한 방 및 커버를 사용하십시오. 또한, 다른분석기 또는 CO 2 공기 공급에 챔버를 연결하는 튜브는 수분 무료로해야합니다, 물 분석기에서 읽을 신호를 방해 할 수
- 일정한 공기 흐름을 제공하는 입구 튜브에 챔버를 연결합니다. 그런 다음 컴퓨터에 챔버에서 배출 튜브를 연결합니다. 튜브를 닫고 공기 흐름을 설정합니다.
참고 : 쉽게 닫고 안전하게 밀봉되도록 커버 뚜껑의 끝 부분에 바셀린의 매우 작은 금액을 적용합니다. 이 시일은 마우스에 의해 발생하는 모든 이산화탄소를 수집 할 필요가 있습니다.
4. 실험 절차
- 각 마우스의 무게에 의해 시작합니다. 체중은 지속적인 건강을 측정하기위한 한 방법입니다. 그런 다음 적절한 챔버의 각 마우스를 놓습니다. 그것은 공기가이 시간에 방에 흐르는 것 물론 중요합니다.
- 측정을 시작하려면 쥐가 조정되기 전에 방으로 순응 할 수 있도록공기 수준을 들죠.
- 쥐가 침착 표시되면, 즉, 몇 분 정도 소요될 각 마우스 챔버의 공기 흐름 속도를 조정할 수 있습니다. 이 각각의 마우스에 대한 다를 수 있습니다. 일반적으로 공기 흐름이 CO 2가 사용되는 어떤 장비로 감지 수준에 도달 exhaled이 있는지 확인하고, 레벨이 건강한 공기 회전율을 보장 할 수있을만큼 낮은 유지 있는지 확인하기 위해 실험 시작시 조정됩니다. 우리는 백만 당 1,000 1,500 부품 사이에 최초의 CO 2 수준을 사용합니다.
- 조정에 문제가있는 경우, 공기 누출을 확인합니다. 그런 다음 챔버 각각의 과정을 반복하여 공기 흐름에 대한 변경 조정이 CO 2 수준을 수정 한 경우 표시 측정의 또 다른 라운드 감상하세요. 이 쥐를 먹이하기 전에 읽어 안정된 기준을 얻기 위해 중요합니다. 우리는 자체 보정 기능이있는 기계를 사용합니다. 이 아닌 경우 경우 보정이 선택해야합니다.
- 이것이 달성되면, 계란 식사를 관리첫 번째 마우스와 기록 시간에 각 마우스는 음식을받습니다.
- 우리는 각각의 마우스에 대한 13 CO 2 농축 곡선에 맞는 충분한 값을 얻기 위해 4 시간의 절차를 실행합니다. 마우스의 CO 2 수준 생쥐에 여전히 안전 있는지 확인하기 위해 최선을 30-60 분을 확인합니다.
- 쥐가 테스트가 끝난 후 즉시 식사를 시작 할 수 있도록 시험이 끝나기 전에 음식을 포함하는 새로운 상자를 준비합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
세 가지 마우스에서 설정 한 대표 데이터는 그림 2에 표시됩니다. 검은 색 그래프는 정상 위의 비우는와 마우스에서 데이터 포인트를 나타냅니다. 그것은 시간의 함수로 표현 시간당 관리 복용량의 백분율로 exhaled 공중에 복구 13 C의 비율을 보여줍니다. 파란색 곡선은 168 분의 T 반 값 지연 위의 비우는와 마우스부터 40 분 그리고 붉은 곡선의 T 반 값으로 비우는 가속화 위와 마우스에서입니다. 저희 연구실 7 비 당뇨병 NOD 마우스 시대의 일반적인 위 반 비우는 시간 이전 연구 년에 설립 된 회색 상자로 표시로 62에서 131 분으로 9-15주의 범위. 데이터 포인트는 다음 방정식 8 비선형 회귀 곡선으로되어 있습니다 :
B 전자 중부 표준시에서 Y =
y는의 비율은 어디
역 감마 함수를 사용하여 숫자 통합 절차에서 계산됩니다. 우리는 약 10 %의 생물 간 마우스 다양성과 천 몇 가지 연구의 결과를 얻을 수 있습니다.
그림 2. 위 비우는 세 가지 일반적인있는 마우스 (검은 색 곡선), 지연 (적색 곡선) 및 가속 (파란색 곡선)에서 대표 위 비우는 데이터입니다. 회색 상자가 정상적인 값을 보여줍니다. 비 선형 회귀 곡선의 방정식은 상자에 표시됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
설명 기술은 여기 쥐 고체 위의 비우는의 생체 측정의 반복과 비 침습적 할 수 있습니다. 이 시스템은 사람들이 자유롭게 이동하고 회전 할 수 있도록 동물이 측정 챔버에 묶여하지 않는 장점이 있습니다. 이 익숙하지 않은 환경 때문에, 마우스는 여전히 훈련 위 비우는에 스트레스의 영향을 방지하기 위해 테스트 챔버에게 길들여해야합니다. 일반적으로 연속 위 비우는 테스트 사이의 내부 마우스 다양성이 10 % 미만 경우 위 비우는 데이터는 신뢰할 수 가정합니다.
이 보고서는 마우스 8,11,12의 위 비우는 측정에 우리의 이전 보고서에 대한 자세한 설명이며, 시스템 문제 해결 문제에 대한 추가 정보가 포함되어 있습니다. 주요 수정은 가스 수준을 측정하기위한 LGR 동위 원소 분석기를 사용하는 것입니다. 우리가 본 연구에 사용 된 분석기는 12 CO를 측정
쥐가 쥐가 챔버에 자신의 habituation을 잃어과 기술 문제가 감지 SYS가 발생할 때, 할당 된 시간 내에 식사를하지 않는 경우이 기술에 대한 주요 함정이 발생할 수TEM. habituation의 식사와 손실을 먹을 수있는 실패는 일반적으로 테스트를 정기적 인 일정을 갖는의 중요한 단계를 따라하지의 결과입니다. 연속 3 테스트 7 일 이하로 구분 한 후, 우리의 마우스는 시험에 길들여과 식사를된다. 마우스는 실험의 나머지 부분에 대한 최소한 매 2 주에 한 번씩 검사를하는 경우 한 번에 길들여, 신뢰할 수있는 데이터를 얻을 수 있습니다. 어떤 이유로 마우스를 3 개 이상 주 동안 테스트하지 않은 경우 다음 주 내에있는 두 교육 세션은 일반적으로 habituation을 보장합니다. 동물을 취급 직원은 쥐의 재 훈련을 권장합니다 다음 변경되고,이 쥐를 취급하는 사람들에 의해 강력하게 향기로운 비누 및 / 또는 향수의 사용을 권장하기 위해 특히 중요합니다. 경우 감지 시스템 장애는 종종 마우스와 같은 작은 동물에 의해 생성 된 13 CO 2의 낮은 수준으로 인해 수 있습니다. 감지기는 조정 및 적외선 기반 시스템과 같은 일부 감지기에 대해 매우 노출이되어야합니다측정하기 전에 최소로 샘플의 물 함량을 줄일 ortant.
수사관이 동일한 마우스 삼일마다 한 번보다 더 자주 위 비우는 공부를하고자하지 않는 몇 가지 제한이 기술에 있습니다. 그것은 자주 빠르게 마우스에 통보되지 않고 정기적으로 이러한식이 제한은 위 기능을 변경할 수 있습니다. 기술에 대한 수정은 액체 위 비우는를 측정 할 수 만든 그 방법의 유용 가능성이 응용 프로그램입니다 할 수 있습니다.
고정 된 시간이 프로세스의 스트레스 문제 나 각 테스트의 끝에서 동물을 죽일 필요에 따라 포함 훨씬 더 많은 제한이 후 scintigraphy을 포함하거나 측정 위 비우는를 측정하기위한 다른 방법은 내용을 유지. 스트레스는 측정하는 동안 테스트 식사 또는 동물의 덮개의 gavage이 포함되어 있습니다. 숨이 테스트의 장점은 마우스가 자유롭게 이동하고 anesthetized되어 있지 아르또는 어떤 식 으로든 진정.
요약하면, 13 C-octanoic 산성 호흡 검사는 연령과 치료와 이러한 데이터와 질병 진행의 연구는 다음 같은 동물에서 다른 생리적 매개 변수의 변화와 조직 학적 평가와 상관 될 수 있습니다. 다른 응용 프로그램 중 테스트는 약물이 직접뿐만 아니라 질병 또는 기타 개입으로 인해 위 비우는의 변화를 개발 동물의 치료에 대한 반응을 조사 등의 위 비우는를 변경할 수있는 방법을 연구 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.
Acknowledgments
이 비디오 공개는 DK 68,055 프로그램 프로젝트 기금 '장용 시스템의 Pathobiology "에 대한 당뇨병과 소화기 및 신장 질환 국립 연구소 (NIDDK)에서 기금에 의해 가능하게되었다. 크리스토퍼 T. Creedon는 로체스터의 공립 학교 멘토링 프로그램에 의해 지원되었다.
우리는 기술 지원, 비서 지원 및 로스 Gatos 연구, Inc의 (마운틴 뷰, CA)에서 박사 더글라스 베어 미스 크리스티 Zodrow에 씨 게리 Stoltz 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A source of constant air-supply, flow as well as composition | central air supply in the research facility | ||
| 130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply |
In-house built | ||
| Octanoic acid | Cambridge isotope laboratories (Andover, MA) | CLM-293-1 | |
To prepare the egg meal:
|
Any supplier | Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal | |
| Carbon dioxide isotope analyzer | Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA) |
References
- Yeung, C. K., McCurrie, J. R. A simple method to investigate the inhibitory effects of drugs on gastric emptying in the mouse in vivo. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 45, 235-240 (2001).
- Osinski, M. A., Seifert, T. R., Cox, B. F., Gintant, G. A. An improved method of evaluation of drug-evoked changes in gastric emptying in mice. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 47, 115-120 (2002).
- Ghoos, Y. F., et al. Measurement of gastric emptying rate of solids by means of a carbon-labeled octanoic acid breath test. Gastroenterology. 104, 1640-1647 (1993).
- Symonds, E., Butler, R., Omari, T. Noninvasive breath tests can detect alterations in gastric emptying in the mouse. Eur. J. Clin. Invest. 32, 341-344 (2002).
- Symonds, E. L., Butler, R. N., Omari, T. I. Assessment of gastric emptying in the mouse using the [13C]-octanoic acid breath test. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 27, 671-675 (2000).
- Verhulst, P. J. Role of ghrelin in the relationship between hyperphagia and accelerated gastric emptying in diabetic mice. Gastroenterology. 135, 1267-1276 (2008).
- Schoonjans, R., et al. The 13C-octanoic acid breath test: validation of a new noninvasive method of measuring gastric emptying in rats. Neurogastroenterol. Motil. 14, 287-293 (2002).
- Choi, K. M., et al. Determination of gastric emptying in nonobese diabetic mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 1039-1045 (2007).
- Atkinson, M. A., Leiter, E. H. The NOD mouse model of type 1 diabetes: as good as it gets? Nat. Med. 5, 601-604 (1999).
- Camilleri, M.
- Choi, K. M., et al. Heme oxygenase-1 protects interstitial cells of Cajal from oxidative stress and reverses diabetic gastroparesis. Gastroenterology. 135, 2055-2064 (2008).
- Kashyap, P. C., et al. Carbon monoxide reverses diabetic gastroparesis in NOD mice. Am. J. Physiol. GI. G298, G1013-G1019 (2010).
![를 사용하여 비 비만 당뇨병 마우스의 위 비우는의 평가 [<sup> 13</sup> C]-octanoic 산성 호흡 시험](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/50301.jpg)
