Beoordeling van de maaglediging in niet-obese diabetische muizen met behulp van een [ Published: March 23, 2013 doi: 10.3791/50301

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Christopher T. Creedon¹, Pieter-Jan Verhulst¹, Kyoung M. Choi¹, Jessica E. Mason¹, David R. Linden¹, Joseph H. Szurszewski¹, Simon J. Gibbons¹, Gianrico Farrugia¹

¹Enteric Neuroscience Program, Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

Summary

Bepaling van maaglediging Niet-invasieve [

Abstract

Maaglediging studies in muizen zijn beperkt door het onvermogen om maaglediging veranderingen in hetzelfde dier te volgen aangezien de meest gebruikte technieken vereisen doden van de dieren en postmortem herstel van de maaltijd ^1,2. Deze aanpak voorkomt dat longitudinale studies om te bepalen veranderingen in de maaglediging met de leeftijd en de progressie van de ziekte. De meest gebruikte ^[13 C]-octaanzuur ademtest voor mens ³ is aangepast voor gebruik in muizen ratten ^4-6 en ⁷ en we eerder aangetoond dat deze test betrouwbaar en reageren op veranderingen in maaglediging in respons op geneesmiddelen en tijdens diabetes progressie ^8. In deze video presentatie van het beginsel en de praktische uitvoering van deze gewijzigde test wordt uitgelegd. Evenals in de vorige studie worden NOD LTJ muizen gebruikt, een model van type 1 diabetes ^9. Een deel van deze muizen ontwikkelen symptomen van gastroparese, een complicatie van diabetes gekenmerkt door vertraagde maaglediging zonder mechanische obstructie van de maag ^10.

Dit document laat zien hoe de muizen trainen voor het testen, hoe de test maaltijd te bereiden en het verkrijgen van 4 uur maaglediging data en hoe de verkregen gegevens te analyseren. De koolstofisotopen analyzer gebruikt in de onderhavige studie is geschikt voor de automatische monstername van de luchtmonsters tot wel 12 muizen op hetzelfde moment. Deze techniek maakt de longitudinale opvolging van maaglediging van grotere groepen van muizen met diabetes of andere langdurige ziekten.

Introduction

Deze publicatie beschrijft de technische en methodologische overwegingen betrokken zijn bij niet-invasieve meting van maaglediging bij muizen. Door het volgen van het protocol hier beschreven, onderzoekers kunnen betrouwbaar en reproduceerbaar veranderingen in de maaglediging als gevolg van de ontwikkeling van de ziekte te volgen, vooral de invloed van farmacologische middelen op de maaglediging en volg de respons van de maaglediging op de behandeling van een ziekte of gebreken ^{6,8, 11,12.} In eerdere publicaties de toepassing ^van 13C octaanzuur ademtesten bleek een nuttige manier meten maaglediging bij mensen en dieren ^3,8 zijn. Dit document beschrijft in detail de procedures die nodig zijn om betrouwbare gegevens te verkrijgen over de 6 tot 8 maanden nodig zijn voor een longitudinale studie van de maaglediging bij muizen met diabetes. De voordelen van deze volgende protocol vergeleken met eerder gepubliceerde methoden zijn dat de onderzoeker kan de data obtaine verzekerdd zal zijn betrouwbaar en reproduceerbaar. Bovendien het automatische systeem voor het verzamelen en analyseren van de gasmonsters hier beschreven verhoogt het aantal dieren dat tegelijk kan worden gevolgd in een studie. Over het geheel genomen het doel van deze paper is het identificeren van de belangrijkste factoren die gewenning van de muizen op de proef en dat de variabiliteit te verminderen in de verkregen resultaten te handhaven.

Voor de in vivo meting van maaglediging, worden muizen overnacht gevast en in de transparante plastic testkamers met constante luchtstroom. Na de muizen krijgen gewend aan de buizen, basislijn uitgeademde ¹³ CO _2-gehalte wordt bepaald en luchtstroom overeenkomstig aangepast. Vervolgens beheren wij een testmaaltijd bestaande uit eidooier gemengd met ¹³ C-gelabelde octaanzuur. Omdat de muizen gevast en getraind, zij over het algemeen eten de testmaaltijd binnen 2 minuten. De toegediende octaanzuur niet wordt geabsorbeerd in de maag, maar wordt opgenomen in het duodenum eend krijgt in de lever in ¹³ CO ₂ uitgezonden en uitgeademd, waardoor een verrijking van ¹³ CO ₂ in de omgevingslucht. Luchtmonsters worden verzameld op bepaalde tijdstippen en geanalyseerd door de koolstofisotoop analyzer. De snelheidsbepalende stap in dit proces is maaglediging en de pulmonale uitscheiding van ¹³ CO ₂ direct overeenkomt met maaglediging van het gelabelde maaltijd.

Figuur 1. Schema van maaglediging inrichting. Na een nacht vasten, worden muizen geplaatst in transparante kamers waardoor ze te bewegen en vrij kunnen draaien. Een inlaatbuis kan frisse lucht en constante stroom en een uitlaat leidt tot het isotoop analyzer het meten van de ^{13 C-to-12}C verhouding in de uitgeademde lucht. De kamer heeft ook een centrale poort voor de voedselproducten met ^{[13C]-octaanzuur.}

Protocol

1. Training en gewenning van de muizen

1. Vóór analyse zet alle muizen in de testkamers voor 2-4 uur met constant debiet om ze wennen aan de testomstandigheden. Dit vermindert aanzienlijk stress die anders zouden kunnen leiden dat afwijkende detectie van vertraagde maaglediging. Behandel de muizen op dezelfde wijze als de maaglediging experiment werd uitgevoerd. Bereid eidooier (zie verder) zonder toevoeging octaanzuur en voeden 0,2 g aan elke muis.
2. Herhaal dit proces totdat de muizen voldoende scholing (meestal 2-3 keer). De muizen doorgaans gemakkelijk gewend zolang de omgevingsomstandigheden zijn gelijk gehouden.

Opmerking: Niet-gewende muizen blijven bewegen voor ongeveer 1 uur na overschrijving naar de kamer, en en poepen urineren vaak, terwijl gewende muizen snel stil te vestigen in hun nieuwe omgeving en rust.

Geente: Tijdens het experiment: Monitor dieren op tekenen van verlies van gewenning, zoals teveel plassen, ontlasting, gebrek aan interesse in het eten van het ei. Als dit het geval heroverwegen habituating in een lege kamer 1-2 keer voordat deze maaglediging data. Consistentie is uiterst belangrijk terwijl het doen van dit experiment. Dingen doen op precies dezelfde manier elke keer is de enige manier om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te krijgen. Dit omvat waarbij behandeling (bijvoorbeeld insuline) elke dag op hetzelfde tijdstip, niet scheiden van de muizen uit de kooi mates niet absoluut noodzakelijk, de muizen vasten en starten van de maaglediging test tegelijkertijd recentelijk de muizen op dezelfde manier.

2. Voorbereiding van de isotoop die test-Meal

1. Begin met een gewicht van 5 g van eigeel in een 50 ml falcon buis. Herhaal deze stappen elke experimentele dag om een ​​frisse toets maaltijd te bereiden.
2. Voeg 10 ul van octaanzuur met een concentratie van 2 ul / g in de 50 ml falcon-buis met de eieren toe en meng grondig gedurende 1 min met een spatel in de falcon-buis.
3. Het ei wordt dan overgebracht naar een glazen beker en verhit met een bunsenbrander totdat het stolt en de samenhang is geschikt voor kleine ballen. Dit duurt gewoonlijk ongeveer 30 sec.

Opmerking: De ballen van eigeel moet 0,2 g af te wegen per muis. Dit is belangrijk om de cumulatieve dosis constant te houden in alle muizen.

3. Starten van het Experiment

1. Eenmaal getraind en klaar voor de maaglediging, snel de muizen 's nachts (12 uur) op een metalen "mesh-bottom" vasten rack te coprophagia te voorkomen. Zorg ervoor dat ze hebben gratis toegang tot drinkwater. Aangezien diabetische muizen gebruikt in het huidige experiment, moeten ze niet vasten langer dan 16 uur.
2. Begin met het opzetten van de maaglediging kamers. Gebruik schone kamers en covers die zijn lucht gedroogd. Ook eventuelebuizen verbinden de kamers naar de analyser of het CO ₂ luchttoevoer moet vochtvrij, water kan interfereren met het signaal door het meetsysteem
3. Sluit de kamers om de inlaatbuizen dat een constante lucht toe. Sluit vervolgens de uitlaatbuizen van de kamers aan de machine. Sluit de buizen en schakel de luchtstroom.

Opmerking: Breng een zeer kleine hoeveelheid Vaseline eind van het deksel deksels zodat ze gemakkelijk sluiten en veilig gesloten. Deze afdichting is noodzakelijk om alle kooldioxide door de muizen te verzamelen.

4. Experimentele Procedures

1. Begin door weging van elke muis. Lichaamsgewicht is een maat voor hun voortdurende goede gezondheid. Plaats dan elke muis in de juiste kamer. Het is uiteraard belangrijk om het hebben stroomt in de kamers op dit moment.
2. Om de meting te starten, zodat de muizen naar de kamers laten wennen voordat passenING de lucht niveaus.
3. Zodra de muizen lijken kalme, kan dat een paar minuten duren, past u het luchtdebiet voor elke muis kamer. Dit kan voor elke muis. Typisch wordt de luchtstroom ingesteld op het begin van het experiment te waarborgen dat uitgeademde CO ₂ bereikt vlak vast welke apparatuur wordt gebruikt, en ervoor te zorgen dat het niveau blijft laag genoeg gezonde lucht omzet te waarborgen. We maken gebruik van de eerste CO _2-uitstoot tussen de 1.000 en 1.500 delen per miljoen.
4. Als problemen met aanpassingen, controleer op luchtlekkage. Dan herhaal het proces voor elk van de kamers en kijken voor een nieuwe ronde van de metingen om te zien of aanpassingen van de luchtstroom gecorrigeerd het CO _2-niveau. Het is belangrijk om een ​​vlakke basislijn lezen voordat de muizen te voeren. We maken gebruik van een machine met een zelf kalibratie. Indien dit niet het geval kalibratie te controleren.
5. Wanneer dit is bereikt, het beheer van de ei maaltijdnaar de eerste muis en neem de tijd elke muis krijgt het voedsel.
6. We lopen de procedure voor het 4 uur om voldoende waarden te verkrijgen voor de montage van de ¹³ CO ₂ verrijking curve voor elke muis. Controleer op de muizen elke 30-60 min om ervoor te zorgen dat de CO _2-niveaus nog steeds veilig zijn voor de muizen.
7. Bereid nieuwe dozen met levensmiddelen vóór het einde van de test dat de muizen kan gaan eten direct na de test is.

Representative Results

Een representatieve gegevensreeks uit drie verschillende muizen wordt weergegeven in figuur 2. De zwarte grafiek geeft de datapunten van een muis met normale maaglediging. Het toont de fractie van ¹³ C die wordt teruggewonnen in de uitgeademde lucht, uitgedrukt als een percentage van de toegediende dosis per uur uitgedrukt als een functie van tijd. De blauwe curve is van een muis met een versnelde maaglediging met een T half waarde van 40 min en de rode curve is van een muis met een vertraagde maaglediging met een T half waarde van 168 min. Zoals vastgesteld bij een eerder onderzoek in ons laboratorium ^7, de normale maag half ledigingstijd voor een niet-diabetische NOD muis leeftijd 9-15 weken varieert 62 tot 131 min zoals weergegeven door het venster. De gegevenspunten zijn gemonteerd door een niet-lineaire regressie kromme met de volgende vergelijking ^8:

y = op ^{b e-ct}

Waarbij y het percentage 1/2)

wordt berekend uit een numerieke integratie procedure met een inverse gammafunctie. Wij hebben resultaten van enkele duizenden studies met biologische intra-muis variabiliteit van ongeveer 10%.

Figuur 2. Vertegenwoordiger maaglediging data uit drie verschillende muizen met normale (zwarte curve), vertraagde (rode curve) en versnelde (blauwe curve) maaglediging. De grijze vak belicht normale waarden. De vergelijking van de niet-lineaire regressie curven wordt in het vak.

Discussion

De beschreven techniek maakt hierin voor herhaalde of niet-invasieve in vivo meting van vaste maaglediging in muizen. Dit systeem heeft het voordeel dat de dieren niet beperkt in de meetkamer, zodat ze bewegen en vrij kunnen draaien. Aangezien dit een onbekende omgeving, de muizen moeten nog worden opgeleid en gewend aan het testen kamers om de effecten van stress te voorkomen op de maaglediging. In het algemeen we aannemen dat de maaglediging data betrouwbaar is als de intra-muis variabiliteit tussen opeenvolgende maaglediging test minder dan 10%.

Dit rapport is een meer gedetailleerde beschrijving van onze eerdere verslagen over maaglediging metingen bij muizen ^8,11,12 en bevat aanvullende informatie over het oplossen van problemen problemen met het systeem. De belangrijkste wijziging is het gebruik van de LGR isotoop analyser voor het meten van gassen. De analyser we in de huidige studie meet ¹² CO 13 _CO2 en _H2O concentraties per seconde. De computer gestuurde kleppen in de multiple-input apparaat automatisch stroom naar de detector tussen muis kamers elke 25 sec. Dus 12 muizen kunnen worden geanalyseerd met een 5 min interval tussen metingen. Er moet worden opgemerkt dat de gegevens ook worden verkregen door handmatige bemonstering van de uitgeademde lucht en daaropvolgende analyse. Bij de handmatige bemonstering of met een ander apparaat, zorg er dan metingen worden verkregen bij ongeveer 10 minuten intervallen. De gevoeligheid van het systeem en de frequentie van de bemonstering betekent dat de maaglediging curves betrouwbaarder, gemakkelijker te plaatsen en dus we hebben gevonden dat we meer reproduceerbare gegevens met deze verbeterde methode te krijgen.

De belangrijkste valkuilen om deze techniek zich voordoen wanneer de muizen niet aan de maaltijd te eten binnen de gestelde termijn, wanneer de muizen verliezen hun gewenning aan de kamer en bij technische problemen met de detectie systeem. Als de maaltijd en het verlies van gewenning te eten zijn meestal een gevolg van het niet volgen van de kritische stap van het hebben van een regelmatig schema voor het testen. Na 3 opeenvolgende tests gescheiden door 7 dagen of minder, raken onze muizen gewend aan de test en eet de maaltijd. Eenmaal gewend zijn betrouwbare data verkregen indien de muizen minstens eenmaal elke 2 weken voor de rest van het experiment. Als om wat voor reden dan ook de muizen zijn niet getest voor 3 of meer weken dan twee trainingen binnen een week zal meestal zorgen voor gewenning. Als het personeel dat met de dieren veranderen en dan bij-en nascholing van de muizen wordt geadviseerd en is het vooral belangrijk te ontmoedigen gebruik van sterk geparfumeerde zeep en / of parfums door de mensen het hanteren van de muizen. Problemen met het detectiesysteem vaak vanwege de lage ¹³ CO ₂ die door een klein dier zoals een muis. De detector moet worden geijkt en voor sommige detectoren zoals infrarood systemen, is het zeer important om het watergehalte van het monster tot een minimum voorafgaande aan de metingen.

Er zijn weinig beperkingen aan deze techniek, tenzij de onderzoeker wenst te maaglediging studeren vaker dan een keer om de 3 dagen in dezelfde muis. Het is niet aangeraden om snel de muis zo vaak en zo calorische restrictie op een regelmatige basis kan maag-functie wijzigen. Wijzigingen van de techniek kan worden gemaakt voor vloeibare maaglediging te meten en die een nuttige mogelijke toepassing van de werkwijze.

Andere methoden voor het meten van maaglediging, inclusief scintigrafie of meten behouden inhoud na een bepaalde tijd aanzienlijk beperkingen waaronder problemen met de stress van het proces of door de noodzaak om het dier te doden aan het einde van elke test. Stressoren omvatten maagsonde van de testmaaltijd of beperking van het dier tijdens de meting. De voordelen van de ademtest zijn dat de muis vrij kan bewegen en niet verdoofdof gesedeerd in any way.

In samenvatting, de ¹³ C-octaanzuur ademtest laat toe om de progressie van de ziekte leeftijd en behandeling en deze gegevens kunnen vervolgens worden gecorreleerd met veranderingen in andere fysiologische parameters en histologische evaluatie in hetzelfde dier. Onder andere toepassingen, de test maakt ook van hoe geneesmiddelen rechtstreeks veranderen maaglediging en onderzoekt de respons op de behandeling in dieren die veranderingen in maaglediging door ziekte of andere interventies.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A source of constant air-supply, flow as well as composition	central air supply in the research facility
130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply	In-house built
Octanoic acid	Cambridge isotope laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
To prepare the egg meal: small beaker 50 ml plastic tube Bunsen burner egg spatula	Any supplier		Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal
Carbon dioxide isotope analyzer	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)