Summary
Determinación del vaciamiento gástrico con un no-invasivo [
Abstract
Estudios de vaciamiento gástrico en ratones han sido limitada por la incapacidad de seguir cambios de vaciado gástrico en el mismo animal ya que las técnicas más comúnmente usadas requieren la matanza de los animales y de recuperación post mortem del 1,2 comida. Este método evita que los estudios longitudinales para determinar los cambios en el vaciado gástrico con la edad y la progresión de la enfermedad. El uso común [13 C]-octanoico prueba de aliento ácido 3 para los seres humanos ha sido modificado para su uso en ratones y ratas 4-6 y 7 que anteriormente mostró que esta prueba es fiable y sensible a los cambios en el vaciado gástrico en respuesta a los fármacos y durante progresión de la enfermedad diabética 8. En este vídeo de presentación del principio y la aplicación práctica de esta prueba modificada se explica. Al igual que en el anterior estudio, los ratones NOD LTJ se utilizan, un modelo de diabetes tipo 1 9. Una parte de estos ratones desarrollan los síntomas de la gastroparesia, una complicación de la diabetes caracterizado por un vaciado gástrico retardado sin obstrucción mecánica del estómago 10.
En este trabajo se muestra cómo entrenar a los ratones para probar, cómo preparar la comida de prueba y obtener 4 hr gástricas datos vaciado y cómo analizar los datos obtenidos. El analizador de isótopo de carbono usado en el presente estudio es adecuado para el muestreo automático de las muestras de aire de hasta 12 ratones al mismo tiempo. Esta técnica permite el seguimiento longitudinal de vaciamiento gástrico de los grupos más grandes de ratones con diabetes u otras enfermedades de larga duración.
Introduction
Este manuscrito describe los aspectos técnicos y metodológicos relacionados con la medición no invasiva del vaciamiento gástrico en ratones. Siguiendo el protocolo descrito aquí, los investigadores pueden fiable y reproducible seguir los cambios en el vaciado gástrico debido al desarrollo de la enfermedad, estudiar el impacto de los agentes farmacológicos en el vaciado gástrico y seguir la respuesta de vaciamiento gástrico para el tratamiento de las enfermedades subyacentes o defectos 6,8, 11,12. En las publicaciones anteriores, la aplicación de pruebas de aliento 13 C ácido octanoico ha demostrado ser una forma útil de medir el vaciado gástrico en humanos y animales 3,8. Este trabajo describe en detalle, los procedimientos necesarios para obtener datos fiables sobre la 8 6 a meses necesarios para un estudio longitudinal de vaciamiento gástrico en ratones con diabetes. Las ventajas de seguir este protocolo, en comparación con los métodos publicados anteriormente son que el investigador puede estar seguro de la obtaine datosd será fiable y reproducible. Además, el sistema automatizado de recogida y análisis de las muestras de gas se describe aquí aumenta el número de animales que puede ser seguido de forma simultánea en un estudio. En general, el objetivo de este trabajo es identificar los factores clave que mantienen la habituación de los ratones a la prueba y que reducir la variabilidad en los resultados obtenidos.
Para la medición in vivo de vaciado gástrico, los ratones se mantienen en ayunas durante la noche y puesto en las cámaras de ensayo de plástico transparente con flujo de aire constante. Después de que los ratones se habituaron a los tubos, de referencia exhalado 13 niveles de CO 2 se determinan y se ajusta en consecuencia el flujo de aire. A continuación, se administrará una comida de prueba que consiste en la yema de huevo mezclada con 13 C-etiquetados octanoico. Debido a que los ratones se mantienen en ayunas y entrenados, por lo general, comer la comida de prueba dentro de 2 min. El administrarse ácido octanoico no se absorbe en el estómago pero se recogió en el duodeno und conseguirá metaboliza en el hígado en 13 CO 2, que se libera y exhalado, lo que resulta en un enriquecimiento de 13 CO 2 en el aire circundante. Las muestras de aire se recogen a intervalos de tiempo determinados y son analizados por el analizador de isótopo de carbono. La tasa de limitación de paso en este proceso es el vaciado gástrico y la excreción pulmonar de 13 CO 2 se corresponde directamente con el vaciado gástrico de la comida etiquetada.
Figura 1. Esquema de aparato de vaciado gástrico. Después de una noche de ayuno, los ratones se colocaron en cámaras transparentes que les permitan moverse y girar libremente. Un tubo de entrada permite afluencia de aire fresco y una salida constante y conduce al analizador de isótopos para medir el C-13 a-12Relación C en el aire exhalado. La cámara también tiene un orificio central para el suministro de alimentos que contienen [13 C]-ácido octanoico.
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Protocol
1. La formación y habituación de los Ratones
- Antes del análisis, poner todos los ratones en las cámaras de ensayo para 2-4 horas con flujo de aire constante a fin de habituar a las condiciones de prueba. Esto reduce considerablemente los niveles de estrés que podrían causar detección aberrante del vaciamiento gástrico retardado. Tratar los ratones de la misma manera como si el experimento vaciado gástrico se ejecuta. Preparar yema de huevo (véase más adelante) sin añadir el ácido octanoico y alimentar a 0,2 g para cada ratón.
- Repita este proceso hasta que los ratones están suficientemente formados (típicamente de 2-3 veces). Los ratones normalmente se habitúan fácilmente siempre que las condiciones ambientales se mantienen iguales.
Nota: no habituados ratones continúan moviéndose alrededor por alrededor de 1 hora después de la transferencia a la cámara, y defecar y orinar con frecuencia, mientras que los ratones habituados rápidamente establecerse en su nuevo entorno y descanse relajado.
Note: Durante el experimento: los animales vigilar los signos de pérdida de la habituación como exceso de orina, la defecación, la falta de interés en comer el huevo. Si este es el caso de la posibilidad de volver habituar en una cámara vacía 1-2 veces antes de obtener los datos de vaciado gástrico. La consistencia es muy importante al hacer este experimento. Hacer las cosas exactamente de la misma manera cada vez que es la única manera de obtener resultados confiables y reproducibles. Esto incluye dar tratamiento (por ejemplo, insulina) cada día, al mismo tiempo, no separación de los ratones de su jaula compañeros de menos que sea absolutamente necesario, en ayunas a los ratones y de iniciar la prueba de vaciado gástrico al mismo tiempo, y el manejo de los ratones de la misma manera.
2. Preparación de la prueba de isótopos que contienen harina de
- Comenzar con el pesado de 5 g de yema de huevo en un tubo Falcon de 50 ml. Repita estos pasos cada día experimental para preparar una comida de prueba nueva.
- Añadir 10 l de ácido octanoico con un concentración de 2 l / g al tubo Falcon de 50 ml que contiene el huevo y mezclar vigorosamente durante 1 min con una espátula en el tubo Falcon.
- El huevo se transfiere entonces a un vaso de precipitados de vidrio y se calentó con un mechero Bunsen hasta que se coagula y su consistencia es adecuado para hacer bolas pequeñas. Esto tarda típicamente entre aproximadamente 30 sec.
Nota: Las bolas de la yema de huevo debe pesar 0,2 g por ratón. Esto es importante para mantener la dosis acumulativa constante en todos los ratones.
3. A partir del experimento
- Una vez capacitados y listos para el vaciado gástrico, rápido a los ratones durante la noche (12 horas) en un metal "malla de fondo" rack ayuno para evitar la coprofagia. Asegúrese de que tengan libre acceso al agua potable. Dado que los ratones diabéticos se utilizan en el experimento actual, que no deben estar en ayunas durante más de 16 h.
- Comience por la creación de las cámaras de vaciado gástrico. Utilizar cámaras limpias y las cubiertas que han sido secados al aire. También, cualquiertubos de conexión de las cámaras para el analizador o el CO 2 de suministro de aire debe ser libre de humedad, el agua puede interferir con la señal leída por el analizador
- Conectar las cámaras a los tubos de entrada que proporcionan un flujo de aire constante. A continuación, conecte los tubos de salida de las cámaras a la máquina. Cerrar los tubos y conecte la corriente de aire.
Nota: Aplicar una cantidad muy pequeña de vaselina en el extremo de las tapas de cubierta para que cerrar fácilmente y se sellan con seguridad. Este sello hermético es necesario recoger todo el dióxido de carbono producido por los ratones.
4. Procedimientos Experimentales
- Comience pesando cada ratón. El peso corporal es una medida de su buena salud continua. Luego coloca cada ratón en la cámara apropiada. Por supuesto, es importante contar con el aire que fluye a las cámaras en este momento.
- Para iniciar la medición, permite a los ratones para aclimatarse a las cámaras antes de ajustarING los niveles de aire.
- Una vez que los ratones parecer tranquilo, que puede tardar unos minutos, ajustar el caudal de aire en cada cámara del ratón. Esto puede ser diferente para cada ratón. Típicamente, el flujo de aire se ajusta al comienzo del experimento para asegurarse de que el CO exhalado 2 alcanza niveles detectables por cualquier equipo que se está utilizando, y para asegurarse de que el nivel se mantiene lo suficientemente bajo como para asegurar rotación aire saludable. Utilizamos iniciales niveles de CO 2 entre 1.000 y 1.500 partes por millón.
- Si tiene problemas con los ajustes, compruebe si hay fugas de aire. A continuación, repita el proceso para cada una de las cámaras y ver para otra ronda de mediciones para ver si los ajustes realizados para el flujo de aire se ha corregido el nivel de CO 2. Es importante para obtener una línea base estable de lectura antes de alimentar a los ratones. Nosotros usamos una máquina con una función de calibración automática. Si este no es el caso de calibración debe ser comprobado.
- Cuando esto se logra, administrar la comida huevoal primer ratón y el registro del tiempo que cada ratón recibe el alimento.
- Llevamos a cabo el procedimiento durante 4 horas para obtener los valores suficientes para ajustar la curva de 13 CO 2 enriquecimiento para cada ratón. Compruebe en los ratones cada 30-60 minutos para asegurarse de que los niveles de CO 2 siguen siendo seguros para los ratones.
- Preparar nuevas cajas que contienen los alimentos antes del final de la prueba de modo que los ratones pueden comenzar a comer inmediatamente después de la prueba ha terminado.
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Representative Results
A los datos representativos, creados a partir de tres diferentes ratones se muestra en la Figura 2. El gráfico negro representa los puntos de datos de un ratón con el vaciamiento gástrico normal. Se muestra la fracción de C 13 que se recupera en el aire exhalado expresada como un porcentaje de la dosis administrada por hora expresada como una función del tiempo. La curva azul es de un ratón con un vaciado gástrico acelerado con un valor medio T de 40 min y la curva roja es de un ratón con un retraso del vaciado gástrico con un valor medio de T 168 min. Según se establece en un estudio previo en nuestro laboratorio 7, el tiempo de vaciado gástrico mitad de lo normal para una edad NOD no diabética ratón 9-15 semanas oscila desde 62 hasta 131 min representados por el cuadro gris. Los puntos de datos se ajusta entonces por una curva de regresión no lineal con la siguiente ecuación 8:
y = b a e-ct
Donde y es el porcentaje de la
se calcula a partir de un procedimiento de integración numérica utilizando una función de gamma inversa. Se han obtenido resultados de varios miles de estudios con un biológica intra-ratón variabilidad de aproximadamente 10%.
Figura 2. Los datos representativos de vaciado gástrico de tres ratones diferentes con curva normal (negro), tardías (curva roja) y (curva azul) se aceleró el vaciamiento gástrico. El cuadro gris resalta los valores normales. La ecuación de las curvas de regresión no lineal se muestra en el cuadro.
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Discussion
La técnica descrita en este documento permite repetida y no invasiva de medición in vivo de vaciado gástrico sólido en ratones. Este sistema tiene la ventaja de que los animales no se restringen en la cámara de medición, lo que les permite moverse y girar libremente. Como se trata de un entorno desconocido, los ratones todavía necesitan ser entrenados y acostumbrados a las cámaras de prueba para prevenir los efectos del estrés sobre el vaciado gástrico. En general, se supone que los datos de vaciado gástrico son confiables si la variabilidad intra-ratón entre pruebas consecutivas del vaciado gástrico es menor que 10%.
Este informe es una descripción más detallada de nuestros informes anteriores sobre el vaciado gástrico mediciones en ratones 8,11,12 e incluye información adicional sobre problemas de solución de problemas con el sistema. La principal modificación es el uso del analizador de LGR isótopos para medir los niveles de gas. El analizador se utilizó en el presente estudio mide 12 CO
Los principales escollos a esta técnica se producen cuando los ratones no comen la comida dentro del tiempo asignado, cuando los ratones pierden su habituación a la cámara y cuando surgen problemas técnicos con la detección sysTEM. Si no comen la comida y la pérdida de habituación son generalmente una consecuencia de no seguir el paso crítico de tener un horario regular para las pruebas. Después de 3 pruebas consecutivas separadas por 7 días o menos, nuestros ratones se acostumbran a la prueba y comer la comida. Una vez habituado, datos fiables se obtienen si los ratones se prueba al menos una vez cada 2 semanas durante el resto del experimento. Si por alguna razón, los ratones no se han probado durante 3 semanas o más luego dos sesiones de entrenamiento dentro de una semana por lo general se asegurará de habituación. Si el personal que manipula los animales cambian luego re-entrenamiento de los ratones se recomienda y es particularmente importante para desalentar el uso de jabones perfumados fuerte y / o aromas por la gente que maneja los ratones. Las dificultades con el sistema de detección son a menudo debido a los bajos niveles de 13 CO 2 generado por un animal pequeño como un ratón. El detector debe ser calibrado y para algunos detectores tales como infrarrojos sistemas basados, es muy importante para reducir el contenido de agua de la muestra a un mínimo antes de las mediciones.
Hay pocas limitaciones a esta técnica a menos que el investigador desea estudiar el vaciado gástrico con más frecuencia que una vez cada 3 días en el mismo ratón. No se aconseja el ratón rápido y tan a menudo como restricción de dieta en una base regular puede alterar la función gástrica. Las modificaciones de la técnica se pueden hacer para medir el vaciado gástrico líquido y que es una aplicación útil potencial del método.
Otros métodos para medir el vaciado gástrico, incluyendo escintigrafía o medir el contenido retenido después de un tiempo fijo tienen limitaciones significativamente más incluyendo problemas con el estrés del proceso o debido a la necesidad de matar el animal al final de cada prueba. Los factores estresantes incluyen sonda de la comida de prueba o restricción del animal durante la medición. Las ventajas de la prueba de aliento son que el ratón se mueve libremente y no anestesiadoso sedado en modo alguno.
En resumen, la 13 C-octanoico prueba de aliento ácido permite el estudio de progresión de la enfermedad con la edad y el tratamiento y estos datos pueden entonces ser correlacionados con cambios en otros parámetros fisiológicos y evaluación histológica en el mismo animal. Entre otras aplicaciones, la prueba también permite el estudio de cómo las drogas pueden alterar directamente el vaciado gástrico, así como la investigación de la respuesta al tratamiento en animales que desarrollan cambios en el vaciado gástrico debido a enfermedad u otras intervenciones.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.
Acknowledgments
Esta publicación vídeo fue posible gracias al financiamiento del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK) para el Proyecto de Programa de Subsidios "Biopatología del sistema entérico" DK 68055. Christopher T. Creedon fue apoyada por el Programa de Mentores de Rochester Public Schools.
Agradecemos al Sr. Gary Stoltz para la asistencia técnica, la Sra. Kristy Zodrow para asistencia secretarial y el Dr. Douglas Baer de Los Gatos Research, Inc (Mountain View, CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A source of constant air-supply, flow as well as composition | central air supply in the research facility | ||
| 130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply |
In-house built | ||
| Octanoic acid | Cambridge isotope laboratories (Andover, MA) | CLM-293-1 | |
To prepare the egg meal:
|
Any supplier | Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal | |
| Carbon dioxide isotope analyzer | Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA) |
References
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