Summary
Infrarød nerve stimulation er blevet foreslået som et alternativ til elektrisk stimulering i en række nerve typer, herunder dem der er forbundet med det auditive system. Denne protokol beskriver en patch-clamp-metode til at studere den mekanisme af infrarøde nervestimulation i en kultur af primære auditive neuroner.
Abstract
Det er blevet påvist i de senere år, at pulserende, infrarødt laserlys kan anvendes til at fremkalde elektriske reaktioner i nervevæv, uafhængigt af enhver yderligere ændring af målvævet. Infrarød neural stimulation er blevet rapporteret i en række af perifert og sensorisk neurale væv in vivo, med særlig interesse for stimulering af neuroner i hørenerven. Men mens INS har vist sig at fungere i disse indstillinger, er mekanismen (eller mekanismer), hvorved infrarødt lys forårsager neurale excitation øjeblikket ikke godt forstået. Protokollen præsenteres her beskriver en hel celle patch clamp metode designet til at lette efterforskningen af infrarød neural stimulation i dyrkede primære auditive neuroner. Ved grundigt kendetegnende respons af disse celler til infrarød laserbelysning in vitro under kontrollerede betingelser, kan det være muligt at opnå en bedre forståelse af den grundlæggende physical og biokemiske processer bag infrarød neural stimulation.
Introduction
Felterne i neurofysiologi og medicinske bionik stærkt afhængige teknikker, der tillader kontrollerbar stimulation af elektriske reaktioner i nervevæv. Mens elektrisk stimulation fortsat guldstandarden i neural excitation, det lider af en række ulemper som f.eks tilstedeværelsen af stimulation artefakter, når du optager neurale reaktioner, og mangel på stimulation specificitet på grund af spredningen af strøm i det omgivende væv 1..
De sidste to årtier har set udviklingen af optisk medierede stimulering teknikker 2. Adskillige af disse teknikker kræver ændring af målvævet, enten via tilsætning af et bestemt molekyle (f.eks bur molekyler) 3 eller anden form for genetisk manipulation (f.eks optogenetics) 4, hverken som er lette at anvende uden for et forskningsmiljø. Af særlig interesse er derfor infrarød neural stimulation (INS), whereby nervevæv er begejstret ved pulserende infrarødt laserlys. INS har potentiale til at overvinde mange af manglerne ved elektrisk stimulation ved at give meget specifikke, ikke-kontakt stimulering af nervevæv 2. Men mens INS er blevet påvist i en række indstillinger i vivo, den præcise mekanisme for excitation fortsat usikker.
Nogle af de seneste udgivelser har vist fremskridt i retning af at afdække mekanismen bag INS 5-7. Hurtig opvarmning skyldes absorption af laserlyset af vand synes at spille en central rolle. Men ud over dette er en konsensus er endnu ikke nået. Shapiro et al. 7. foreslå en meget generel mekanisme, hvorved hurtig opvarmning forårsager en forstyrrelse i fordelingen af ladede partikler støder op til cellemembranen, hvilket fører til en ændring i kapacitansen af cellemembranen og efterfølgende depolarisering. Hertil kommer,. Albert et al 5. hævder, at laser induceret opvarmning aktiverer en specifik klasse af temperaturfølsomme ionkanaler (forbigående receptor potentielle vanilloid kanaler), tillader ioner at passere gennem cellemembranen. På dette stadium er det uklart, hvordan disse mekanismer kombinere eller endog hvorvidt der er yderligere faktorer, der endnu ikke er identificeret.
Selv et lille antal publikationer (referencer 5,7-9) har undersøgt INS in vitro, har det store flertal af arbejde offentliggjort i dette område er blevet udført in vivo (f.eks referencer 1,6,10-18). Infrarød stimulering af auditive neuroner har været et område af særlig interesse på grund af de potentielle anvendelser i cochlear implantater 10,14-18. Mens in vivo forsøg er vigtige for at kontrollere effektiviteten af teknikken i forskellige indstillinger, den øgede grad af kontrol ydes af in vitro-undersøgelser forventes at føre til en mere detaljeret forståelse af mechnisme ansvarlig for INS. Denne rapport beskriver fremstillingen af dyrkede spiral ganglion neuroner patch clamp undersøgelser, da disse kan bruges til at undersøge grundlæggende mekanismer samtidig linker til den omfattende samling af eksisterende data fra det auditive system.
Plasteret clamp teknik er et fremragende værktøj til undersøgelser af elektrofysiologiske fænomener, hvilket giver en anordning til registrering af elektrisk aktivitet i enkelte celler og studere bidrag i de enkelte underliggende strømninger 19. Når denne teknik anvendes til en stabil in vitro forberedelse af primære neuroner, såsom dyrkede spiral ganglion neuroner, det giver mulighed for at studere i dybden de mekanismer, som neurale aktivitet styres og manipuleres.
Protokoller, i dette arbejde skitsere metoder til at undersøge effekten af laser stimulation på de elektriske egenskaber af spiral ganglion neuroner via patch clampoptagelser. Den fremgangsmåde er baseret på et fiber-koblet laser snarere end en fri-rum laser, der giver sikrere drift samt lettere og mere gentagelig tilpasning uden behov for at ændre standard mikroskop konfiguration. På grundlag af disse protokoller, bør det være muligt at foretage en lang række eksperimenter med henblik på mere klart at bestemme mekanismen eller mekanismerne bag INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kultur Spiral Ganglion neuroner
- Sterilisere små runde (fx 10 mm diameter) dækglas og buede pincet i en autoklave. Overføre de steriliserede dækglassene i individuelle brønde i en steril 4-ring 35 mm petriskål eller 4-brønds plade under anvendelse af de steriliserede pincet. Påfør 150 ul af poly-L-ornithin (500 ug / ml) og muselaminin (0,01 mg / ml) til den øverste overflade af dækglasset og placer i en inkubator (37 ° C) i op til 48 timer. Sørg for, at dækglas ikke svæver væk fra bunden af brønden.
- Forbered 50 ml sterile Neurobasal medier (NBM) for hver neurale kultur: 47,5 ml Neurobasal A, 0,5 ml N2 supplement, 1 ml B27 supplement, 0,5 ml L-glutamin, og 0,5 ml penicillin-streptomycin. Bemærk: Kosttilskud kan nedfryses, opbevares ved -20 ° C og tilsat til medierne om nødvendigt dag.
- Dissociér spiral ganglion neuroner fra post-natal dag 4-7 rotteunger som tidligere beskrevet 20,21, osING både enzymatisk (0,025% trypsin og 0,001% DNase I) og mekaniske teknikker. Der henvises til Whitlon et al. 22 og Vieira et al. 23. for detaljerede procedurer spiral ganglion neuron kultur eller Parker et al. 24 for en demonstration af modiolus isolation.
- Aspirere eventuelt resterende poly-L-ornithine/laminin løsning fra dækglas og vaskes hurtigt med NBM.
- Tilføj 150-200 ul af dissocierede spiral ganglion neuron suspension dækglassene og anbringes i en inkubator (37 ° C, 10% CO2). Bemærk: op til 20 dækglas kan fremstilles ud fra en gennemsnitlig kuld på 8 rotteunger.
- Fire timer efter udpladning neuroner, aspireres opløsningen for at fjerne cellerester og erstatte med 150-200 pi opvarmet frisk NBM. Bemærk: media kan kræve daglig opfyldning for at undgå dehydrering.
- Retur dækglas til inkubatoren, indtil de skal elektrofysiologiske optagelser. Bemærk: dissocieret spiralganglion neuron kulturer kan anvendes til elektrofysiologiske eksperimenter timer efter dissociation og i op til to dage derefter. Time in vitro bør tages i betragtning under analysen af resultaterne. Genopbygge NBM hver 24-48 timer.
2.. Forberedelse til patchclamp Recordings
- Forbered løsninger
- Intracellulær (mikropipette) løsning: 115 mM K-gluconat, 7 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,05 mM EGTA, 2 mM Na 2 ATP, 2 mM MgATP, 0,5 mM Na 2 GTP (justere pH 7,3 med KOH, justere til 295 mOsmol / kg med sukrose). Passere opløsningen gennem et sterilt filter (0,2 um) og opdele i 200 ul alikvoter skal opbevares ved -20 ° C indtil dagen for optagelsen.
- Ekstracellulær (bad) opløsning: 137 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose (indstilles til pH 7,4 med NaOH, justere til 300-310 mOsmol / kg med saccharose) . Denne opløsning fremstilles på dagen for optagelsen.
- Forbered optagelse mikropipetter med en modstand på 2-6 MOhm. Vi bruger en CO 2 laser aftrækker (P-2000, Sutter Instruments) og borosilikatglas (1,0 mm udvendig diameter 0,58 mm indvendig diameter 75 mm længde).
- Forbered laser. Denne protokol er beregnet til brug med en fiber-koblet laser, såsom 1.870 nm Infrarød nervestimulator fra OptoTech P / L. Den optiske fiber bruges til lys levering i vores eksperimenter er en 200/220 um kerne / beklædning diameter silica fiber med en numerisk apertur på 0,22 og FC-PC stik i begge ender (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). De patchkabler blev skåret i halve at producere to fiber rottehaler (dvs. connectorized ved den ene ende og spaltes på den anden). Virkningerne af fiber kernediameter og numerisk blænde på laserinduceret temperaturændringer er blevet drøftet i detaljer af Thompson et al. 25.
- Cleave spidsen af lyset levering fiber under anvendelse af standardteknikkerog sikre, at den resulterende spids er af høj kvalitet ved observation med et optisk mikroskop (dvs. spidsen skal være vinkelret på fiberaksen og stå fladt ved visuel inspektion). Tilslut lyset levering fiber til fiber-koblede udgang stimulation laser med en passende gennem-stik (f.eks Thorlabs ADAFC2).
- Måle output laser strøm fra spaltede spids af lyset levering fiber ved hjælp af et passende instrument (f.eks Sammenhængende FieldMate med LM-3-detektor hoved). Det anbefales at kontrollere laser magt, hver gang lyset levering fiber spaltes eller en betydelig justering af laseren (fx transport fra den ene lab til en anden).
- Indsæt let levering fiber i en fiber chuck eller tilsvarende enhed, og anbringer borepatron til den relevante micropositioner. Det er vigtigt at være i stand til nøjagtigt at bestemme vinklen θ at den optiske fiber gør med dækglasset. Denne angle kan måles ved at tage et fotografi af den eksperimentelle arrangement og bruge billedbehandling software (f.eks ImageJ) for at få vinklen. Vinklen θ (eller et interval af mulige vinkler) er primært begrænset af rumlige begrænsninger af den eksperimentelle arrangement - især mikroskopet. Typiske værdier for θ i vores eksperimenter (baseret på en opretstående mikroskop) er omkring 36 °, den optimale vinkel kan dog variere betydeligt for alternative opstillinger (fx dem, der bruger et inverteret mikroskop).
- Skabe forbindelser mellem laseren og patch-clamp-dataopsamlingssystem (f.eks Digidata 1440A, Molecular Devices) som vist i figur 2.. Den digitale udgang fra patch-clamp-dataopsamlingssystem skal tilsluttes laseren via en ekstern funktion generator, der gør det muligt at specificere laser pulsparametrene uafhængigt af dataopsamlingssystem. Alternativt denne udgang kan tilsluttes direkte tillaserdriveren (kræver puls længde og gentagelser, der skal fastsættes af datafangst software). I begge tilfælde bør det signal anvendes til at udløse laseren forbindes tilbage til en indgang af dataopsamlingssystem at sikre, at tidsplanen og længden af laserpulser kan optages samtidig med elektrofysiologiske signal.
3.. Patch clamp optagelser til Undersøgelse af INS
- Fyld en passende beholder perfusionssystemet med ekstracellulær opløsning og justere flowhastigheden at tilvejebringe perfusion af badet med en hastighed på 1-2 ml / min. Vi bruger en tyngdekraft-fodret systemet (aspirator flaske, slangeventil, og PE-rør) med en in-line varmelegeme at muliggøre hurtig opvarmning af opløsningen, og en peristaltisk pumpe til at fjerne brugt opløsning ved sugning.
- Placer et dækglas med dyrkede celler i optagelsen kammer (bad) i en opretstående mikroskop. Ved hjælp af en stor forstørrelse vand immersionsobjektivet (e. Gram. 40X) og fase-kontrast (f.eks differential interferens kontrast eller Dodt gradient kontrast), visuelt lokalisere spiral ganglion neuroner i kulturen. En typisk spiral ganglion neuron er fase-lyse, runde og cirka 15 um i diameter med en fremtrædende kerne, som vist i figur 1a.
- Når en neuron er blevet lokaliseret, skifte til en lavere forstørrelse mål (f.eks 10X) og lokalisere målet neuron inden for synsfeltet.
- Flyt lyset levering optiske fiber i position ved hjælp af følgende procedure (eller tilsvarende):
- Brug micropositioner at flytte output fiber indtil spidsen er tæt på målet neuron i både vandrette og lodrette flader. Den lodrette position af fiberen spids kan verificeres ved at flytte målet op og ned (scanning fokus).
- Skift tilbage til høj forstørrelse objektiv og placere spidsen af den optiske fiber i sin hensigt position ved siden af than neuron (se figur 2 indsat). Ved justering den lodrette position af fiberen, er det vigtigt, at den nederste kant af fiberen hviler på (dvs. netop rører) dækglasset, at mindske usikkerheden i placeringen af fiberen. Optimal tilpasning i det vandrette plan, vil afhænge af den vinkel θ at fiberen gør med dækglasset og radius af fiberen r.. For at positionere fiberen, således at midten af målet neuron ligger langs fiberaksen, bør den vandrette afstand mellem den øvre kant af fiberen og målcellen være
Δ target = r (cosec θ - 2 sin θ)
hvor negative værdier tyder på, at de optiske fibre udhæng cellen. Ved justering af fiberen, kan en afstand på Δ målet mellem den øverste kant af fiberen og midten af neuron være omtrent opnås ved visuel inspektion. Men Δ mål er designet til attjene som en grov rettesnor alene. Placering af fiberen, således at den faktiske afstand Δ mellem den øvre kant af fiberen og centrum af neuron afviger måleligt fra Δ mål (som i figur 1) kan give indsigt i virkningen af både radial forskydning (dvs. fra midten af beam) og aksial forskydning (dvs. langs fiberen akse) af strålen i forhold til målet neuron. For eksempel ≈ 0 fastsættelse Δ ville forventes at øge den lokale temperatur i nærheden af cellen - dvs eftersom strålen profil for typiske multimode fibre godt bliver tilnærmet med en høj hat fordeling 26. Faldet i lokalt absorberede energi (temperatur) grundet forskydning fra midten af strålen er minimal sammenlignet med stigningen i energi, der absorberes i at flytte fiberendeflade tættere til cellen.
Mens der skal sørges for at positionere fiberen så præcist og repeatably som possible bruge visuelle signaler, præcis måling af fiber placering i forhold til målet neuron (fx Δ) er af større betydning end at placere den en forudbestemt afstand. Δ kan bestemmes (med en anslået maksimal usikkerhed på ± 3 m) ved billedanalyse, som beskrevet i trin 3.8.2 i protokollen. I nogle forsøg 5,8, har hvidlyskilder blevet koblet gennem fiberen for at målrette den ønskede celle. Denne fremgangsmåde viste sig at være ineffektiv i det opretstående mikroskop setup, som intensiteten af lys spredes fra målområdet var forholdsvis lav på disse lavvandede vinkler (θ). - Når fiberen er i position, flytte dem ud af en kendt mængde at muliggøre enkel positionering af mikropipette. Fiberen kan derefter returneres til den oprindelige position, når et neuralt optagelse er opnået.
- Fyld mikropipette med intracellulære løsning og sikkert passe på plads på hovedetTage af forstærkeren (f.eks Multiklemmen 700B, Molecular Devices). Brug rørene forbundet til siden af mikroelektrode indehaver, en lille mængde af positivt tryk til at forhindre tilstopning af mikropipette anvendelse.
- Ved hjælp af en mikromanipulator, mikropipette flytte ind position lige over målet neuron.
- Protokol for helcelle optagelser:
- Påfør en 10 msek, +10 mV firkantet bølge puls (f.eks Seal Test) i spænding-clamp-mode på forstærkeren og juster mikropipetten potentiale (pipette offset) i baseline signal til 0 nA. Forseglingen Testen bør også anvendes til at bestemme, om modstanden af mikroelektrode er inden for det ønskede interval (f.eks 2-6 MOhm).
- Mens overvågning af modstanden, anvendes der fine justeringer af mikromanipulator til forsigtigt placere mikropipette på overfladen af målet neuron. Når mikropipetten er i kontakt med neuron, vil modstanden stige (ved ~ 0,5 til 1 MOhm). Jegmmediately efter modstanden stiger, fjernes det positive væsketryk og anvende en lille undertryk. Når modstanden er gået 10 - 20 MOhm fastsætte membranpotentialet en bedrift niveau (f.eks omkring -60 mV).
- Elektroden resistens bør fortsætte med at stige, indtil den overstiger 1 GQ, som betyder, at en effektiv tætning (såkaldt »gigaseal ') er blevet dannet mellem cellemembranen og mikropipette. På dette tidspunkt fjernes alle fluidumtrykket fra mikropipette.
- Når gigaseal er blevet dannet, bruge korte strømimpulser (25 til 100 mikrosekunder, en V) eller korte pulser af negativt fluidumtryk til sprængning cellemembranen og opnå helcelle konfiguration.
- Optag membran kapacitans, serie modstand og input modstand som bestemt ud fra den eksponentielle kurve monteret strømmen under forseglingen testimpuls. Minimer kapacitans transienter ved at justere CpFast og CpSlow kontroller på forstærkeren, så switch forstærkeren i hele celle-tilstand, og kompensere kapacitans og modstand, indtil en flad strøm overholdes under segl test. Påfør serie modstand kompensation (~ 70% korrektion 70% forudsigelse), justere kapacitans og modstand kontrol for at opretholde en flad test sæl respons.
- Skift til strøm-clamp modus i forstærkeren. Vær opmærksom på den hvilende membran potentiale (i mangel af aktuelle injektion). Indstil en holdestrøm at stabilisere membranpotentialet på det ønskede niveau (f.eks -60 mV). Neutraliseres pipetten kapacitans og justere broen balance afbalancere spændingsfaldet.
- Kontroller fyring egenskaber neuron ved at stimulere med depolariserende strøm (10-200 pA i +10 pA trin; 300 msek varighed).
- Flyt den optiske fiber tilbage i position ved siden af neuron. Brug imaging software koblet til et CCD-kamera, billeder af positionen af fiberen fange med hensyn til målet neuron, der fokuserer på planet af neuron oprindeligt, og derefter på den øverste kant af den optiske fiber (se figur 1).
- Ved efterfølgende analyse af de resulterende billeder (f.eks figurer 1b og 1c) er det muligt præcist at bestemme Δ (positionen af den øvre kant af den optiske fiber i forhold til midten af målet neuron). Når Δ er kendt, kan parametre, såsom afstanden fra fiberens endeflade til målet neuron (langs fiberaksen) z og den radiale forskydning af neuron fra midten af strålen δ r beregnes ved hjælp af simple trigonometriske relationer:
z = r sin 2θ + Δ cos θ
δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) 2 + AY 2) 1/2,
hvor AY er afstanden mellem fiberaksen og centrum af neuron set ovenfra (fx see figur 1).
Analysen skal tage hensyn positionelle variationer fra celle til celle, så nøjagtig viden om disse geografiske parametre kan være nødvendigt for at løse eventuelle forskelle mellem stimulering processer 25.
4.. INS Eksperimenter
- Under optagelse af elektrofysiologiske data i enten strømtang eller spænding clamp konfigurationer køre stimulation laser på de ønskede parametre (f.eks magt, puls længde, repetitionshastighed osv.). Med vores laser, er den optiske effekt styres via en direkte indgang til laserdriveren og er angivet manuelt før hver optagelse. Pulslængde og gentagelse Hastigheden kan kontrolleres ved enten et eksternt signal generator eller dataopsamlingssoftware (som beskrevet i trin 2.3.4). Sikre, at data registreres fra både patch clamp-kanalen og laseren trigger kanal.
Laserpulser med længder spænderfra ca 500 mikrosekunder til 15 ms og energier ~ 0,25-5 mJ pr giver typisk målbare elektriske reaktioner. Indstilling gentagelseshastighed på laserpulser at være 1 Hz eller mindre kan være nyttige for indledende forsøg, da det vil minimere virkningerne af denne parameter. Typiske resultater, som viser ændringen i den optagede signal præsenteres i det følgende afsnit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spiral ganglion neuroner svare laserbelysning med gentagelig bølgeformer i både spændings-clamp og strøm-clamp optagelse konfigurationer. 3a viser typiske ændringer i strømmen på tværs af en cellemembran som reaktion på en 2,5 msek, 0,8 mJ laser puls (gennemsnitlig respons fra 6 laserpulser, gentaget med 1 sek intervaller) med membranpotentialet holdt ved -70 mV, -60 mV til -50 mV. Net indad strømme er konsekvent fremkaldte reaktion på laserpulser, vender tilbage til de oprindelige værdier, efter belysningen er ophørt. Formen af laser induktionsstrøm kan ses at variere som membranpotentialet ændres, hvilket indikerer, at det kan være vigtigt at udføre eksperimenter på en række af holding potentialer for at få en fuldstændig forståelse af processerne bag INS. Disse eksperimenter kan udføres med mindre ændringer af den gældende protokol og analyseret ved anvendelse af etablerede teknikker såsom charge-spænding (QV) analyse (see Henvisning 7 for eksempler på QV kurver opnået fra INS in vitro).
De data, der præsenteres i figur 3b er vejledende af ændringen i membranpotentialet typisk fremkaldt af en 2,5 ms 0,8 mJ laserpuls (initial membranpotentialet-73mV, i gennemsnit over 16 laserpulser leveres på en gentagelse på 4 Hz). Strøm-clamp optagelser vise en stabil membrandepolarisering løbet af laserimpulsen efterfulgt af en omtrent eksponentiel formindskelse mod hvilende membranpotentiale efter impulsen. Eksemplet i figur 3b også udviser en lille ekstra membrandepolarisering efter laserimpulsen. Shapiro et al. 7 er vist, at laser-inducerede ændringer i membranpotentialet er nært knyttet til lokale ændringer i temperatur (dvs. temperaturen i umiddelbar nærhed af cellen). Endvidere model beskrevet af Thompson et al. 27.har fastslået, at under visse betingelser tilpasning, kan diffusion følge af aksiale og radiale temperaturgradienter i den belyste region føre til lokale temperaturvariationer tæt op ad ændringerne i membranpotentialet vist i figur 3b. Som et resultat af disse resultater menes det, at positionen af målcellen i forhold til den endelige flade af lyset levering fiber spiller en væsentlig rolle ved opgørelsen både tidsforløbet af laser-fremkaldte variationer i membranpotentialet og den maksimale temperatur i området af cellen.
Lysmæssigt med overdreven energi eller udsættelse for store stigninger i temperaturen kan resultere i skader på målet neuron. Dette kan ofte iagttages gennem forringelse af celle elektriske egenskaber (f.eks en brat stigning i strøm for at opretholde membranpotentialet på et stabilt niveau, og / eller en stor stigning i støj og ustabilitet i signalet). I ekstreme tilfældes celledød indtræffer næsten øjeblikkeligt efter laser eksponering. Figur 4 viser en spænding-clamp registrering af død af en spiral ganglion neuron følge af eksponering for en 25 msek, 8 mJ laser puls.
Figur 1. Fasekontrast billeder, der viser en typisk spiral ganglion neuron og de relative positioner af optisk fiber og mikropipette (set fra oven) i optisk stimulation eksperimenter. A) Typisk spiral ganglion neuron. B) Den optiske fiber i position (billedet er fokuseret på den øverste kant af den optiske fiber) c) overlejrede billeder, der viser fiberen position i forhold til cellen (bemærk:. den øverste kant af fiberen er let overhængende cellen, dvs Δ er negativ). Som det fremgår ovenfor, δ y og & Delta, er den radiale forskydning af neuron centrum fra fiberaksen og afstanden fra den øverste kant af fiberen til midten af neuron hhv. Pile viser positionen af spiral ganglion neuron. Skalapanelerne 20 um.
Figur 2. Skematisk af forsøgsopstillingen for optiske stimulering eksperimenter (ikke målfast) Indsat:. Stilling optisk fiber og mikroelektrode forhold til målcellen. θ, Δ og z er som defineret i protokol trin 3.4.2 og 3.8.2.
Figur 3.. A) Spænding-clamp (gennemsnitlig respons fra 6 laserpulser deliverød med en hastighed på 1 Hz) og b) løbende clamp (gennemsnitlig respons fra 16 laserpulser gentaget med en hastighed på 4 Hz) optagelser fra spiral ganglion neuroner viser laserinduceret ændringer i membran strøm og membran potentiale ved belysning af en 2,5 msek , 0,8 mJ laser puls. Skraverede regioner viser timingen af laserstråling. Mellemværker viser reaktioner under laserbelysning mere detaljeret. Bemærk: det indsatte i et) fokuserer på sporet opnås med en membran potentiale -60 mV. Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Spænding-clamp optagelse viser celledød som følge af eksponering til den overdrevent energisk (25 msek, 8 mJ) laserpuls. Bemærk, at amplituden afsignalet er vist i nA og er væsentligt større end de pA strømme i figur 3 viste.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelse af de protokoller, der er skitseret i dette dokument, er det muligt at udtrække og kultur spiral ganglion neuroner og til at undersøge laser-fremkaldt elektrisk aktivitet ved at udføre helcelle patch clamp eksperimenter. Når det bruges i vitro patch clamp-teknikken giver et niveau af kontrol over eksperimentelle parametre, som ikke kan opnås in vivo. Laser stimulering parametre såsom bølgelængde, puls energi, puls længde, puls form og pulsrepetitions sekvenser kan studeres i en reproducerbar indstilling. Desuden kan det miljø, hvori neuronerne er vedligeholdt (dvs. opløsning temperatur, kemiske faktorer) systematisk varieret, hvilket gør det muligt at studere membranen egenskaber og kan derfor mekanismerne bag infrarød neural stimulation. Samspillet mellem elektriske og optiske stimulation modaliteter kan også blive undersøgt i en kontrolleret måde. Disse grundlæggende undersøgelser kan blive yderligere fremmet ved at indføre fluorescent prober at overvåge yderligere parametre såsom ioniske koncentrationer eller ekspressionen af varmechokproteiner. En klar forståelse af disse forskellige parametre er ikke kun afgørende for at opnå en fuldstændig forståelse af fænomenet, men også for at opnå en mere effektiv stimulation gennem procesoptimering.
På grund af den vigtige rolle, som temperaturen i den mekanisme af INS 5-7, nøjagtig måling af lokal opvarmning på grund af laserbelysning er af afgørende betydning at definere denne mekanisme 27. En detaljeret metode til opnåelse af kalibrerede temperaturmålinger ved at registrere den strøm gennem en åben patch pipette er blevet beskrevet af Yao et al. 28 og ansat af talrige forfattere, at bestemme størrelsen og tidsforløbet af laser-inducerede temperaturændringer i miljøer repræsentative for dem fundet in vitro (se f.eks Referencer 7, 8). Gived stilling lyset levering fiber kan bestemmes præcist (fx med den nuværende protokol), denne metode til temperaturmåling er sandsynligt at muliggøre nøjagtig kortlægning af den lokale ændring i temperaturen på grund af typiske INS stimuli.
Bølgelængden af den stimulerende laser er en parameter, som bør overvejes i INS eksperimenter, eftersom laser inducerede temperaturændringer (og dermed de underliggende mekanismer INS) medieres af bølgelængde-afhængige egenskaber af vand 7 (se Thompson et al. 25 for en detaljeret diskussion af forventede bølgelængde effekter). Bortset fra 1.870 nm diode laser, der anvendes i denne protokol (Infrarød Nerve Stimulator, Optotech P / L), en række bølgelængder og laser pakker er blevet brugt af andre forfattere. Nogle almindelige eksempler på lasere, der anvendes i eksisterende INS publikationer er: diodelasere fra Aculight med bølgelængder der spænder fra 1,840-1,940 nm 6,7,10,13,16-18, Holmium: YAG lasere (2.12 pm) fra Laser 1-2-3 6,11,12,14,15, og diode lasere, der opererer ved 1.875 nm 5,8, 1.470 nm 8 og 1.535 nm 8 fra Sheaumann laser.
En potentiel ulempe ved at anvende denne teknik til dyrkede spiral ganglion neuroner, er, at på grund af den relativt lille størrelse af neuroner (~ 10-15 um diameter), er optagelsen elektroden direkte belyst af laseren. Det er blevet foreslået, at laserbelysning over en vis tærskel kan ændre egenskaberne for optagelsen kredsløbet 7 (dvs. tætning og pipette resistens). Shapiro et al. 7. målt denne tærskel ved at overvåge ændringer i tilbageførsel potentiale QV kurver som laser magt blev øget, at finde en tærskel puls energi på 3 mJ. Som en alternativ fremgangsmåde kan det være muligt at bestemme omfanget af denne effekt ved at måle den kombinerede modstand af forseglingen, og pipetten i whul celle tilstand (f.eks ved optagelse af den aktuelle reaktion på en 10 msek +10 mV spænding puls), mens variere temperaturen af den ekstracellulære opløsning. For fuldt ud at forstå de mekanismer INS, er det afgørende, at laser induceret resistens ændringer måles og tages i betragtning.
Til dato hovedparten af eksperimentelt arbejde vedrørende infrarød neural stimulation er blevet iværksat in vivo. Mens indberettede strålingseksponering tærskler for infrarød stimulation in vivo variere noget (f.eks 0,32 JCM -2 kl 2.12 um for rotte ischiadicus nerver 1, <0,1 JCM -2 kl 1,855 um til gerbil auditive nerver 18), de er betydeligt lavere end tærskler fastlagt ved in vitro-undersøgelser (f.eks cirka 20 JCM -2 kl 1,875 um til mus retina-ganglieceller og rotte vestibulære ganglion celler 5,8, 8,3 J cm -2 for rotte neonatal cardiomycytes 9). På dette stadium detaljerne i INS processen er ikke tilstrækkeligt godt forstået at spekulere om årsagen til denne forskel, men kan ved hjælp af in vitro-modeller, såsom auditive neuroner, der nøje ligner målene for tidligere in vivo arbejde være en fordel i at finde en forklaring .
Nogle andre in vitro-modeller involverer større celler, såsom Xenopus-oocytter (~ 1 mm i diameter), der anvendes af Shapiro et al. 7. Disse kan være nyttige til sondering rumlige variationer i effektiviteten af INS tværs af individuelle celler for at undersøge, om cellulære komponenter påvirkes ved stimulering. Enklere modeller såsom lipid dobbeltlagsvesikler kan tillade endnu mere præcis kontrol over eksperimentelle parametre end in vitro-forsøg, der dog sådanne modeller noget begrænset i omfang og ikke kan afsløre den fulde kompleksitet af INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den australske forskningsråd under Linkage Projektbevilling LP120100264.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. | |||
References
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al.
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T.
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscience. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. Optical Waveguide Theory. , Chapman and Hall. (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
