Summary
La estimulación del nervio infrarrojos ha sido propuesta como una alternativa a la estimulación eléctrica en una gama de tipos de nervios, incluyendo los asociados con el sistema auditivo. Este protocolo describe un método de patch clamp para estudiar el mecanismo de estimulación nerviosa de infrarrojos en un cultivo de neuronas auditivas primarias.
Abstract
Se ha demostrado en los últimos años que la luz láser pulsado, infrarrojos puede ser utilizado para provocar respuestas eléctricas en el tejido neural, independiente de cualquier modificación adicional del tejido diana. Estimulación neural de infrarrojos ha sido reportado en una variedad de tejido neural periférica y sensorial in vivo, con particular interés se muestra en la estimulación de las neuronas en el nervio auditivo. Sin embargo, mientras que el INS se ha demostrado que funciona en esta configuración, el mecanismo (o mecanismos) por el cual la luz infrarroja provoca excitación neuronal está actualmente no se entiende bien. El protocolo presentado aquí describe un método de patch clamp de célula completa diseñada para facilitar la investigación de la estimulación neural de infrarrojos en las neuronas auditivas primarias cultivadas. Al caracterizar a fondo la respuesta de estas células a la iluminación láser infrarrojo in vitro bajo condiciones controladas, puede ser posible obtener una mejor comprensión de la Physica fundamentall y procesos bioquímicos subyacentes estimulación neural infrarrojos.
Introduction
Los campos de la neurofisiología y médica biónica dependen en gran medida en las técnicas que permiten la estimulación controlable de respuestas eléctricas en el tejido neural. Mientras que la estimulación eléctrica sigue siendo el estándar de oro en la excitación neuronal, que adolece de una serie de inconvenientes tales como la presencia de artefactos de estimulación cuando se graban las respuestas neurales, y la falta de especificidad de la estimulación debido a la propagación de la corriente en el tejido circundante 1.
Las últimas dos décadas han visto el desarrollo de técnicas de estimulación mediada ópticamente 2. Varias de estas técnicas requieren la modificación del tejido diana, ya sea a través de la adición de una molécula en particular (por ejemplo, moléculas de jaula) 3 o alguna forma de manipulación genética (por ejemplo, la optogenética) 4, ninguno de los cuales son fáciles de aplicar fuera de un contexto de investigación. De particular interés, por tanto, la estimulación neural infrarrojos (INS), whereby tejido nervioso se excita con luz láser infrarroja pulsada. INS tiene el potencial de superar muchas de las deficiencias de la estimulación eléctrica, permitiendo altamente específica, la estimulación sin contacto de tejido neural 2. Sin embargo, mientras que el INS se ha demostrado con éxito en una variedad de ajustes in vivo, el mecanismo preciso de la excitación sigue siendo incierto.
Algunas publicaciones recientes han mostrado un progreso hacia el descubrimiento del mecanismo detrás de INS 5-7. Calentamiento rápido debido a la absorción de la luz láser por el agua parece jugar un papel clave. Sin embargo, más allá de este consenso aún no se ha alcanzado. Shapiro et al. 7 proponen un mecanismo muy general según el cual el calentamiento rápido hace que una perturbación en la distribución de partículas cargadas adyacentes a la membrana celular, que conduce a un cambio en la capacitancia de la membrana celular y la posterior despolarización. Además, Albert et al. 5 afirman que lasecalefacción inducida r activa una clase específica de temperatura canales iónicos sensibles (receptor de potencial transitorio canales vaniloide), permitiendo que los iones pasen a través de la membrana celular. En esta etapa no está claro cómo se combinan estos mecanismos, o incluso si hay otros factores que aún no se han identificado.
Aunque un pequeño número de publicaciones (referencias 5,7-9) han investigado INS in vitro, la gran mayoría de los trabajos publicados en este campo se ha llevado a cabo in vivo (por ejemplo, referencias 1,6,10-18). Estimulación de las neuronas auditivas infrarrojos ha sido un área de particular interés, debido a las potenciales aplicaciones en implantes cocleares 10,14-18. Mientras que en experimentos in vivo son importantes para verificar la eficacia de la técnica en diversos entornos, el aumento del nivel de control proporcionado por los estudios in vitro se espera que conduzca a una comprensión más detallada del mecanismonismo responsable de INS. Este informe describe la preparación de cultivos de neuronas del ganglio espiral para las investigaciones de patch clamp, ya que estos pueden ser utilizados para estudiar los mecanismos fundamentales mientras que también une a la gran cantidad de datos existentes en el sistema auditivo.
La técnica de patch clamp es una excelente herramienta para la investigación de los fenómenos electrofisiológicos, proporcionando un medio de registro de la actividad eléctrica en las células individuales y el estudio de la contribución de las corrientes subyacentes individuales 19. Cuando esta técnica se aplica a un establo en la preparación in vitro de neuronas primarias, como las neuronas del ganglio espiral cultivadas, ofrece la oportunidad de estudiar en profundidad los mecanismos por los que la actividad neuronal es controlada y manipulada.
Los protocolos especificados en este trabajo se resumen los métodos para investigar el efecto de la estimulación con láser en las propiedades eléctricas de las neuronas del ganglio espiral a través de patch clampgrabaciones. El enfoque se basa en un láser de fibra de acoplamiento en lugar de un láser en el espacio libre, que permite un funcionamiento más seguro, así como más fácil y más repetible alineación sin la necesidad de modificar la configuración de microscopio estándar. Sobre la base de estos protocolos, debería ser posible llevar a cabo una amplia gama de experimentos con el fin de determinar más claramente el mecanismo o los mecanismos detrás de INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultura de las neuronas del ganglio espiral
- Esterilizar pequeñas y redondas (por ejemplo, 10 mm de diámetro) cubreobjetos de vidrio y pinzas curvas en un autoclave. Transfiera los portaobjetos esterilizados en pocillos individuales de una 4-anillo de 35 mm placa de Petri estéril o placa de 4 pocillos, utilizando las pinzas esterilizadas. Aplicar 150 l de poli-L-ornitina (500 mg / ml) y laminina de ratón (0,01 mg / ml) a la superficie superior del cubreobjetos y colocar en una incubadora (37 ° C) durante un máximo de 48 h. Asegúrese de que los cubreobjetos no flotan lejos de la parte inferior del pozo.
- Preparar ml de medio Neurobasal estériles (NBM) 50 para cada cultivo neuronal: 47,5 ml neurobasal A, 0,5 ml de N 2 suplemento, 1 ml de suplemento B27, 0,5 ml de L-glutamina, y 0,5 ml de penicilina-estreptomicina. Nota: Los suplementos pueden ser congelados, almacenados a -20 ° C y se añaden a los medios de comunicación en el día requerido.
- Disociar las neuronas del ganglio espiral de post-natales días 4-7 crías de rata como se describió previamente 20,21, nosción tanto enzimática (0,025% de tripsina y 0,001% de DNasa I) y las técnicas mecánicas. Consulte. Whitlon et al 22 y Vieira et al. 23 para los procedimientos detallados de la cultura ganglio espiral neurona, o Parker et al. 24 para una demostración de aislamiento modiolus.
- Aspirar cualquier solución poly-L-ornithine/laminin restante de los cubreobjetos y se lava brevemente con NBM.
- Añadir 150-200 l de la suspensión de las neuronas del ganglio espiral disociado a los cubreobjetos y colocar en una incubadora (37 ° C, 10% de CO 2). Nota: hasta 20 cubreobjetos se pueden preparar a partir de una camada media de 8 crías de rata.
- Cuatro horas después de las neuronas de chapado, aspirar la solución para eliminar restos de células y reemplazar con 150-200 l calentada NBM fresco. Nota: Los medios pueden requerir la reposición diaria para evitar la deshidratación.
- Cubreobjetos Volver a la incubadora hasta que sea necesario para los registros electrofisiológicos. Nota: Espiral disociadocultivos de neuronas ganglionares se pueden utilizar para los experimentos electrofisiológicos cuatro horas después de la disociación y de hasta dos días a partir de entonces. Tiempo in vitro se debe tomar en cuenta durante el análisis de los resultados. Reponer NBM cada 24 a 48 horas.
2. Preparación para el Patch clamp grabaciones
- Preparar soluciones
- Intracelular (micropipeta) solución: 115 mM de K-gluconato, 7 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 0,05 mM de EGTA, 2 mM de Na 2 ATP, 2 mM de MgATP, 0.5 mM de Na 2 GTP (ajustar el pH a 7,3 con KOH; ajustar a 295 mOsmol / kg con sacarosa). Pasar la solución a través de un filtro estéril (0,2 micras) y se dividen en 200 ml de alícuotas a ser almacenado a -20 ° C hasta el día de la grabación.
- Extracelular (baño) solución: 137 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM de HEPES, 10 mM de glucosa (ajustar a pH 7,4 con NaOH; ajustar a 300-310 mOsm / kg con sacarosa) . Esta solución se hizo en el día de la grabación.
- Preparar grabación micropipetas con una resistencia de 2-6 mW. Utilizamos un láser de CO2 extractor (P-2000, Instrumentos de Sutter) y vidrio de borosilicato (diámetro exterior de 1,0 mm, 0,58 mm de diámetro interior, 75 mm de longitud).
- Preparar el láser. Este protocolo está diseñado para su uso con un láser de fibra de acoplamiento, tales como la 1870 nm infrarrojo estimulador del nervio de Optotech P / L. La fibra óptica se utiliza para la entrega de la luz en nuestros experimentos es una fibra de sílice diámetro del núcleo / revestimiento de 200/220 micras con una apertura numérica de 0.22 y conectores FC-PC en ambos extremos (AFW Tecnologías MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). Los cables de conexión se cortaron por la mitad para producir dos trenzas de fibra (es decir, conectorizado en un extremo y se escindió en el otro). Los efectos de diámetro de núcleo de la fibra y la apertura numérica de los cambios de temperatura inducidas por láser se han discutido en detalle por Thompson et al. 25
- Cleave la punta de la fibra de distribución de luz usando técnicas estándary asegúrese de que la punta resultante es de alta calidad mediante la observación con un microscopio óptico (es decir, la punta debe ser perpendicular al eje de la fibra plana y aparecerá la inspección visual). Conecte el suministro de luz de fibra a la producción de fibra de acoplamiento del láser estimulación mediante un apropiado a través del conector (por ejemplo Thorlabs ADAFC2).
- Medir la potencia del láser de salida de la punta escindido de la fibra de suministro de luz usando un instrumento apropiado (por ejemplo FieldMate coherente con LM-3 cabezal detector). Se recomienda comprobar la potencia del láser cada vez que la fibra de distribución de luz se corta o se hace un ajuste significativo al láser (por ejemplo, el transporte de un laboratorio a otro).
- Inserte la fibra de suministro de luz en una tirada de fibra o dispositivo equivalente y colocar el plato a la microposicionador apropiado. Es importante ser capaz de determinar con precisión el ángulo θ que la fibra óptica hace con el cubreobjetos. Esta espe se puede medir tomando una fotografía de la disposición experimental y el uso de software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, ImageJ) para obtener el ángulo. El ángulo θ (o gama de posibles ángulos) está limitada principalmente por las limitaciones espaciales de la disposición experimental - en particular, el microscopio. Los valores típicos de θ en nuestros experimentos (sobre la base de un microscopio vertical) son alrededor de 36 °, sin embargo, el ángulo óptimo puede diferir significativamente de las configuraciones alternativas (por ejemplo, los que utilizan un microscopio invertido).
- Haga las conexiones entre el láser y el sistema de adquisición de datos de patch clamp (por ejemplo Digidata 1440A, Molecular Devices) como se muestra en la Figura 2. La salida digital del sistema de adquisición de datos de patch clamp se debe conectar al láser a través de un generador de función externa, por lo que es posible especificar los parámetros del pulso láser independientes del sistema de adquisición de datos. Alternativamente, esta salida se puede conectar directamente ael controlador de láser (que requiere la longitud del impulso y la tasa de repetición para ser fijados por el software de adquisición de datos). En cualquier caso, la señal utilizada para disparar el láser debe ser conectado de nuevo a una entrada del sistema de adquisición de datos para asegurar que el momento y la duración de los pulsos de láser se pueden grabar simultáneamente con la señal electrofisiológica.
3. Patch clamp grabaciones para la Investigación de los INS
- Llenar el recipiente apropiado del sistema de perfusión con solución extracelular y ajustar la velocidad de flujo para proporcionar la perfusión del baño a una velocidad de 1-2 ml / min. Nosotros utilizamos un sistema de alimentación por gravedad (botella del aspirador, válvula de pinza, y el tubo de PE) con un calentador en línea para permitir el rápido calentamiento de la solución, y una bomba peristáltica para eliminar la solución pasó por succión.
- Coloque un cubreobjetos con las células cultivadas en la cámara de grabación (baño) de un microscopio vertical. Con un objetivo de inmersión en agua de gran aumento (e. G. 40X) y de contraste de fase (por ejemplo contraste diferencial de interferencia o contraste gradiente Dodt), localizar visualmente las neuronas del ganglio espiral dentro de la cultura. Una neurona típica ganglio espiral es fase-brillante, redondo y aproximadamente 15 micras de diámetro con un núcleo prominente, como se muestra en la Figura 1a.
- Una vez que una neurona ha sido localizado, cambiar a un objetivo de aumento menor (por ejemplo, 10 veces) y localizar la neurona diana dentro del campo visual.
- Mueva el suministro de luz de fibra óptica en su posición mediante el siguiente procedimiento (o equivalente):
- Utilice el microposicionador para mover la fibra de salida hasta que la punta está cerca de la neurona diana en los planos horizontal y vertical. La posición vertical de la punta de la fibra puede ser verificada mediante mover el objetivo arriba y hacia abajo (el enfoque de exploración).
- Cambie de nuevo con el objetivo de gran aumento y la posición de la punta de la fibra óptica en su posición prevista al lado de tque las neuronas (véase la Figura 2 recuadro). Al ajustar la posición vertical de la fibra, es importante que el borde inferior de la fibra está en reposo en (es decir, sólo tocar) el cubreobjetos, para minimizar la incertidumbre en la ubicación de la fibra. La alineación óptima en el plano horizontal dependerá del ángulo θ que la fibra hace con el cubreobjetos y el radio r de la fibra. Con el fin de posicionar la fibra de modo que el centro de la neurona diana se encuentra a lo largo del eje de la fibra, la distancia horizontal entre el borde superior de la fibra y la célula diana debe ser
Δ target = r (cosec θ - 2 sen θ),
donde los valores negativos indicarían que los voladizos de fibra óptica de la célula. Cuando la alineación de la fibra, una distancia de objetivo Δ entre el borde superior de la fibra y el centro de la neurona se puede lograr aproximadamente por inspección visual. Sin embargo Δ objetivo está diseñado parasólo sirven como una guía aproximada. Colocación de la fibra de tal manera que la distancia real de Δ entre el borde superior de la fibra y el centro de la neurona difiere considerablemente de Δ objetivo (como en la figura 1) puede proporcionar información sobre el efecto de tanto desplazamiento radial (es decir, desde el centro de la haz) y el desplazamiento axial (es decir, a lo largo del eje de la fibra) de la viga con relación a la neurona diana. Por ejemplo, el establecimiento de Δ se esperaría ≈ 0 para aumentar la temperatura local en las proximidades de la célula - es decir, desde el perfil del haz de fibras multimodo típicos se aproxima bien por una distribución de sombrero de copa 26, la disminución de la energía absorbida a nivel local (temperatura) debido al desplazamiento del centro del haz es mínima en comparación con el aumento de la energía absorbida de mover la cara de extremo de la fibra más cerca de la célula.
Si bien se debe tener cuidado para posicionar la fibra con la mayor precisión y repetidamente como possible usando señales visuales, la medición precisa de la ubicación de la fibra respecto al objetivo de neurona (por ejemplo, Δ) es de mayor importancia que posicionándolo a una distancia predeterminada. Δ se puede determinar (estimando una incertidumbre máxima de ± 3 m) por análisis de imagen como se describe en el paso 3.8.2 del protocolo. En algunos experimentos 5,8, fuentes de luz blanca se han acoplado a través de la fibra con el fin de apuntar a la celda deseada. Se encontró que este enfoque a ser ineficaz en la configuración de microscopio vertical, como la intensidad de la luz dispersada desde la región diana fue relativamente baja en estos ángulos poco profundas (θ). - Una vez que la fibra está en la posición, moverlo a cabo por una cantidad conocida para permitir el posicionamiento directo de la micropipeta. La fibra puede entonces ser devuelto a la posición original cuando se consigue una grabación neuronal.
- Llene la micropipeta con solución intracelular y en forma segura en su lugar en la cabezataje del amplificador (por ejemplo MultiClamp 700B, Molecular Devices). Uso de tubo conectado a un lado del soporte de microelectrodo, aplicar una pequeña cantidad de presión positiva para evitar la obstrucción de la micropipeta.
- El uso de un micromanipulador, mueva la micropipeta en posición justo por encima de la neurona diana.
- Protocolo para las grabaciones de células enteras:
- Aplicar a 10 ms, 10 mV impulso rectangular (por ejemplo, prueba de Seal) en el modo de fijación de voltaje del amplificador y ajuste el potencial micropipeta (pipeta de desplazamiento) de la señal de referencia a 0 nA. El ensayo de sellado también se debe utilizar para determinar si la resistencia del microelectrodo es dentro del intervalo deseado (por ejemplo, 2 - 6 mW).
- Mientras que el control de la resistencia, utilizar ajustes finos de la micromanipulador para posicionar suavemente la micropipeta sobre la superficie de la neurona diana. Cuando la micropipeta está en contacto con la neurona, la resistencia aumentará (por ~ 0,5 a 1 mW). Yommediately tras el aumento de la resistencia, eliminar la presión del fluido positivo y aplicar una pequeña presión negativa. Una vez que la resistencia ha pasado 10 a 20 mW, fijar el potencial de membrana a un nivel de mantenimiento (por ejemplo, alrededor de -60 mV).
- La resistencia del electrodo debería seguir aumentando hasta que excede 1 GΩ, lo que significa que un sello efectivo (denominado 'gigaseal') se ha formado entre la membrana celular y la micropipeta. En este punto, eliminar toda la presión de fluido de la micropipeta.
- Una vez se ha formado la gigaseal, usar pulsos cortos de corriente (25 a 100 microsegundos; 1 V) o breves pulsos de presión de fluido negativa a la ruptura de la membrana celular y lograr la configuración de células enteras.
- Registre la capacitancia de la membrana, la resistencia en serie y la resistencia de entrada como se determina a partir de la curva exponencial ajustada a la corriente durante el pulso de ensayo de sellado. Minimizar los transitorios de capacidad mediante el ajuste de los controles CpFast y CpSlow en el amplificador, entonces switcse observa h el amplificador en el modo de célula completa, y compensar la capacitancia y la resistencia hasta que una corriente plana durante el ensayo de sellado. Aplicar compensación de resistencia en serie (corrección ~ 70%; 70% de predicción), ajustar los controles de la capacitancia y la resistencia para mantener un sello de prueba de respuesta plana.
- Cambie al modo de corriente-clamp en el amplificador. Tomar nota del potencial de membrana en reposo (en ausencia de inyección de corriente). Establecer una corriente de retención para estabilizar el potencial de la membrana en el nivel deseado (por ejemplo, -60 mV). Neutralizar la capacitancia pipeta y ajustar el balance de puente para equilibrar la caída de tensión.
- Compruebe las propiedades de disparo de la neurona mediante la estimulación con corriente despolarizante (10 a 200 pA pA en 10 pasos, 300 ms de duración).
- Mueva la fibra óptica de nuevo en su posición al lado de la neurona. Usando software de imágenes acoplado a una cámara CCD, la captura de imágenes de la posición de la fibra con respecto a la neuro objetivon, centrándose en el plano de la neurona inicialmente, y luego en el borde superior de la fibra óptica (véase la Figura 1).
- Por el posterior análisis de las imágenes resultantes (por ejemplo, Figuras 1b y 1c) es posible determinar con precisión Δ (la posición del borde superior de la fibra óptica con respecto al centro de la neurona diana). Una vez Δ se conoce, parámetros tales como la distancia desde la cara de extremo de la fibra a la neurona diana (a lo largo del eje de la fibra) z y el desplazamiento radial de la neurona desde el centro de la viga δ r se pueden calcular utilizando las relaciones trigonométricas simples:
z = r sen 2θ + Δ cos θ
δ = r ((r cos 2θ - Δ pecado θ) 2 + Dy 2) 1/2,
donde Dy es la distancia entre el eje de la fibra y el centro de la neurona como se ve desde arriba (por ejemplo, SEe Figura 1).
El análisis debe tener en cuenta las variaciones de posición de celda en celda, como un conocimiento preciso de estos parámetros de ubicación puede ser requerida para resolver las posibles diferencias entre los procesos de estimulación 25.
4. Experimentos INS
- Durante la grabación de los datos electrofisiológicos en cualquiera de pinza de corriente o configuraciones de fijación de voltaje, ejecute el láser de estimulación a los parámetros deseados (por ejemplo, la energía, la duración del pulso, frecuencia de repetición, etc.) Con nuestro láser, la potencia óptica se controla a través de una entrada directa para el controlador de láser y se especifica manualmente antes de cada grabación. Duración de impulso y frecuencia de repetición pueden ser controladas por cualquiera de un generador de señal externa o el software de adquisición de datos (como se describe en el paso 2.3.4). Asegúrese de que los datos se graban tanto el canal de patch clamp y el canal de disparo láser.
Pulsos láser con longitudes que vandesde alrededor de 500 microsegundos a 15 ms y las energías de ~ 0,25 a 5 J por impulso normalmente producir respuestas eléctricas mensurables. Ajuste de la frecuencia de repetición de pulsos de láser a ser de 1 Hz o menos puede ser útil para los experimentos iniciales, ya que reducirá al mínimo los efectos de este parámetro. Los resultados típicos que muestran el cambio en la señal grabada se presentan en la siguiente sección.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Las neuronas del ganglio espiral responden a la iluminación con láser de formas de onda en tanto repetible de fijación de voltaje y configuraciones de grabación actual-clamp. Figura 3a muestra los cambios típicos en el flujo de corriente a través de una membrana celular en respuesta a un 2,5 mseg, 0,8 mJ láser de pulso (respuesta promedio de 6 pulsos de láser, que se repite en intervalos de 1 seg) con el potencial de membrana se celebró en -70 mV, -60 mV y -50 mV. Corrientes de entrada netos se evocan constantemente en respuesta a los pulsos láser, volviendo a los valores iniciales después de la iluminación ha cesado. La forma de las corrientes inducidas por láser puede ser visto como para variar el potencial de membrana se cambia, lo que indica que puede ser importante para llevar a cabo experimentos en un intervalo de potenciales de mantenimiento con el fin de obtener una comprensión más completa de los procesos que subyacen a INS. Estos experimentos pueden llevarse a cabo con una modificación menor del protocolo actual y analizados utilizando técnicas establecidas, tales como la carga-tensión (QV) de análisis (SEe Referencia 7 para ejemplos de curvas QV obtenidos a partir del INS in vitro).
Los datos presentados en la Figura 3b son indicativos del cambio en el potencial de membrana típicamente evocada por un 2,5 mseg, 0,8 mJ láser de pulso (potencial de membrana inicial-73mV, promediado sobre 16 pulsos de láser entregados a una tasa de repetición de 4 Hz). Grabaciones actual-clamp muestran una despolarización de la membrana constante durante el curso del pulso láser seguido por una disminución de aproximadamente exponencial hacia el potencial de membrana en reposo después del pulso. El ejemplo en la figura 3b también muestra una pequeña despolarización de la membrana adicional después del pulso láser. Shapiro et al. 7 han demostrado que los cambios inducidas por láser en el potencial de membrana están estrechamente relacionados con los cambios locales en la temperatura (es decir, la temperatura en la proximidad inmediata de la célula). Además, el modelo descrito por Thompson et al. 27ha determinado que bajo ciertas condiciones de alineación, la difusión resultante de los gradientes de temperatura axiales y radiales en la región iluminada puede dar lugar a variaciones locales de temperatura muy parecidas a los cambios en el potencial de membrana que se muestran en la Figura 3b. Como resultado de estos hallazgos, se cree que la posición de la célula diana con relación a la cara del extremo de la fibra de suministro de luz juega un papel importante en la determinación tanto de la evolución en el tiempo de las variaciones de láser-evocados en el potencial de membrana y la temperatura máxima en la región de la célula.
Iluminando con un exceso de energía o la exposición a grandes aumentos en la temperatura puede resultar en daños a la neurona diana. Esto a menudo puede ser observada a través deterioro de las propiedades eléctricas de células (por ejemplo, un aumento brusco de corriente requerida para mantener el potencial de membrana en un nivel constante, y / o un gran aumento en el ruido y la inestabilidad dentro de la señal). En caso extremos se produce la muerte celular casi instantáneamente después de la exposición de láser. Figura 4 muestra una grabación de fijación de voltaje de la muerte de una neurona de ganglio espiral resultante de la exposición a un 25 mseg, 8 mJ láser de pulso.
Figura 1. Imágenes de contraste de fases que muestra una típica neurona ganglio espiral y las posiciones relativas de fibra óptica y micropipeta (como se ve desde arriba) durante los experimentos de estimulación ópticos. A) Típica neuronas del ganglio espiral. B) La fibra óptica en la posición (imagen se centra en la parte superior borde de la fibra óptica) c) las imágenes superpuestas que muestran la posición de fibra con respecto a la célula (nota:. el borde superior de la fibra está sobresaliendo ligeramente la célula es decir, Δ es negativo). Como se ve desde arriba, y δ y & Delta; son el desplazamiento radial del centro de la neurona de la eje de la fibra y la distancia desde el borde superior de la fibra del centro de la neurona, respectivamente. Las flechas indican la posición de las neuronas del ganglio espiral. Escala de barras de 20 micras.
Figura 2. Esquema de la configuración experimental para los experimentos de estimulación ópticos (no a escala) la inserción:. Posición de la fibra óptica y microelectrodo con respecto a la célula diana. θ, Δ y Z son como se han definido en los pasos de protocolo 3.4.2 y 3.8.2.
Figura 3. A) Voltage-clamp (promedio de respuesta de 6 pulsos láser deliveb) actual-clamp (respuesta promedio de 16 pulsos de láser repetido a una velocidad de 4 Hz) grabaciones de neuronas del ganglio espiral que muestran los cambios inducidos por láser en la membrana potencial de corriente y de la membrana tras la iluminación por un 2,5 mseg rojo a una velocidad de 1 Hz) y , 0,8 mJ láser de pulso. Regiones sombreadas indican el tiempo de exposición al láser. El recuadro muestra las respuestas durante la iluminación láser con más detalle. Nota: la inserción en una) se centra en la traza obtenida con un potencial de membrana de -60 mV. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 4. Grabación de fijación de voltaje que muestra la muerte celular resultante de la exposición a un excesivamente enérgica (25 mseg, 8 mJ) pulso de láser. Tenga en cuenta que la amplitud de losla señal se muestra en la nA y es significativamente mayor que las corrientes de pA mostrados en la Figura 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Usando los protocolos descritos en este documento, es posible extraer y cultura neuronas del ganglio espiral y para investigar laser-evocó actividad eléctrica mediante la realización de experimentos de patch clamp de células enteras. Cuando se usa in vitro, la técnica de patch clamp proporciona un nivel de control sobre los parámetros experimentales que no es alcanzable in vivo. Parámetros de estimulación láser, tales como longitud de onda, energía de pulso, duración del pulso, forma del pulso, y las secuencias de repetición de impulsos pueden ser estudiados en un entorno reproducibles. Además, el entorno en el que se mantienen las neuronas (por ejemplo, temperatura de la solución, factores químicos) puede ser variada de forma sistemática, por lo que es posible el estudio de las propiedades de la membrana y por lo tanto los mecanismos que subyacen a la estimulación neuronal por infrarrojos. La interacción entre eléctricas y ópticas modalidades de estimulación también puede ser investigada de una manera controlada. Estos estudios fundamentales pueden ser más avanzados mediante la introducción de fluorescentes sondas para supervisar parámetros adicionales tales como las concentraciones iónicas o la expresión de proteínas de choque térmico. Una comprensión clara de estos diversos parámetros no sólo es crítica para lograr una comprensión completa del fenómeno, sino también para lograr la estimulación más eficaz a través de la optimización de procesos.
Debido al importante papel desempeñado por la temperatura en el mecanismo de INS 5-7, la medición precisa del calentamiento localizado debido a la iluminación con láser es de suma importancia en la definición de este mecanismo 27. Un método detallado para la obtención de las mediciones de temperatura calibrados mediante el registro de la corriente que fluye a través de una pipeta de parche abierto ha sido descrito por Yao et al. 28 y empleado por numerosos autores, para determinar la magnitud y el curso temporal de los cambios de temperatura inducidas por láser en entornos representativos de los hallado in vitro (por ejemplo, véase las referencias 7, 8). Proporcionard la posición de la fibra de suministro de luz se puede determinar con precisión (por ejemplo, utilizando el protocolo actual), este método de medición de la temperatura es probable que habilitar la asignación precisa del cambio local de la temperatura debido a los estímulos INS típicos.
La longitud de onda del láser estimulante es un parámetro que se debe considerar en los experimentos del INS, ya que los cambios de temperatura inducidas por láser (y por lo tanto los mecanismos subyacentes de la INS) están mediadas por las características de absorción de longitud de onda dependientes de agua 7 (véase Thompson et al. 25 para una discusión detallada de los efectos esperados de longitud de onda). Aparte de los 1870 nm láser de diodo usado en este protocolo (Nerve Stimulator infrarrojos, Optotech P / L), una variedad de longitudes de onda y paquetes de láser han sido utilizados por otros autores. Algunos ejemplos comunes de los láseres utilizados en las publicaciones INS existentes son: los láseres de diodo de AcuLight con longitudes de onda que van desde 1,840-1,940 nm 6,7,10,13,16-18; Holmium: YAG (2,12 m) de Laser 1-2-3 6,11,12,14,15, y los láseres de diodos que funcionan a 1875 nm 5,8, 1,470 nm 8 y 1535 nm 8 de Sheaumann láser.
Un inconveniente potencial de la aplicación de esta técnica a las neuronas del ganglio espiral cultivadas es que, debido a la relativamente pequeño tamaño de las neuronas (~ 10-15 m de diámetro), el electrodo de registro es iluminado directamente por el láser. Se ha sugerido que la iluminación láser más allá de un cierto umbral puede cambiar las propiedades del circuito de grabación 7 (es decir, sellado y resistencia a la pipeta). Shapiro et al. 7 mide este umbral mediante la supervisión del cambio en el potencial de inversión de las curvas QV medida que se incrementó la potencia del láser, la búsqueda de un umbral de energía de pulso de 3 mJ. Como un enfoque alternativo, puede ser posible determinar la magnitud de este efecto mediante la medición de la resistencia combinada de la junta y la pipeta en wel modo de célula de agujero (por ejemplo, mediante el registro de la respuesta actual a un 10 mseg, 10 mV pulso de voltaje), mientras que la variación de la temperatura de la solución extracelular. Para entender completamente los mecanismos de INS, es vital que los cambios en la resistencia inducida por láser medirse y tenerse en cuenta.
Hasta la fecha, la mayoría del trabajo experimental relativo a la estimulación neuronal por infrarrojos se ha llevado a cabo in vivo. Mientras que los umbrales de exposición radiante reportados para la estimulación infrarroja en vivo varían un poco (por ejemplo, 0,32 Jcm -2 a 2,12 m para ratas nervios ciáticos 1, <0,1 Jcm -2 a 1.855 m para los nervios auditivos jerbo 18), son significativamente inferiores a los umbrales determinados por en los estudios in vitro (por ejemplo, aproximadamente 20 Jcm -2 a 1.875 micras para las células ganglionares de la retina de ratón y de rata células ganglionares vestibulares 5,8, 8,3 J cm -2 de rata neonatal miocardiopatíacitos 9). En esta etapa, los detalles del proceso de INS no se entiende suficientemente bien como para especular sobre la causa de esta diferencia, sin embargo, el uso de modelos in vitro, tales como las neuronas auditivas que se asemejan estrechamente a los objetivos de trabajo anterior en vivo puede ser ventajoso en la búsqueda de una explicación .
Algunos otros modelos in vitro implican células más grandes, tales como oocitos de Xenopus (~ 1 mm de diámetro) utilizados por Shapiro et al. 7 Estos pueden ser útiles para sondear las variaciones espaciales en la eficacia de INS a través de células individuales con el fin de investigar si los componentes celulares están influenciados por la estimulación. Los modelos más simples, tales como vesículas bicapa lipídica pueden permitir el control más preciso sobre los parámetros experimentales que en los experimentos in vitro, sin embargo, estos modelos son algo limitadas en su alcance y pueden no revelar toda la complejidad del INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Consejo Australiano de Investigación bajo Vinculación del proyecto de subvención LP120100264.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. | |||
References
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al.
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T.
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscience. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. Optical Waveguide Theory. , Chapman and Hall. (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
