赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

Summary

赤外線神経刺激は、聴覚系に関連するものを含む神経種類の範囲内の電気刺激の代替として提案されている。このプロトコルは一次聴覚神経細胞の培養における赤外線神経刺激のメカニズムを研究するためのパッチクランプ法を説明しています。

Abstract

なお、パルス、赤外レーザ光が標的組織の更なる変形例の独立した神経組織の電気応答を誘発するために使用することができる近年では実証されている。赤外線神経刺激は、聴覚神経の神経細胞の刺激に示される特定の関心と、in vivoで末梢および感覚神経組織の様々報告されている。 INSは、これらの設定で動作するように示されているがしかし、赤外光は、神経興奮を引き起こすする機構（または機構）は、現在よく理解されていない。ここで紹介するプロトコルは、初代培養ニューロンにおける聴覚赤外線神経刺激の調査を容易にするように設計された全細胞パッチクランプ法が記載されている。十分に制御された条件下でin vitroでの赤外レーザ照射に対するこれらの細胞の応答を特徴付けることで、基本的な物理学会の改善された理解を得ることも可能であるlおよび生化学的プロセスは、赤外線神経刺激の基礎となる。

Introduction

神経生理学や医療バイオニクスの分野では、神経組織の電気応答の制御可能な刺激を可能な技術に大きく依存しています。電気刺激は、神経興奮で金本位まま神経応答、および組織^1を取り巻くへの電流の広がりに起因する刺激の特異性の欠如を記録するとき、そのような刺激アーチファクトの存在など多くの欠点に悩まされる。

最後の二十年は、光学的に媒介刺激技術の開発^2を見てきました。これらの技術のいくつかは、どちらも、いずれかの特定の分子を添加する（ 例えば、ケージ分子^）3または遺伝子操作（ 例えば、光遺伝学^）4のいくつかのフォームを、標的組織の変更を必要とする研究の設定の外側に適用することが容易である。特に興味深いのは、そのため赤外線神経刺激（INS）、wherebですyは神経組織、パルス赤外レ​​ーザ光により励起される。 INSは、神経組織²の高度に特異的な、非接触刺激を可能にすることで、電気刺激の欠点の多くを克服する可能性を秘めている。 INSが正常にin vivoでのさまざまな設定で実証されているがしかし、励起の正確なメカニズムは不明である。

最近の出版物は^5-7 INSのメカニズムを解明に向けた進展を示している。水によるレーザ光の吸収による急速加熱が重要な役割を果たすと思われる。しかし、これを超えてコンセンサスがまだ到達しなければならない。シャピロら ^7は、急速加熱が、細胞膜およびその後の脱分極の静電容量の変化をもたらす、細胞膜に隣接する荷電粒子の分布の摂動を引き起こすことにより、非常に一般的なメカニズムを提案する。また、アルバートら ^5はそのLASE ​​を主張rを誘発加熱イオンが細胞膜を通過させ、温度感受性イオンチャネル（一過性受容体電位バニロイドチャネル）の特定のクラスを活性化する。この段階では、これらのメカニズムはまだ同定されている更なる要素があるかどうかを実際に組み合わせる、またはどのように不明である。

出版物の少数の（参考文献^5,7-9） インビトロで INSを調査してきたが、この分野で公開され、作業の大部分は（ 例えば、参照^1,6,10-18） インビボで行われている。聴覚ニューロンの赤外線刺激は人工内耳^10,14-18の潜在的なアプリケーションに起因し、特に関心のある領域、となっています。 in vivoでの実験では様々な設定での技術、 試験管内試験ではによって与えられる制御の増加レベルメカのより詳細な理解につながることが期待されての有効性を検証することが重要である一方INSの責任anism。このレポートには、これらも聴覚系から既存データの大本体に連結しながら基本的なメカニズムを研究するために使用することができるように、パッチクランプ調査培養らせん神経節ニューロンの調製を記載する。

パッチクランプ法は、単一細胞における電気的活動を記録する手段を提供し、個々の基礎となる電流¹⁹の寄与を研究し、電気生理学的現象の調査のための優れたツールである。この技術は、例えば培養された螺旋神経節ニューロンの一次ニューロンのin vitroにおける安定調製に適用される場合には、深さが神経活性が制御され、操作されるメカニズムを研究する機会を提供する。

パッチクランプを通してらせん神経節ニューロンの電気的特性に及ぼすレーザー刺激の効果を調査するため、この作業のアウトライン法で指定されたプロトコルレコーディング。アプローチは、標準的な顕微鏡の構成を変更することなく安全な操作だけでなく、より簡単かつ再現性の配向を可能にする、ファイバ結合レーザではなく、自由空間レーザに基づいている。これらのプロトコルに基づいて、それがより明確にINSのメカニズムまたは機構を決定するために実験の広い範囲を行うことが可能であるべきである。

Protocol

1。らせん神経節ニューロンの文化

1. オートクレーブ内の小さな丸い（ 例えば直径10mm）カバーガラスと湾曲鉗子を滅菌。滅菌ピンセットを用いて、滅菌4リング35ミリメートルペトリ皿または4ウェルプレートの各ウェルに滅菌カバースリップを転送します。最大48時間までのためのインキュベーター（37℃）でカバースリップと場所の上面にポリ-L-オルニチン（500μgの/ ml）とマウスラミニン（0.01 mg / ml）で150μlのを適用します。カバースリップは井戸の底から離れて浮いていないことを確認してください。
2. 47.5ミリリットル神経細胞用基礎、0.5ミリリットルN ₂サプリメント、1ミリリットルB27サプリメント、0.5ミリリットルのL-グルタミン、および0.5 mlのペニシリン-ストレプトマイシン：各神経培養用の50ミリリットル滅菌神経細胞用基礎培地（NBM）を準備。注：サプリメントが凍結することができ、-20℃で保存し、必要な日に培地に添加。
3. 、前述の^20,21として産後4-7日のラットの仔から私たちをらせん神経節ニューロンを解離（0.025％トリプシンおよび0.001％DNアーゼI）酵素的および機械的なテクニックの両方をING。 Whitlon ら ²²とビエラら ²³を参照してください。 らせん神経節ニューロンの文化の詳細な手順については、またはパーカーら ²⁴蝸牛軸分離のデモンストレーションのために。
4. カバースリップから残っpoly-L-ornithine/laminin液を吸引し、NBMと簡潔に洗う。
5. インキュベーター（37℃、10％CO _2）にカバースリップと場所に解離らせん神経節ニューロンの懸濁液150-200μLを加える。注意：最大20カバーガラスには、8仔ラットの平均リターから調製することができる。
6. メッキニューロン4時間後には、細胞の破片を除去し、150から200μlを温め新鮮NBMと交換するための解決策を吸引。注：メディアは脱水症状を避けるために、毎日の補充が必要な場合があります。
7. 電気生理学的記録のために必要になるまでインキュベーターにカバースリップを返します。注：解離スパイラル神経節ニューロン培養物を4時間解離した後、二日後までのための電気生理学的実験のために使用することができる。 in vitroでの時間は、結果の分析時に考慮されるべきである。毎年24〜48時間をNBM補充。

2。パッチクランプ記録のための準備

1. 溶液を調製
   1. 細胞内（マイクロピペット）ソリューション：115 mMのK-グルコン酸、7のKCl、10mMのHEPES、0.05 mMのEGTA、2mMの_の Na ₂ ATP、2mMのMgATP、0.5mMの_の Na ₂ GTP（KOHでpH 7.3に調整し、295に合わせて調整ショ糖とミリオスモル/ kg）を。無菌フィルター（0.2ミクロン）を通してソリューションをパスし、記録の日まで-20℃で保存されるように200μlのアリコートに分ける。
   2. 外（風呂）ソリューション：137のNaCl、5 mMの塩化カリウム、2mMのCaCl ₂を、1のMgCl _2、10mMのHEPES、10 mMグルコース（NaOHでpH7.4に調整し、ショ糖と300から310ミリオスモル/ kgの調整） 。この溶液は、記録日に行われる。
2. MΩ2-6の抵抗で記録マイクロピペットを準備します。とホウケイ酸ガラス（1.0ミリメートル外径、0.58ミリメートル、内径、75ミリメートル長さ）、我々は、CO ₂レーザープラー（サターインスツルメンツP-2000）を使用します。
3. レーザーを準備します。このプロトコルは、オプトテックP / Lからそのような1870 nmの赤外線神経刺激としてファイバ結合レーザを使用するためのものです我々の実験では、光配信に使用される光ファイバの両端（AFWテクノロジーズMM1-FC2-200/220-5-Cで0.22の開口数で220分の200μmのコア/クラッド径シリカ繊維およびFC-PCコネクタです-0.22）。パッチコードは、2つのファイバピグテール（ すなわち一端にコネクタ接続や他で切断）を生成するために半分にカットされた。 Thompson らにより詳細に検討されたレーザ誘起温度変化のファイバーコア径と開口数の影響図²⁵
   1. 劈開標準的な技術を用いた光伝送ファイバの先端と結果の先端が光学顕微鏡（ すなわち先端が繊維軸に垂直で、ビジュアル検査時にフラットに表示されます）で観察することにより、高品質であることを確認してください。コネクタ（ 例えばソーラボADAFC2）を通じて適切なを使用して刺激レーザーのファイバー結合出力に光配信ファイバーを接続します。
   2. 適切な楽器（LM-3検出ヘッドと例えばコヒーレントFieldMateの）を使用して、光送達繊維の切断された先端から出力レーザパワーを測定します。これは、レーザパワーの光送達ファイバが切断されたり、かなりの調整が（ 例えば 、1研究室から別の輸送）レーザーに対して行われるたびにチェックすることをお勧めします。
   3. ファイバーチャックまたは同等のデバイスと貼る適切なマイクロポジショナーにチャックに光配信ファイバーを挿入します。正確には光ファイバがカバースリップとなす角度θを決定できることが重要である。このANGLeは実験装置の写真を撮影し、角度を得るために、画像処理ソフトウェア（ 例えば、ImageJの）を用いて測定することができる。特に顕微鏡 - 角度θ（または可能な角度の範囲）は、主に実験装置の空間的な限界によって制約されます。我々の実験ではθの典型的な値は、（正立顕微鏡に基づいて）36°の周り、しかし最適な角度（倒立顕微鏡を用いたものなど ）別のセットアップのために大きく異なる場合があります。
   4. レーザおよび図2に示すように、パッチクランプデータ取得システム（ 例えば Digidata 1440A、Molecular Devices社）との間の接続を行う。パッチクランプデータ収集システムからのデジタル出力は、それが可能なデータ収集システムの独立したレーザパルスパラメータを指定すること、外部ファンクション·ジェネレータを介してレーザに接続されるべきである。あるいは、この出力は、直接接続することができレーザドライバ（パルス長とデータ収集ソフトウェアによって設定される繰り返し率を必要とする）。いずれの場合も、レーザをトリガするために使用される信号は、レーザパルスのタイミング及び長さを電気生理学的信号を同時に記録することができることを保証するためにデータ収集システムの入力に接続する必要があります。

3。 INSの調査のためのパッチクランプ記録

1. 細胞外溶液で灌流システムの適切な容器を充填1〜2 ml /分の速度で浴の灌流を提供するために、流量を調整。我々は解決策の急速加熱、吸引によって使用済み溶液を除去するための蠕動ポンプを有効にするには、インラインヒーターで重力供給システム（アスピレーターボトル、ピンチバルブ、およびPE管）を使用します。
2. 正立顕微鏡の記録室（風呂）に培養細胞を用いたカバースリップを置きます。高倍率の水浸対物レンズ（Eを使用するg。40X）と位相差（ 例えば微分干渉コントラストやDodtグラデーションコントラスト）、視覚文化の中でらせん神経節ニューロンを見つけます。 図1aに示すように、典型的ならせん神経節ニューロンは、位相明るいラウンドと著名な核を持つ直径約15μmである。
3. ニューロンが配置されると、低倍率の対物レンズ（ 例えば 10倍）に切り替えて、視野内のターゲットニューロンを見つけます。
4. 次の手順を実行し（または同等）を使用して、所定の位置に光送達光ファイバを移動：
   1. 先端が水平方向と垂直面の両方でターゲットニューロンに近くなるまで、出力ファイバを移動するマイクロポジショナーを使用します。ファイバーチップの垂直位置は、対物レンズを上下に移動（フォーカス走査）によって確認することができる。
   2. 高倍率の対物レンズに戻り、Tの隣の意図された位置での光ファイバの先端を位置付ける彼ニューロン（ 図2挿入図参照）。繊維の垂直位置を調整するときに、それが繊維の下端は、繊維の位置の不確実性を最小化するために、カバースリップ（ すなわち、ちょうど触れる）上に載っていることが重要である。水平面内で最適なアライメントは繊維がカバースリップおよび繊維半径rとなす角度θに依存します。ターゲットニューロンの中心が繊維軸に沿って位置するようにファイバを位置決めするために、繊維の上縁と標的細胞との間の水平距離がなければならない
      Δ _{ターゲット} = R（cosecθ - 2罪θ）、
      どこに負の値は、光ファイバ張り出しセルことを示すことになる。ファイバを整列するとき、繊維の上端からニューロンの中心との間のΔ _{ターゲット}の距離は約目視検査によって達成することができる。しかしΔ _{ターゲットは}するように設計されて唯一の大まかなガイドラインとしての役割を果たす。繊維の上端とニューロンの中心間の実際の距離ΔはΔ _{ターゲット} （ 図1のように）から測定可能とは異なるような繊維を配置することの中心から両方の半径方向変位（ すなわちの効果への洞察を提供することができますターゲットニューロンに対する相対光のビーム）と軸方向変位（繊維軸に沿って、すなわち ）。典型的なマルチモードファイバのビームプロファイルを良くトップハット分布^26、局所的に吸収されるエネルギー（温度）の低下によって近似されるため、 すなわち、 -例えば、Δ設定≈0は、セルの近傍の局所温度を上昇させることが期待されるビームの中心からずれによる、セルに近いファイバ端面を移動させるから吸収されたエネルギーの増加に比べて最小である。
      注意は、正確かつ反復可能POなどの繊維を配置するために取られるべきであるが視覚的な手がかり、ターゲットニューロン（ 例えば Δ）に対してファイバー位置の正確な測定を使用してssibleは、所定の距離離れてそれを配置するよりも重要である。プロトコールのステップ3.8.2で説明したようにΔは、画像解析によって（±3μmの推定最大不確実性）を決定することができる。いくつかの実験^5,8においては、白色光源は、所望の細胞を標的とするために、ファイバを介して接続されている。このアプローチは、標的領域からの散乱光の強度は、これらの浅い角度（θ）で相対的に低かったように、正立顕微鏡の設定で効果がないことが判明した。
   3. 繊維が所定の位置になったら、マイクロピペットの簡単なポジショニングを可能にするために既知の量でそれを外に移動。繊維は、その後ニューラル記録が達成される元の位置に戻すことができる。
5. 細胞内液でマイクロピペットを記入し、しっかりと頭の上に、所定の位置に収まるアンプの田下（ 例えば Multiclamp 700B、Molecular Devices社）。微小電極ホルダーの側に取り付けられたチューブを使用して、マイクロピペットの詰まりを防止するために、正圧の少量を適用する。
6. マイクロマニピュレータを使用して、単にターゲットニューロン上の位置にマイクロピペットを移動します。
7. 全細胞記録のためのプロトコル：
   1. 10ミリ秒、アンプの電圧クランプモードで+10 mVの方形波パルス（ 例えばシールテスト）を適用し、0 nAのにベースライン信号のマイクロピペット電位（ピペットオフセット）を調整します。シールテストは、微小電極の抵抗値が所望の範囲（ - MΩ6 例 2）内にあるかどうかを決定するために使用されるべきである。
   2. 抵抗を監視しながら、静かにターゲットニューロンの表面にマイクロピペットを配置するマイクロマニピュレータの微調整を使用しています。マイクロピペットのニューロンに接触しているときに、抵抗（MΩ〜0.5〜1による）増加する。私mmediately抵抗増加に続いて、正の流体圧力を取り除き、小さな負圧を適用する。一度抵抗が10に合格しています- 20MΩ、保持レベル（-60 mVの周りなど ）に膜電位固定してください。
   3. 電極抵抗は、効果的なシールが（ 'ギガシール'と呼ばれる）は、細胞膜とマイクロピペットとの間に形成されていることを示す、1GΩを超えるまで増加し続けなければならない。この時点で、マイクロピペットからすべての流体圧力を取り除く。
   4. ギガシールが形成された後、短い電流パルス（25〜100マイクロ秒、+1 V）を使用するか、または破壊細胞膜に負の流体圧の簡単なパルスを、全セル構成を実現する。
   5. 膜容量、直列抵抗とシールテストパルス中の電流に取り付けられた指数曲線から決定された入力抵抗を記録する。その後、スイッチポートと、アンプのCpFastとCpSlowコントロールを調整することにより、静電容量のトランジェントを最小化hは全細胞モードにアンプ、フラット現在までの容量や抵抗を補償は、シール試験中に観測される。フラット試験シール応答を維持するために容量や抵抗制御を調整する。直列抵抗補償（70％〜70％予測補正）を適用する。
   6. アンプに電流クランプモードに切り替えます。静止膜電位（電流注入がない場合）に注意してください。希望のレベル（ 例えば -60 mVの）で膜電位を安定させる保持電流を設定します。ピペット容量を中和し、電圧降下のバランスをとるために、ブリッジバランスを調整する。
   7. （; 300ミリ秒持続+10 pAのステップで10から200 Pa）の現在の脱分極で刺激することによって、ニューロンの発火特性を確認してください。
8. 1. ニューロンの隣の位置に光ファイババックを移動します。 CCDカメラに結合されたイメージングソフトウェアを使用して、ターゲット神経に対する繊維の位置の画像をキャプチャnは、最初にニューロンの面に焦点を当て、その後、光ファイバの上端にある（ 図1を参照）。
   2. 得られた画像のその後の分析（ 例えば、 図1bおよび図1c）によってそれを正確Δ（目標ニューロンの中心に光ファイバ相対の上縁の位置）を決定することができる。一度Δが知られている、そのようなファイバ端面からターゲットニューロン（繊維軸に沿って）z及びビームδrの中心からのニューロンの半径方向変位との距離などのパラメータは、単純な三角法関係を用いて計算することができる。
      Z = R罪2θ+ΔCOSθ
      δ はr =（（R COS2θ - Δ罪^{θ）2 +ΔY2）1/2、}
      ΔYがファイバ軸と上方から見たニューロンの中心との間の距離である（ 例えば、それ自体eは図1）。
      これらの位置パラメータの正確な知識が刺激プロセス²⁵の間で可能な違いを解決するために必要になることがありますように分析は、細胞から細胞へのアカウントの位置のばらつきを考慮すべきである。

4。 INS実験

1. 電流クランプまたは電圧クランプ構成のいずれかで電気生理学的データを記録しながら、必要なパラメータ（ 例えば電力、パルス長、繰り返し率など）で刺激レーザーを実行します。我々のレーザで、光パワーは、レーザドライバへの直接入力を介して制御され、各記録前に手動で指定されている。パルス長及び繰り返し率は、外部信号発生器またはデータ収集ソフト（ステップ2.3.4を参照）のいずれかによって制御することができる。データはパッチクランプチャンネルとレーザートリガチャンネルの両方から記録されていることを確認します。

及ぶ長さのレーザーパルス周りに500マイクロ秒〜15ミリ秒、パルス当たり約0.25から5 mJののエネルギーから、一般的に測定可能な電気的な応答が得られます。それは、このパラメータの影響を最小限にするため、1ヘルツ以下となるようにレーザパルスの繰り返し率を設定すると、最初の実験のために有用であり得る。記録された信号の変化を示す典型的な結果は、次の節に示されている。

Representative Results

らせん神経節ニューロンは、電圧クランプと電流クランプ記録構成の両方で再現性のある波形のレーザー照射に応答します。 図3aは、2.5ミリ、0.8 mJのレーザーパルス（6から平均応答に応じて、細胞膜を横切る電流の流れの典型的な変化を示している-70 mVで、-60 mVで、-50 mVで開催された膜電位と1秒間隔で繰り返しレーザーパルス、）。ネット内向き電流が一貫した照明が停止した後に初期値に戻って、レーザパルスに応答して誘発される。レーザー誘起電流の形状は、それがINSの基礎となるプロセスの完全な理解を得るために、保持電位の範囲で実験を行うことが重要であり得ることを示す、膜電位を変化させて変化させることが分かる。これらの実験は、現在のプロトコルのマイナーな変更を加えて実施し、例えば、電荷電圧（QV）分析（それ自体として確立された技術を用いて分析することができるin vitroでの INSから得QV曲線の例については、電子文献^7）。

図3bに示されたデータは、典型的には2.5ミリ秒、0.8 mJのレーザーパルス（初期膜電位-73mV、4ヘルツの繰返し速度で送達16レーザパルスにわたって平均）により誘発される膜電位の変化を示している。電流クランプ記録はパルスの後静止膜電位に向かっておよそ指数関数的減少が続いてレーザーパルスの経過とともに着実な膜の脱分極を示す。 図3bの例では、レーザーパルスに続く小さな追加の膜の脱分極を示す。シャピロら ^7は、膜電位のレーザー誘起変化が密接に局所的な温度変化（ すなわち、細胞の直接近傍の温度）に関連していることが示された。さらに、モデルは、Thompson らによって記載図²⁷特定の整列条件の下で、照射領域における軸方向及び半径方向の温度勾配に起因する拡散が密接図3bに示すように膜電位の変化に類似している局所的な温度変動につながる可能性があると判断した。これらの知見の結果、光伝送ファイバの端面に対する標的細胞の位置は、膜電位のレーザー誘発変化の時間経過及び最高温度の両方を決定する上で重要な役割を果たすと考えられているセルの範囲である。

過剰なエネルギーや温度が大幅に増加への暴露に照射すると、ターゲットニューロンに損​​傷を与える可能性があります。これはしばしば（急激な安定したレベルに膜電位を維持するのに必要な電流の増加、および/ ​​または信号内のノイズや不安定性の大幅な増加など ）、セルの電気的特性の劣化を介して観察することができる。極端な場合にはさんの細胞死は、レーザー露光によりほぼ瞬時に発生します。 図4に 25ミリ、8 mJのレーザーパルスへの曝露に起因するらせん神経節ニューロンの死の電圧クランプ記録を示しています。

図1。典型的ならせん神経節ニューロンと光刺激実験中の光ファイバとマイクロピペット（上から見て）の相対的な位置を示す位相コントラスト像）典型的ならせん神経節ニューロン。b）の位置での光ファイバ（画像が上に焦点を当てている。繊維の上端が少しセルすなわち Δに張り出していることは否定的である）：光ファイバの端）c）のオーバーレイ画像は、セル（音符に対する相対繊維位置を示す。上述したように、δyおよび＆デルから見TA、繊維軸からニューロン中心の半径方向変位は、それぞれのニューロンの中心繊維の上端からの距離である。矢印は、らせん神経節ニューロンの位置を示す。スケールバーは20μm。

図2。 。標的細胞に対する相対光ファイバと微小電極の位置：光刺激実験のための実験（スケールしないように）挿入図の概略図 。 θ、Δ及びZは、プロトコルステップ3.4.2と3.8.2で定義されています。

図3。）電圧クランプ（6レーザパルスdeliveのからの平均応答1ヘルツの割合で赤）とb）は電流クランプ（4ヘルツの割合で繰り返される16のレーザパルスから平均応答）録音膜におけるレーザー誘起変化2.5ミリ秒による照明時の電流と膜電位を示すらせん神経節ニューロンから、0.8 mJのレーザーパルス。影付きの領域は、レーザー露光のタイミングを示す。挿入図は、より詳細にレーザー照射時の応答を示す。注）の挿入が-60 mVのの膜電位を用いて得られたトレースに焦点を当てています。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

図4過度に高エネルギー（25ミリ秒、8 mJの）レーザパルスへの曝露に起因する細胞死を示す電圧クランプ録音。の振幅があることに注意してください信号はnAのに示され、 図3に示すようにpAの電流よりもかなり大きくなっている。

Discussion

本論文で概説プロトコルを使用すると、それは抽出して文化らせん神経節ニューロンと全細胞パッチクランプ実験を行うことにより、レーザー誘発電気的活動を調査することが可能である。 インビトロで使用される場合、パッチクランプ法は、 インビボでは達成できない実験パラメータの制御のレベルを提供する。このような波長、パルスエネルギー、パルス長、パルス形状、及びパルス反復配列としてのレーザ刺激パラメータは、再現可能な設定で研究することができる。加えて、神経細胞が維持されている環境（ 例えば、溶液温度、化学的因子）は系統的ことで膜特性、したがって赤外線神経刺激のメカニズムを研究すること、変えることができる。電気および光刺激モダリティ間の相互作用はまた、制御された方法で調査することができる。これらの基本的な研究は、フロリダ州を導入することにより、さらに高度なことができますそのようなイオンの濃度又は熱ショックタンパク質の発現などの追加のパラメータを監視するuorescentプローブ。これらの種々のパラメータの明確な理解は、現象の完全な理解を達成するだけでなく、プロセスの最適化を介して、より効率的な刺激を達成するためにのみ重要ではない。

^5-7 INS機構内の温度が重要な役割を果たしているため、レーザ照射による局所的な加熱の正確な測定は、このメカニズム^27を画定で極めて重要である。オープンパッチピペットを流れる電流を記録することによって較正された温度測定値を求める具体的な方法は、ヤオらによって記載されている^。28と多数の著者によって用い、それらの環境を表すにおけるレーザ誘起温度変化の大きさと時間経過を決定するために（ 例えば参考資料^7,8参照） ^を in vitroで発見した。提供するdは、光伝送ファイバの位置が正確に決定することができる（現在のプロトコルを用いる）、温度測定のこの方法は、典型的なINS刺激による温度の局所的な変化の正確なマッピングを可能にする可能性がある。

励起レーザの波長は、レーザ誘起温度変化が（したがって、INSの根底にある機序）水⁷の波長依存性の吸収特性（参照Thompson らによって媒介されるため、INS実験において考慮されるべきパラメータである^。25用予想される波長効果の詳細な議論）。これとは別にプロトコル（赤外線神経刺激装置、オプトテックP / L）、波長及びレーザ·パッケージの様々な使用1,870 nmのダイオードレーザから他の著者によって使用されている。既存のINSの出版物で使用されるレーザーのいくつかの一般的な例は以下のとおりです。1,840-1,940 nmの^6,7,10,13至る波長Aculightからダイオードレーザー^、16-18;ホルミウム：レーザー1-2-3 ^{6,11,12,14,15}からYAGレーザ（2.12μm）であり、1,875 nmの^5,8で動作するダイオードレーザー、1,470 nmの^{8、Sheaumann}から1,535 nmの⁸レーザー。

培養された螺旋神経節ニューロンにこの技術を適用することの潜在的な欠点は、記録電極を直接レーザーによって照射され、ニューロンの比較的小さなサイズ（〜10-15μmの直径）へのおかげである。これは、特定の閾値を超えたレーザー照射は、記録回路^7（ すなわち、シールおよびピペット抵抗）の特性を変更することができることが示唆されている。シャピロら ^7は、レーザパワーが増大したとして3の閾値mJのパルスエネルギーを求める、QV曲線の逆転電位の変化を監視することによって、このしきい値を測定した。別のアプローチとしては、重量でシールおよびピペットの合成抵抗を測定することによって、この効果の大きさを決定することが可能であるホールセルモード（10ミリ秒、+10 mVの電圧パルスに対する電流応答を記録することによって）細胞外液の温度を変化させながら。完全にINSのメカニズムを理解するためには、レーザ誘起抵抗変化を測定して考慮することが不可欠である。

赤外線神経刺激は、生体内で行われてきたに関する実験研究の大半は今日まで。 in vivoでの赤外線刺激のための報告された放射露光量のしきい値は、（ラット坐骨神経^1、スナネズミ聴覚神経のため1.855μmの¹⁸時<0.1 JCM ^-2用2.12ミクロンで例えば 0.32 JCM ^-2）若干異なりますが、彼 ​​らはを通じて決定しきい値よりも大幅に低くなっていますin vitro試験 （ 例えばマウスの網膜神経節細胞とラット前庭神経節細胞のための1.875μmの^5,8、ラット新生児cardiomy用^-2 8.3 Jセンチで約20 JCM ^-2cytes ^9）。この段階でINS処理の詳細を十分よく、この差の原因を推測するものと理解されず、しかし、そのような密接にin vivoでの作業の前の目標似ている聴覚神経細胞などのin vitroモデルにおいて使用して説明を見つけることに有利で ​​あり得る。

in vitroモデルの他の一部は、シャピロらによって使用されるアフリカツメガエル卵母細胞（〜直径1mm）のようなより大きなセルを含む^。7これらの細胞成分の影響を受けているかどうかを調べるために、個々のセルの両端INSの有効性の空間変化をプロービングするために有用であり得る刺激による。このような脂質二重層小胞などの単純なモデルでは、in vitroの実験に比べて実験パラメータ上でもより正確な制御を可能にすることができる、しかし、そのようなモデルはやや範囲が限定されており、INSの完全な複雑さを明らかにしないことがあります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips	Lomb Scientific	CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish	VWR International	82050-542
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957
Laminin	Invitrogen	23017-015
Curved forceps	WPI	14101	Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator	ThermoScientific	Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A	Gibco	10888-022
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-148
L-Glutamine	Invitrogen	25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Potassium D-gluconate	Sigma-Aldrich	G4500
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
Potassium hydroxide	LabServ	BSPPL738.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	310166
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	383147
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sodium hydroxide	LabServ	BSPSL740.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope	Zeiss	AxioExaminerD1	Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective	Zeiss	W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage	ThorLabs	Burleigh Gibraltar
Recording chamber	Warner Instruments	RC-26G
Vibration isolation table	TMC	Micro-g 63-532
CCD Camera	Diagnostic Instruments	RT1200
Camera software	Diagnostic Instruments	SPOT Basic
In-line solution heater	Warner	SH-27B
Temperature controller	Warner	TC-324B
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Micropipette glass	Sutter Instruments	GBF100-58-15	Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P2000
Recording Software	AxoGraph		Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle	Sigma-Aldrich	CLS12201L	1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing	Harvard	PolyE #340
Masterflex peristaltic pump	Cole-Parmer	HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode	Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC)	AFW Technologies	MM1-FC2-200/220-5-C-0.22	Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC)	Thorlabs	ADAFC2
Optical fiber cleaver	EREM	FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm)	Siemens		For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm)	Siemens		For removing outer coating of patch cord
Signal generator			Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner			Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck	Newport	FPH-DJ
Laser power meter and detector head	Coherent	FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.