Summary
وقد اقترح تحفيز العصب تحت الحمراء كبديل للالتحفيز الكهربائي في مجموعة من أنواع العصبية، بما في ذلك تلك المرتبطة بالنظام السمعي. يصف هذا البروتوكول طريقة المشبك التصحيح لدراسة آلية تحفيز العصب الأشعة تحت الحمراء في ثقافة من الخلايا العصبية السمعية الأولية.
Abstract
وقد ثبت في السنوات الأخيرة أن نابض، ضوء ليزر الأشعة تحت الحمراء يمكن استخدامها لانتزاع استجابات الكهربائية في الأنسجة العصبية، مستقلة عن أي تعديل آخر على النسيج المستهدف. تم الإبلاغ عن التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء في مجموعة متنوعة من الأنسجة العصبية الطرفية الحسية في الجسم الحي و، باهتمام خاص هو مبين في تحفيز الخلايا العصبية في العصب السمعي. ومع ذلك، في حين لم تظهر INS للعمل في هذه الأماكن، الآلية (أو الآليات) التي ضوء الأشعة تحت الحمراء يسبب الإثارة العصبية حاليا ليست مفهومة جيدا. بروتوكول المعروضة هنا يصف التصحيح خلية كاملة طريقة المشبك مصممة لتسهيل التحقيق في التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء في مثقف الخلايا العصبية السمعية الأولية. بواسطة تميز بدقة استجابة هذه الخلايا إلى إضاءة ليزر الأشعة تحت الحمراء في المختبر تحت ظروف خاضعة للرقابة، قد يكون من الممكن للحصول على فهم أفضل للفيزيكا الأساسيةL والعمليات الكيميائية الحيوية التي تقوم عليها التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء.
Introduction
مجالات الفسيولوجيا العصبية والطبية البيولوجية الالكترونية تعتمد بشكل كبير على التقنيات التي تسمح التحفيز يمكن السيطرة عليها من الاستجابات الكهربائية في الأنسجة العصبية. بينما التحفيز الكهربائي لا يزال المعيار الذهبي في الإثارة العصبية، أنها تعاني من عدد من السلبيات مثل وجود القطع الأثرية التحفيز عند تسجيل الاستجابات العصبية، وعدم وجود خصوصية التحفيز نظرا لانتشار الحالية إلى الأنسجة المحيطة 1.
شهدت خلال العقدين الماضيين تطوير بصريا تقنيات التحفيز بوساطة 2. العديد من هذه التقنيات تتطلب التعديل من الأنسجة المستهدفة، إما عن طريق إضافة جزيء معين (على سبيل المثال الجزيئات في قفص) 3 أو شكلا من أشكال التلاعب الجيني (على سبيل المثال optogenetics) 4، لا من التي من السهل أن يطبق خارج إعداد البحوث. ذات أهمية خاصة لذلك هو التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء (INS)، wherebهو متحمس Y الأنسجة العصبية بواسطة نابض ضوء الليزر تحت الحمراء. INS لديه القدرة على التغلب على كثير من أوجه القصور في التحفيز الكهربائي من خلال تمكين محددة للغاية، والتحفيز وعدم الاتصال من الأنسجة العصبية 2. ومع ذلك، فإنه بينما ثبت INS بنجاح في مجموعة متنوعة من إعدادات في الجسم الحي، وآلية دقيقة من الإثارة لا يزال غير مؤكد.
وقد أظهرت بعض المنشورات الحديثة التقدم نحو كشف آلية وراء INS 5-7. التسخين السريع بسبب امتصاص ضوء الليزر من قبل الماء ويبدو أن تلعب دورا رئيسيا. ومع ذلك، وراء هذا الإجماع لم يتحقق بعد. شابيرو وآخرون. 7 اقتراح آلية عامة للغاية حيث يسبب التسخين السريع اضطراب في توزيع الجسيمات المشحونة المتاخمة لغشاء الخلية، مما يؤدي إلى تغيير في السعة من غشاء الخلية والاستقطاب اللاحقة. وبالإضافة إلى ذلك، ألبرت وآخرون. 5 يؤكدون أن عالج بالليزرR الناجم عن التدفئة ينشط فئة معينة من درجة الحرارة القنوات الأيونية الحساسة (مستقبلات عابر قنوات الأنانداميد المحتملة)، والسماح لتمرير الأيونات عبر غشاء الخلية. في هذه المرحلة ليس واضحا كيف الجمع بين هذه الآليات، أو في الواقع ما إذا كانت هناك عدة عوامل أخرى لا يزال يتعين تحديدها.
على الرغم من أن عدد قليل من المطبوعات (المراجع 5،7-9) حققت INS في المختبر، وقد تم تنفيذ الغالبية العظمى من الأعمال المنشورة في هذا المجال في الجسم الحي (مثل المراجع 1،6،10-18). وقد تم تحفيز الأشعة تحت الحمراء من الخلايا العصبية السمعية وهي منطقة ذات أهمية خاصة، نظرا لالتطبيقات المحتملة في زراعة قوقعة 10،14-18. بينما في التجارب المجراة مهمة للتحقق من فعالية هذه التقنية في مختلف البيئات، وزيادة مستوى الرقابة التي يوفرها في الدراسات المختبرية ومن المتوقع أن يؤدي إلى فهم أكثر تفصيلا للالميكانيكيةanism المسؤولة عن INS. يصف هذا التقرير إعداد الخلايا العصبية مثقف العقدة الحلزونية للتحقيقات المشبك التصحيح، وهذه يمكن استخدامها لدراسة آليات الأساسية في سياق ربط أيضا إلى مجموعة كبيرة من البيانات الموجودة في الجهاز السمعي.
تقنية المشبك التصحيح هو أداة ممتازة لتحقيقات من الظواهر الكهربية، وتوفير وسيلة لتسجيل النشاط الكهربائي في الخلايا واحد ودراسة مساهمة التيارات الكامنة الفردية 19. عندما يتم تطبيق هذه التقنية لمستقر في إعداد المختبر من الخلايا العصبية الأولية، مثل الخلايا العصبية مثقف العقدة الحلزونية، فإنه يوفر الفرصة للدراسة في عمق الآليات التي يتم التحكم النشاط العصبي والتلاعب بها.
البروتوكولات المحددة في هذا العمل أساليب مخطط للتحقيق في تأثير التحفيز الليزر على الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية العقدة الحلزونية من خلال التصحيح المشبكالتسجيلات. ويستند هذا النهج على الليزر الألياف الديناميكي بدلا من الليزر في الفضاء الحر، مما يسمح بتشغيل أكثر أمنا وكذلك أسهل وأكثر تكرار المواءمة دون الحاجة إلى تعديل تكوين المجهر القياسية. على أساس من هذه البروتوكولات، وينبغي أن يكون من الممكن إجراء مجموعة واسعة من التجارب من أجل تحديد أكثر وضوحا الآلية أو الآليات وراء INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ثقافة من الخلايا العصبية العقدة الحلزونية
- تعقيم جولة صغيرة (مثل 10 مم) coverslips الزجاج وملقط المنحني في الأوتوكلاف. نقل coverslips على تعقيمها في الآبار الفردية العقيمة 4 حلقة 35 مم طبق بتري أو لوحة 4 بشكل جيد، وذلك باستخدام ملقط معقم. تطبيق 150 ميكرولتر من بولي-L-الأورنيثين (500 ميكروغرام / مل)، والماوس laminin (0.01 ملغ / مل) على السطح العلوي للساترة ومكان في حاضنة (37 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 48 ساعة. تأكد من أن coverslips على لا تطفو بعيدا عن قاع البئر.
- تحضير 50 مل سائل الإعلام Neurobasal العقيمة (مصرف مولدوفا الوطني) لكل ثقافة العصبية: 47.5 مل neurobasal A، 0.5 مل N 2 الملحق، 1 مل B27 الملحق، 0.5 مل L-الجلوتامين، و 0.5 مل البنسلين، الستربتوميسين. ملاحظة: يمكن تجميد ملاحق، وتخزينها في -20 درجة مئوية، وأضاف أن وسائل الإعلام في اليوم المطلوب.
- فصل الخلايا العصبية العقدة دوامة من بعد الولادة اليوم 4-7 الفئران الوليدة كما هو موضح سابقا 20،21، لناجي على حد سواء الأنزيمية (0.025٪ التربسين و 0.001٪ الدناز I) والتقنيات الميكانيكية. الرجوع إلى Whitlon وآخرون. 22 وفييرا وآخرون. 23 لإجراءات تفصيلية من دوامة العقدة ثقافة العصبية، أو باركر وآخرون 24 لمظاهرة من العزلة عماد القوقعة.
- نضح أي حل poly-L-ornithine/laminin المتبقية من coverslips على وتغسل لفترة وجيزة مع مصرف مولدوفا الوطني.
- إضافة 150-200 ميكرولتر من العقدة الحلزونية فصل الخلايا العصبية التعليق على coverslips على ومكان في حاضنة (37 درجة مئوية، و 10٪ CO 2). ملاحظة: يمكن إعداد ما يصل إلى 20 coverslips على من متوسط القمامة من 8 الفئران الوليدة.
- بعد أربع ساعات الخلايا العصبية والطلاء، ونضح الحل لإزالة الحطام الخلية واستبدالها مع 150-200 ميكرولتر NBM الطازجة تحسنت. ملاحظة: قد تتطلب وسائل الاعلام التجديد اليومي لتجنب الجفاف.
- عودة إلى coverslips على الحاضنة حتى المطلوبة للتسجيلات الكهربية. ملاحظة: دوامة نأتالثقافات الخلايا العصبية العقدة يمكن استخدامها لتجارب الكهربية بعد أربع ساعات وتفارق لمدة تصل إلى يومين بعد ذلك. ينبغي أن تؤخذ وقت في المختبر بعين الاعتبار خلال تحليل النتائج. تجديد مصرف مولدوفا الوطني كل 24-48 ساعة.
2. التحضير للتسجيلات المشبك التصحيح
- إعداد الحلول
- داخل الخلايا (micropipette) الحل: 115 ملم K-غلوكونات، 7 ملم بوكل، 10 HEPES ملي، 0.05 ملم EGTA، 2 ملي نا 2 ATP، 2 مم MgATP، 0.5 ملي نا 2 GTP (ضبط درجة الحموضة إلى 7.3 مع KOH؛ ضبط إلى 295 mOsmol / كغ مع السكروز). تمرير حل من خلال مرشح العقيمة (0.2 ميكرون) وتقسم إلى 200 ميكرولتر مأخوذة ليتم تخزينها في -20 درجة مئوية حتى يوم تسجيل.
- خارج الخلية (حمام) الحل: 137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 2 مم CaCl 2، 1 ملم MgCl 2، 10 HEPES ملي و 10 ملي الجلوكوز (ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم؛ التكيف مع 300-310 mOsmol / كغ مع السكروز) . يرصد هذا الحل في يوم التسجيل.
- إعداد بال micropipettes تسجيل مع المقاومة من 2-6 MΩ. ونحن نستخدم CO 2 الليزر ساحبة (P-2000؛ الادوات سوتر) والبورسليكات الزجاج (1.0 مم القطر الخارجي؛ 0.58 مم القطر الداخلي و 75 مم طول).
- إعداد الليزر. ويهدف هذا البروتوكول للاستخدام مع الألياف يقترن الليزر، مثل 1،870 نانومتر الأشعة تحت الحمراء محفز العصب من OptoTech P / L. الألياف الضوئية المستخدمة للتسليم في ضوء تجاربنا هو 200/220 ميكرون الأساسية / الكسوة قطر الألياف السيليكا مع الفتحة العددية من 0.22 والموصلات FC-PC عند كلا الطرفين (AFW تقنيات MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). وقطعت الحبال التصحيح في نصف لإنتاج نوعين من أسلاك التوصيل المصنوعة من الألياف (أي connectorized في نهاية واحدة والمشقوق في الطرف الآخر). وقد نوقشت آثار الألياف الأساسية قطرها والفتحة العددية على الليزر التغيرات في درجات الحرارة التي يسببها بالتفصيل من قبل طومسون وآخرون. 25
- يلتصق غيض من الألياف تسليم الضوء باستخدام التقنيات القياسيةوتأكد من أن الرأس الناتج هو من نوعية عالية عن طريق الملاحظة مع المجهر الضوئي (أي طرف يجب أن يكون عمودي على محور الألياف وتظهر مسطحة على الفحص البصري). توصيل الألياف تسليم ضوء لإخراج الألياف الديناميكي ليزر التحفيز باستخدام المناسبة من خلال موصل (مثل Thorlabs ADAFC2).
- قياس قوة الليزر الإخراج من طرف المشقوق من الألياف تسليم الضوء باستخدام أداة مناسبة (مثل FieldMate متماسك مع LM-3 كاشف الرأس). فمن المستحسن للتحقق من قوة الليزر في كل مرة يتم المشقوق الألياف تسليم ضوء أو يتم إجراء تعديل كبير ليزر (مثل النقل من مختبر واحد إلى آخر).
- إدراج ضوء الألياف التسليم في ظرف الألياف أو جهاز ما يعادلها ويضعوا تشاك لmicropositioner المناسبة. من المهم أن تكون قادرا على تحديد دقيق لزاوية θ أن الألياف البصرية يجعل مع ساترة. هذا ANGLويمكن قياس ه عن طريق أخذ صورة فوتوغرافية للترتيب التجريبية واستخدام برامج معالجة الصور (مثل يماغيج) للحصول على زاوية. زاوية θ (أو مجموعة من الزوايا الممكنة) مقيدة في المقام الأول عن طريق القيود المكانية للترتيب التجريبية - ولا سيما المجهر. القيم النموذجية من θ في تجاربنا (على أساس المجهر تستقيم) هي حوالي 36 درجة مئوية، إلا أن أفضل زاوية قد تختلف اختلافا كبيرا عن الاجهزة البديلة (مثل تلك التي تستخدم مجهر مقلوب).
- إجراء اتصالات بين الليزر ونظام الحصول على البيانات المشبك التصحيح (على سبيل المثال Digidata 1440A، الأجهزة الجزيئية) كما هو مبين في الشكل 2. يجب أن تكون متصلا الإخراج الرقمي من المشبك نظام الحصول على البيانات التصحيح إلى ليزر عن طريق مولد وظيفة خارجية، مما يجعل من الممكن تحديد معلمات نبضة ليزر مستقلة عن نظام الحصول على البيانات. وبدلا من هذا الناتج يمكن ان تكون مرتبطة مباشرة إلىالسائق الليزر (التي تتطلب طول النبض ومعدل التكرار سيتم تعيينه من قبل البرنامج الحصول على البيانات). في كلتا الحالتين، إشارة تستخدم لتحريك الليزر يجب أن تكون متصلا العودة الى مدخلا لنظام الحصول على البيانات للتأكد من أن توقيت وطول نبضات الليزر يمكن تسجيلها بالتزامن مع إشارة الكهربية.
3. تسجيلات المشبك التصحيح لمباحث من INS
- ملء الحاويات المناسبة لنظام نضح مع حل خارج الخلية وضبط معدل تدفق لتوفير نضح من الحمام بمعدل 1-2 مل / دقيقة. ونحن نستخدم بالجاذبية نظام (زجاجة الشافطة، صمام قرصة، وأنابيب PE) مع سخان في خط لتمكين التسخين السريع من الحل، ومضخة تحوي لإزالة حل قضى عن طريق الشفط.
- وضع ساترة مع الخلايا المستزرعة في غرفة تسجيل (حمام) من المجهر تستقيم. باستخدام التكبير عالية الهدف الغمر بالمياه (هز. 40X) وعلى النقيض من المرحلة (مثل الفرق المقابل تدخل أو Dodt النقيض التدرج)، حدد موقع بصريا الخلايا العصبية العقدة الحلزونية داخل الثقافة. نموذجي دوامة الخلايا العصبية العقدة هي مرحلة مشرق، جولة، وحوالي 15 ميكرون في القطر مع نواة بارزة، كما هو مبين في الشكل 1A.
- مرة واحدة وقد يقع على الخلايا العصبية، والتحول إلى هدف التكبير أدنى (مثل 10X) وتحديد موقع الخلايا العصبية المستهدفة في المجال البصري.
- نقل الألياف البصرية ضوء التسليم في موضعه باستخدام الإجراء التالي (أو ما يعادلها):
- استخدام micropositioner لتحريك الألياف الانتاج حتى غيض على مقربة من الخلايا العصبية المستهدفة في كل من الطائرات الأفقية والعمودية. يمكن التحقق من الوضع الرأسي من غيض من الألياف عن طريق تحريك الهدف صعودا وهبوطا (مسح التركيز).
- التبديل إلى هدف تضخم عالية ووضع غيض من الألياف البصرية في موقفها المقصود بجانب روقال انه الخلايا العصبية (انظر الشكل 2 الشكل). عند ضبط الوضع الرأسي من الألياف، فمن المهم أن الحافة السفلى من الألياف يوضع على (أي مجرد لمس) ساترة، للحد من عدم اليقين في الموقع من الألياف. سوف محاذاة الأمثل في المستوى الأفقي تعتمد على زاوية θ أن الألياف يجعل مع ساترة ونصف قطر R الألياف. من أجل وضع الألياف بحيث أن مركز الخلايا العصبية المستهدفة تقع على طول محور الألياف، وينبغي أن المسافة الأفقية بين الحافة العلوية من الألياف والخلايا المستهدفة هي
Δ الهدف = R (cosec θ - θ 2 الخطيئة)،
حيث القيم السلبية من شأنه أن يشير إلى أن يتدلى الألياف الضوئية الخلية. عند محاذاة الألياف، وعلى مسافة Δ الهدف بين الحافة العلوية من الألياف ومركز الخلايا العصبية يمكن أن يتحقق تقريبا عن طريق التفتيش البصري. ومع ذلك تم تصميم Δ الهدف إلىبمثابة المبدأ التوجيهي الخام فقط. يمكن تحديد المواقع على الألياف مثل أن المسافة الفعلية Δ بين الحافة العلوية من الألياف ومركز الخلايا العصبية يختلف بشكل ملموس من Δ الهدف (كما في الشكل 1) توفير نظرة ثاقبة على تأثير كل من التشرد شعاعي (أي من وسط شعاع) ومحوري النزوح (أي على طول محور الألياف) من الحزم نسبة إلى الخلايا العصبية المستهدفة. على سبيل المثال، وضع Δ ≈ 0 ومن المتوقع أن زيادة درجة الحرارة المحلية في المنطقة المجاورة للخلية - أي منذ الشخصي شعاع للألياف المتعدد نموذجية ويقترب بشكل جيد من قبل توزيع قبعة 26، وانخفاض في الطاقة الممتصة محليا (درجة الحرارة) بسبب النزوح من مركز شعاع هو الحد الأدنى بالمقارنة مع الزيادة في الطاقة الممتصة من تحريك الوجه نهاية الألياف أقرب إلى الخلية.
في حين ينبغي الحرص على وضع الألياف بدقة وrepeatably كما صssible باستخدام الإشارات البصرية، قياس دقيق للموقع الألياف بالنسبة إلى الهدف الخلايا العصبية (مثل Δ) هو أكثر أهمية من تحديد المواقع على مسافة محددة سلفا بعيدا. Δ يمكن تحديد (مع أقصى قدر من عدم اليقين المقدرة ± 3 ميكرون) من خلال تحليل الصور كما هو موضح في الخطوة 3.8.2 من البروتوكول. في بعض التجارب 5،8، وقد اقترن مصادر الضوء الأبيض من خلال الألياف من أجل استهداف الخلايا المطلوبة. تم العثور على هذا النهج إلى أن تكون غير فعالة في الإعداد المجهر تستقيم، كما كان شدة الضوء المتناثرة من المنطقة المستهدفة منخفضة نسبيا في هذه الزوايا الضحلة (θ). - وبمجرد أن الألياف هو في الموقف، وتحريكه بها كمية المعروف لتمكين تحديد المواقع مباشرة من micropipette. ويمكن بعد ذلك عاد الألياف إلى وضعه الأصلي عندما يتم التوصل إلى تسجيل العصبية.
- ملء micropipette مع حل داخل الخلايا ويصلح في مكان آمن على رؤوسالمئوية من مكبر للصوت (على سبيل المثال Multiclamp 700B، الأجهزة الجزيئية). باستخدام أنابيب موصولة إلى جانب حامل مسرى مكروي، تنطبق على كمية صغيرة من الضغط الايجابي لمنع انسداد من micropipette.
- باستخدام مياداة مجهرية، حرك micropipette في موقف فقط فوق الخلايا العصبية المستهدفة.
- بروتوكول للتسجيلات خلية كاملة:
- تطبيق 10 ميللي ثانية، +10 بالسيارات مربع موجة النبض (على سبيل المثال اختبار الختم) في وضع الجهد المشبك من مكبر للصوت وضبط المحتملة micropipette (ماصة الأوفست) للإشارة إلى خط الأساس 0 NA. وينبغي أيضا اختبار ختم استخدامها لتحديد ما إذا كانت المقاومة من مسرى مكروي هو ضمن النطاق المطلوب (على سبيل المثال 2-6 MΩ).
- في حين رصد المقاومة، واستخدام التعديلات غرامة من مياداة مجهرية لوضع بلطف micropipette على سطح الخلايا العصبية المستهدفة. عندما micropipette في اتصال مع الخلايا العصبية، وزيادة مقاومة (من قبل ~ 0،5-1 MΩ). أنابعد mmediately زيادة المقاومة، وإزالة ضغط السائل إيجابية وتطبيق الضغط السلبي الصغيرة. مرة واحدة وقد مرت المقاومة 10-20 MΩ، إصلاح غشاء المحتملة إلى مستوى عقد (على سبيل المثال حوالي -60 بالسيارات).
- ينبغي أن تستمر المقاومة الكهربائي لزيادة حتى أنه يتجاوز 1 GΩ، مما يدل على أن ختم فعالة (وهو ما يسمى 'gigaseal') وقد تم تشكيل بين غشاء الخلية وmicropipette. في هذه المرحلة، وإزالة كل ضغط السائل من micropipette.
- مرة واحدة وقد تم تشكيل gigaseal، استخدم البقول الحالية قصيرة (25-100 μsec؛ +1 V) أو نبضات قصيرة من ضغط السائل السلبية إلى تمزق غشاء الخلية وتحقيق تكوين خلية كاملة.
- تسجيل السعة الغشاء، سلسلة المقاومة والمقاومة الإدخال كما هو محدد من منحنى أسي تركيبها على التيار أثناء الاختبار نبض الختم. التقليل من السعة العابرين عن طريق ضبط الضوابط CpFast وCpSlow على مكبر للصوت، ثم switcويلاحظ ح مكبر للصوت في وضع خلية كاملة، وتعويض السعة والمقاومة حتى تيار شقة أثناء الاختبار ختم. تطبيق سلسلة المقاومة التعويض (~ تصحيح 70٪؛ التنبؤ 70٪)، وتعديل الضوابط السعة والمقاومة للحفاظ على اختبار شقة استجابة الختم.
- التبديل إلى الوضع الحالي، المشبك في مكبر للصوت. يحيط علما غشاء المحتملة يستريح (في حالة عدم وجود الحقن الحالية). تعيين الحالية عقد لتحقيق الاستقرار في غشاء المحتملة على المستوى المطلوب (على سبيل المثال -60 بالسيارات). تحييد السعة ماصة وضبط توازن جسر لتحقيق التوازن بين انخفاض الجهد.
- تحقق من خصائص إطلاق الخلايا العصبية من خلال تحفيز إزالة إستقطاب مع الحالي (10-200 السلطة الفلسطينية في +10 خطوات السلطة الفلسطينية؛ 300 ميللي ثانية مدتها).
- نقل مرة أخرى الألياف البصرية إلى موقف المقبل إلى الخلايا العصبية. باستخدام برامج التصوير بالإضافة إلى كاميرا CCD، والتقاط الصور للموقف من الألياف فيما يتعلق العصبية المستهدفةن، مع التركيز على الطائرة من الخلايا العصبية في البداية، ومن ثم على الحافة العلوية من الألياف الضوئية (انظر الشكل 1).
- من خلال تحليل لاحقة من الصور الناتجة (على سبيل المثال أرقام 1B و 1C) فمن الممكن ان يحدد بدقة Δ (موقف الحافة العلوية من النسبية الألياف البصرية إلى مركز الخلايا العصبية المستهدفة). مرة واحدة ومن المعروف Δ، معلمات مثل المسافة من على وجه نهاية الألياف إلى الخلايا العصبية المستهدفة (على طول محور الألياف) Z وتشريد شعاعي من الخلايا العصبية من مركز شعاع δ R يمكن حسابها باستخدام العلاقات المثلثية بسيطة:
Z = R + Δ الخطيئة 2θ COS θ
δ R = ((ص كوس 2θ - Δ θ الخطيئة) 2 + δy 2) 1/2،
حيث δy هي المسافة بين محور الألياف ومركز الخلايا العصبية كما يرى من أعلاه (على سبيل المثال SEه الشكل 1).
التحليل ينبغي أن تأخذ في الاعتبار الاختلافات الموضعية من خلية إلى أخرى، ما قد يلزم معرفة دقيقة من هذه المعلمات الموقع إلى حل الخلافات المحتملة بين عمليات التحفيز 25.
4. تجارب INS
- في حين تم تسجيل البيانات الكهربية في إما المشبك الحالية أو تكوينات المشبك الجهد، وتشغيل الليزر في تحفيز المعلمات المطلوب (على سبيل المثال الطاقة، طول النبض، ومعدل تكرار الخ). مع الليزر لدينا، يتم التحكم في الطاقة الضوئية عن طريق المساهمة المباشرة للسائق ليزر ويتم تحديد يدويا قبل كل تسجيل. يمكن التحكم طول النبض ومعدل تكرار إما عن طريق مولد إشارة خارجية أو البرنامج الحصول على البيانات (كما هو موضح في الخطوة 2.3.4). ضمان أن يتم تسجيل البيانات من كل من قناة المشبك التصحيح وقناة الزناد الليزر.
نبضات الليزر بأطوال تتراوحمن حوالي 500 μsec إلى 15 ميللي ثانية وطاقات ~ ،25-5 ميغا جول في النبضة عادة تسفر الردود الكهربائية قابلة للقياس. تحديد معدل تكرار نبضات الليزر أن يكون 1 هرتز أو أقل قد تكون مفيدة للالتجارب الأولية، لأنه سوف تقليل من آثار هذه المعلمة. يتم عرض النتائج نموذجي يبين التغيير في الإشارات المسجلة في القسم التالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلايا العصبية العقدة الحلزونية الرد على الليزر الإضاءة مع تكرار الطول الموجي في كلا الجهد المشبك وتكوينات تسجيل الجاري المشبك. يبين الشكل 3A تغييرات نموذجية في تدفق التيار عبر غشاء الخلية استجابة ل2.5 ميللي ثانية، 0.8 ميغا جول ليزر النبض (متوسط استجابة من 6 نبضات الليزر، وكرر في 1 ثانية فترات) مع غشاء المحتملة التي عقدت في -70 بالسيارات، -60 بالسيارات و-50 بالسيارات. وأثار صافي التيارات الداخل باستمرار استجابة لنبضات الليزر، والعودة إلى القيم الأولية بعد توقف الإضاءة. شكل التيارات المستحثة بالليزر ويمكن رؤية أن تختلف كما يتم تغيير غشاء المحتملة، مشيرا إلى أنه قد يكون من المهم إجراء تجارب على مجموعة من عقد الإمكانيات من أجل الحصول على فهم كامل للعمليات التي يقوم INS. ويمكن إجراء هذه التجارب خارجا مع تعديلات طفيفة على البروتوكول الحالي وتحليلها باستخدام تقنيات راسخة مثل تهمة الجهد (QV) التحليل (SEه مرجع 7 للحصول على أمثلة من المنحنيات QV تم الحصول عليها من دائرة الهجرة والتجنيس في المختبر).
البيانات المعروضة في الشكل 3B تدل على تغير في غشاء المحتملة أثار عادة من قبل 2.5 ميللي ثانية، 0.8 ميغا جول ليزر النبض (غشاء الأولية المحتملة، 73mV، بمعدل متوسط أعلى من 16 نبضات الليزر تسليمها بمعدل تكرار 4 هرتز). تظهر التسجيلات الحالية المشبك على الاستقطاب غشاء ثابت على مدى نبضة ليزر يعقبه انخفاض الأسي ما يقرب من نحو غشاء المحتملة يستريح بعد النبض. على سبيل المثال في الشكل 3B أيضا يسلك الاستقطاب غشاء إضافية صغيرة بعد نبضة ليزر. شابيرو وآخرون أظهرت 7 أن التغيرات التي يسببها الليزر في غشاء المحتملة ترتبط ارتباطا وثيقا مع التغيرات المحلية في درجة الحرارة (أي درجة الحرارة في المنطقة المجاورة مباشرة للخلية). وعلاوة على ذلك، فإن النموذج التي وصفها طومسون وآخرون. 27قرر أنه في ظل ظروف معينة المحاذاة، نشر الناتجة عن التدرجات درجة الحرارة محوري وشعاعي في المنطقة مضيئة يمكن أن يؤدي إلى تغيرات درجة الحرارة المحلية تشبه إلى حد كبير التغيرات في غشاء المحتملة هو مبين في الشكل 3B. ونتيجة لهذه النتائج، ويعتقد أن موضع الخلية المستهدفة بالنسبة للوجه نهاية الألياف تسليم ضوء يلعب دورا هاما في تحديد كل من مدار الساعة من الاختلافات الليزر أثار في غشاء المحتملة والحد الأقصى لدرجة الحرارة في المنطقة من الخلية.
إلقاء الضوء مع الطاقة الزائدة أو التعرض لزيادات كبيرة في درجات الحرارة قد يؤدي إلى تلف الخلايا العصبية المستهدفة. كثيرا ما يمكن لاحظت هذا من خلال تدهور الخواص الكهربائية الخلية (مثل زيادة مفاجئة في التيار المطلوب للحفاظ على غشاء المحتملة عند مستوى ثابت، و / أو زيادة كبيرة في الضوضاء وعدم الاستقرار داخل إشارة). في الحالة القصوىيحدث موت الخلايا و على الفور تقريبا عند التعرض ليزر. ويبين الشكل 4 تسجيل الجهد المشبك وفاة الخلايا العصبية العقدة دوامة الناجمة عن التعرض ل25 ميللي ثانية، 8 ميغا جول ليزر النبض.
الشكل 1. على النقيض من الصور تظهر مرحلة نموذجية دوامة الخلايا العصبية العقدية والأوضاع النسبية للألياف البصرية وmicropipette (كما يرى من أعلاه) خلال التجارب التحفيز البصري. أ) العقدة الحلزونية نموذجي الخلايا العصبية. ب) الألياف البصرية في موقف (وتركز الصورة على أعلى حافة الألياف البصرية) ج) مضافين الصور التي تبين موقف الألياف النسبي للخلية (ملاحظة: الحافة العلوية من الألياف هو الذي يخيم قليلا الخلية أي Δ هو سلبي). كما يرى من أعلاه، Y δ وو دلتا؛ هي التشرد شعاعي من مركز الخلايا العصبية من محور الألياف والمسافة من الحافة العلوية من الألياف إلى مركز من الخلايا العصبية على التوالي. تبين الأسهم الموقف من الخلايا العصبية العقدة الحلزونية. أشرطة النطاق 20 ميكرون.
الشكل 2. التخطيطي من الإعداد التجريبية للتجارب التحفيز البصري (وليس إلى نطاق و) أقحم: موقف الألياف البصرية ومسرى مكروي نسبة إلى الخلية المستهدفة. θ، Δ و z هي على النحو المحدد في بروتوكول خطوات 3.4.2 و 3.8.2.
الشكل (3). أ) الجهد المشبك (متوسط استجابة من 6 نبضات الليزر delive فيأحمر بمعدل 1 هرتز) وب) الحالية، المشبك (متوسط استجابة من 16 نبضات الليزر تتكرر بمعدل 4 هرتز) تسجيلات من الخلايا العصبية العقدة الحلزونية تظهر التغييرات التي يسببها الليزر في غشاء المحتملة الحالية وغشاء على الإضاءة من قبل 2.5 ميللي ثانية ، 0.8 ميغا جول ليزر النبض. المناطق المظللة تشير إلى توقيت التعرض الليزر. إدراجات تظهر الاستجابات خلال إضاءة ليزر في مزيد من التفاصيل. ملاحظة: أقحم في أ) يركز على التتبع التي تم الحصول عليها مع غشاء المحتملة من -60 بالسيارات. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 4. تسجيل الجهد المشبك يظهر موت الخلايا الناتجة عن التعرض للنشيط بشكل مفرط (25 ميللي ثانية، 8 ميغا جول) ليزر النبض. لاحظ أن اتساعيظهر إشارة في نا وأكبر بكثير من التيارات السلطة الفلسطينية هو موضح في الشكل 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام البروتوكولات المذكورة في هذه الورقة أنه من الممكن استخراج والثقافة دوامة الخلايا العصبية العقدية والتحقيق الليزر أثار النشاط الكهربائي قبل تنفيذ كامل الخلية التصحيح التجارب المشبك. عندما تستخدم في المختبر، ويوفر تقنية المشبك التصحيح مستوى من السيطرة على المعلمات التجريبية التي ليست قابلة للتحقيق في الجسم الحي. المعلمات التحفيز ليزر مثل الطول الموجي، نبض الطاقة، طول النبض، وشكل نبض، ونبض تسلسل التكرار يمكن دراستها في إطار استنساخه. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للبيئة التي يتم فيها الحفاظ على الخلايا العصبية (مثل درجة حرارة المحلول، والعوامل الكيميائية) أن تختلف بشكل منهجي، مما يجعل من الممكن لدراسة خصائص الغشاء، وبالتالي الآليات الكامنة وراء التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء. ويمكن أيضا التفاعل بين طرائق التحفيز الكهربائي والبصرية يتم التحقيق في الطريقة التي تسيطر عليها. ويمكن لهذه الدراسات الأساسية تكون أكثر تقدما عن طريق إدخال FLتحقيقات uorescent لرصد معلمات إضافية مثل تركيزات أيونية أو التعبير عن بروتينات الصدمة الحرارية. هناك فهم واضح من هذه المعلمات المختلفة ليست حرجة الوحيد لتحقيق فهم كامل لهذه الظاهرة، ولكن أيضا لتحقيق التحفيز أكثر كفاءة من خلال عملية التحسين.
ونظرا لأهمية الدور الذي تلعبه درجة الحرارة في آلية INS 5-7، قياس دقيق للتدفئة المترجمة نظرا لإضاءة الليزر هو من أهمية قصوى في تحديد هذه الآلية 27. وقد وصفت طريقة مفصلة للحصول على قياسات درجات الحرارة معايرة من خلال تسجيل الحالية التي تتدفق من خلال ماصة التصحيح مفتوحة من قبل ياو وآخرون. 28 ويعمل بها من قبل العديد من الكتاب، لتحديد حجم ومدار الساعة من الليزر التغيرات في درجات الحرارة المستحثة في بيئات ممثل تلك وجدت في المختبر (على سبيل المثال انظر المراجع 7، 8). تزودد موقف الألياف تسليم الضوء يمكن أن تحدد بدقة (على سبيل المثال باستخدام بروتوكول الحالية)، وهذه الطريقة من قياس درجة الحرارة من المرجح أن تمكين تعيين دقيق للتغير في درجة الحرارة المحلية بسبب المحفزات INS نموذجي.
الطول الموجي لليزر تحفيز معلمة التي ينبغي النظر فيها في التجارب INS، حيث يتم بوساطة الليزر التي يسببها التغيرات في درجات الحرارة (وبالتالي آليات الكامنة وراء INS) من الطول الموجي خصائص امتصاص الماء تعتمد من 7 (انظر طومسون وآخرون. ل25 مناقشة تفصيلية للآثار الطول الموجي المتوقعة). وبصرف النظر عن 1،870 نانومتر ليزر ديود المستخدمة في هذا البروتوكول (الأشعة تحت الحمراء العصب محفز، Optotech P / L)، ومجموعة متنوعة من الأطوال الموجية وحزم الليزر التي استخدمت من قبل مؤلفين آخرين. بعض الأمثلة الشائعة من الليزر المستخدمة في منشورات INS القائمة هي: ليزر ديود من Aculight مع أطوال موجية تتراوح بين 1،840-1،940 نانومتر 6،7،10،13،16-18؛ هولميوم: YAG الليزر (2.12 ميكرون) من ليزر 1-2-3 6،11،12،14،15؛ والليزر الصمام الثنائي العاملة في 1،875 نانومتر 5،8، 1،470 نانومتر 8، و1،535 نانومتر 8 من Sheaumann الليزر.
A العيب المحتملة لتطبيق هذه التقنية لمثقف الخلايا العصبية العقدة الحلزونية هو أنه نظرا لحجم صغير نسبيا من الخلايا العصبية (~ 10-15 ميكرومتر في القطر)، يضيء القطب تسجيل مباشرة بواسطة الليزر. وقد اقترح أن إضاءة الليزر يتجاوز عتبة معينة قد تتغير خصائص الدائرة تسجيل 7 (أي ختم والمقاومة ماصة). شابيرو وآخرون قياس. 7 هذه العتبة من خلال رصد التغير في إمكانية عكس منحنيات QV كما تم زيادة قوة الليزر، وإيجاد عتبة طاقة نبض من 3 ميغا جول. كنهج بديل، فإنه قد يكون من الممكن تحديد حجم هذا التأثير عن طريق قياس المقاومة المشتركة للختم وماصة في ثوضع الخلية حفرة (على سبيل المثال عن طريق تسجيل استجابة الحالي إلى 10 ميللي ثانية، +10 بالسيارات الجهد نبض)، في حين تتراوح درجة الحرارة من الحل خارج الخلية. من أجل فهم كامل للآليات INS، فمن الأهمية بمكان أن الليزر التي يسببها التغييرات المقاومة تقاس وأخذها بعين الاعتبار.
حتى الآن معظم العمل التجريبي المتعلق اضطلع التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء في الجسم الحي. في حين ذكرت عتبات التعرض مشع لتحفيز الأشعة تحت الحمراء في الجسم الحي تختلف نوعا ما (على سبيل المثال 0.32 جشم -2 في 2.12 ميكرون لالفئران الأعصاب الوركي 1، <0.1 جشم -2 في 1.855 ميكرون للأعصاب السمع يربوع 18)، فهي أقل بكثير من عتبات تحديدها من خلال في الدراسات المختبرية (على سبيل المثال حوالي 20 جشم -2 في 1.875 ميكرون لخلايا الشبكية العقدة الماوس وخلايا العقدة الدهليزية الفئران 5،8، 8.3 J سم -2 لالفئران حديثي الولادة cardiomycytes 9). في هذه المرحلة على تفاصيل عملية INS ليست مفهومة بشكل جيد بما فيه الكفاية لالتكهن حول سبب هذا الاختلاف، ومع ذلك، باستخدام نماذج في المختبر مثل الخلايا العصبية السمعية التي تشبه أهداف السابقة في العمل المجراة قد يكون من المفيد في إيجاد تفسير .
بعض أخرى نماذج في المختبر تنطوي الخلايا الكبيرة مثل البويضات القيطم (~ 1 ملم قطر) المستخدمة من قبل شابيرو وآخرون. قد يكون 7 هذه مفيدة لبحث الاختلافات المكانية في فعالية INS عبر الخلايا الفردية من أجل التحقيق في ما إذا كانت تتأثر المكونات الخلوية بواسطة التحفيز. نماذج أبسط مثل حويصلات طبقة ثنائية المادة الدهنية قد تسمح السيطرة حتى أكثر دقة من المعلمات التجريبية في التجارب المختبرية، ولكن مثل هذه النماذج محدودة نوعا ما في نطاقها، وربما لا تكشف عن مدى تعقيد كامل من INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأسترالي تحت ربط مشروع المنحة LP120100264.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. | |||
References
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al.
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T.
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscience. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. Optical Waveguide Theory. , Chapman and Hall. (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
