Whole Cell Patch Clamp för att undersöka mekanismer Infraröd nervstimulering

Summary

Infraröd nervstimulering har föreslagits som ett alternativ till elektrisk stimulering i en rad nerv slag, inbegripet sådana som sammanhänger med hörselsystemet. Detta protokoll beskriver en metod patch clamp för att studera mekanismen av infraröd nervstimulering i en kultur av primära auditiva neuroner.

Abstract

Det har visats under senare år att pulsad, infraröd laser ljus kan användas för att framkalla elektriska svar i neural vävnad, oberoende av någon ytterligare modifiering av målvävnaden. Infraröd neural stimulering har rapporterats i ett flertal perifert och sensorisk neural vävnad in vivo, med särskilt intresse visas i stimulering av nervceller i hörselnerven. Men medan INS har visat sig fungera i dessa inställningar, är mekanismen (eller mekanismer) genom vilken infrarött ljus orsakar neural excitation tillfället inte väl förstådd. Protokollet presenteras här beskriver en hel cell metod patch clamp utformad för att underlätta utredningen av infraröd neural stimulering i odlade primära hörselneuronerna. Genom att noggrant karakterisera svaret av dessa celler till infraröd laser belysning in vitro under kontrollerade förhållanden, kan det vara möjligt att få en bättre förståelse av den fundamentala physical och biokemiska processer som ligger bakom infraröd neural stimulering.

Introduction

Områdena neurofysiologi och medicinsk bionics starkt beroende av teknik som möjliggör kontrollerbar stimulering av elektriska svar i nervvävnad. Medan elektrisk stimulering förblir guldmyntfoten i neural excitation, lider den av ett antal nackdelar, såsom förekomsten av stimulans artefakter vid inspelning neurala reaktioner, och brist på stimulans specificitet på grund av spridningen av strömmen till omgivande vävnad ^1.

De senaste två decennierna har utvecklingen av optiskt medierade stimulering tekniker ^2. Flera av dessa tekniker kräver modifiering av målvävnaden, antingen genom tillsats av en särskild molekyl (t.ex. caged molekyler) ³ eller någon form av genetisk manipulation (t.ex. optogenetics) ^4, varken som är lätta att tillämpa utanför en forskninginställning. Av särskilt intresse är därför infraröd neural stimulering (INS), whereby nervvävnad exciteras av pulsad infraröd laser ljus. INS har potential att övervinna många av bristerna i elektrisk stimulering genom att möjliggöra mycket specifika, icke-kontakt stimulering av nervvävnad ^2. Men medan INS har framgångsrikt visat i en mängd olika inställningar i vivo, förblir den exakta mekanismen för excitation osäker.

Några aktuella publikationer har visat framsteg mot att upptäcka mekanismen bakom INS ^5-7. Snabb uppvärmning på grund av absorption av laserljuset av vatten verkar spela en nyckelroll. Men utöver detta konsensus är ännu inte uppnått. Shapiro et al. ⁷ föreslå en mycket generell mekanism varigenom snabb uppvärmning orsakar en störning i fördelningen av laddade partiklar angränsande till cellmembranet, vilket leder till en ändring av kapacitansen av cellmembranet och efterföljande depolarisation. Dessutom Albert et al. ⁵ hävda att laser inducerad uppvärmning aktiverar en specifik klass av temperaturkänsliga jonkanaler (transient receptor potential vanilloid kanaler), så att joner att passera genom cellmembranet. I detta skede är det oklart hur dessa mekanismer kombineras, eller om huruvida det finns ytterligare faktorer som ännu inte identifierats.

Även om ett litet antal publikationer (referenser ^5,7-9) har undersökt INS in vitro, har den stora majoriteten av arbetet publiceras i detta område utförts in vivo (t.ex. referenser ^1,6,10-18). Infraröd stimulering av hörselneuronerna har varit ett område av särskilt intresse på grund av de potentiella tillämpningar inom cochleaimplantat ^10,14-18. Medan in vivo-experiment är viktigt att kontrollera effektiviteten av tekniken i olika miljöer, den ökade nivån av kontroll följer av in vitro-studier förväntas leda till en mer detaljerad förståelse av mechningsmekanismen ansvarar för INS. Denna rapport beskriver framställningen av odlade nervceller spiral ganglion för utredningar patch clamp, eftersom dessa kan användas för att studera grundläggande mekanismer och samtidigt länka till den stora kroppen av befintliga data från hörselsystemet.

Plåstret clamp-tekniken är ett utmärkt verktyg för undersökningar av elektrofysiologiska fenomen, skapar en möjlighet att registrera den elektriska aktiviteten i enstaka celler och studera bidraget för de enskilda underliggande strömmarna ^19. När denna teknik används på ett stabilt in vitro framställning av primära neuroner, såsom odlade nervceller spiral ganglion, det ger möjlighet att studera på djupet genom vilka mekanismer neural aktivitet kontrolleras och manipuleras.

Protokollen i detta arbetssätt disposition för att undersöka effekten av laser stimulering på de elektriska egenskaperna hos nervceller spiral ganglion via patch clampinspelningar. Systemet är baserat på en fiber-kopplad laser snarare än ett fritt utrymme laser, vilket säkrare drift samt enklare och mer repeterbar anpassning utan behovet att ändra standard mikroskop konfigurationen. På grundval av dessa protokoll, bör det vara möjligt att genomföra en mängd olika experiment för att tydligare fastställa mekanismen eller mekanismerna bakom INS.

Protocol

Ett. Kultur av nervceller spiral ganglion

1. Sterilisera små runda (t.ex. 10 mm diameter) täckglas glas och böjda pincett i en autoklav. Överför de steriliserade täckglas i enskilda brunnar i en steril 4-ring 35 mm petriskål eller 4-brunnar, med hjälp av de steriliserade pincett. Applicera 150 pl av poly-L-ornitin (500 | ig / ml) och mus-laminin (0,01 mg / ml) till den övre ytan av täckglas och placera i en inkubator (37 ° C) i upp till 48 timmar. Se till att täckglasen inte flyter bort från botten av brunnen.
2. Bered 50 ml sterila Neurobasal media (NBM) för varje neural kultur: 47,5 ml Neurobasal A, 0,5 ml N ₂ komplettera, 1 ml B27 tillskott, 0,5 ml L-glutamin, och 0,5 ml penicillin-streptomycin. Obs: Kosttillskott kan frysas, förvaras vid -20 ° C och sattes till mediet på önskad dag.
3. Dissociera nervceller spiral ganglion från postnatala dag 4-7 råttungar som tidigare beskrivits ^20,21, usning både enzymatisk (0,025% trypsin och 0,001% DNas I) och mekaniska metoder. Se Whitlon et al. ²² och Vieira et al. ²³ för detaljerade förfarandena i spiral ganglion neuron kultur, eller Parker et al. ²⁴ för en demonstration av Modiolus isolering.
4. Sug kvarvarande poly-L-ornithine/laminin lösning från täckglas och tvätta kort med NBM.
5. Lägg 150-200 pl av den dissocierade spiral ganglion neuron suspensionen till täckglasen och placera i en inkubator (37 ° C, 10% _CO2). Anmärkning: Upp till 20 täckglas kan framställas från en genomsnittlig kull av 8 råttungar.
6. Fyra timmar efter plätering nervceller, aspirera lösningen för att avlägsna celldebris och ersätta med 150-200 pl uppvärmda färsk NBM. Obs: media kan kräva daglig påfyllning för att undvika uttorkning.
7. Återgå täckglas till inkubatorn tills krävs för elektrofysiologiska inspelningar. Obs: dissocierade spiralganglion neuron kulturer kan användas för elektrofysiologiska experiment fyra timmar efter dissociation och i upp till två dagar därefter. Time in vitro bör beaktas vid analysen av resultaten. Replenish NBM varje 24-48 timmar.

2. Förberedelse för Patch Clamp Inspelningar

1. Bered lösningar
   1. Intracellular (mikropipett) lösning: 115 mM K-glukonat, 7 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,05 mM EGTA, 2 mM Na ₂ ATP, 2 mM MgATP, 0,5 mM Na ₂ GTP (justera till pH 7,3 med KOH, justera till 295 mosmol / kg med sackaros). Passera lösningen genom ett sterilt filter (0,2 pm) och dela upp i 200 | il alikvoter ska förvaras vid -20 ° C tills dagen för inspelningen.
   2. Extracellulär (bad) lösning: 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM _CaCl2, 1 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glukos (justera till pH 7,4 med NaOH, justera till 300-310 mOsmol / kg med sackaros) . Denna lösning gjordes på dagen av inspelningen.
2. Förbered inspelning mikropipetter med en resistans av 2-6 MQ. Vi använder en CO ₂ laser avdragare (P-2000, Sutter Instruments) och borosilikatglas (1,0 mm ytterdiameter, 0,58 mm innerdiameter, 75 mm längd).
3. Förbered lasern. Detta protokoll är avsedd att användas med en fiber-kopplad laser, till exempel 1870 nm Infraröd nervstimulator från OptoTech P / L. Den optiska fiber som används för ljus leverans i våra experiment är en 200/220 um kärna / mantel diameter kiseldioxidfiber med en numerisk apertur på 0,22 och FC-PC-kontakter i båda ändar (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). De korskopplingskablar skars på mitten för att producera två fiber pigtails (dvs. connectorized i ena änden och spjälkas vid den andra). Effekterna av fiberkärna diameter och numeriska bländaröppningen på laserinducerad temperaturförändringar har diskuterats i detalj av Thompson et al. ²⁵
   1. Cleave spetsen på ljus leverans fiber med användning av standardteknikeroch se till att den resulterande tips är av hög kvalitet genom observation med ett optiskt mikroskop (dvs. spetsen bör vara vinkelrätt mot fiberns axel och verkar platt vid visuell besiktning). Anslut ljuset leverans fiber till fiber-kopplad utgång stimulering laser med hjälp av en lämplig genom kontakt (t.ex. Thorlabs ADAFC2).
   2. Mät uteffekten laser från den kluvna spets ljus leverans fiber med ett lämpligt instrument (t.ex. sammanhållen FieldMate med LM-3 detektorhuvud). Det rekommenderas att kontrollera laserns effekt varje gång ljuset leverans fibern klyvs eller en betydande justering görs till lasern (t.ex. transport från ett laboratorium till ett annat).
   3. Sätt ljus leverans fiber till en fiber chuck eller likvärdig anordning och anbringa chucken till lämplig micropositioner. Det är viktigt att kunna noggrant bestämma vinkeln θ att den optiska fibern bildar med täckglas. Denna angle kan mätas genom att ta ett fotografi av den experimentella arrangemang och använda bildbehandlingsprogram (t.ex. ImageJ) för att erhålla vinkeln. Vinkeln θ (eller intervall av möjliga vinklar) är i första hand begränsas av rumsliga begränsningar av den experimentella arrangemanget - i synnerhet mikroskopet. Typiska värden på θ i våra experiment (baserat på en upprätt mikroskop) är runt 36 °, men den optimala vinkeln kan variera avsevärt för alternativa uppställningar (t.ex. de med ett inverterat mikroskop).
   4. Utför anslutningarna mellan lasern och plåstret uppgifter clamp förvärv systemet (t.ex. Digidata 1440A, Molecular Devices) såsom visas i fig. 2. Den digitala utsignalen från patch clamp datainsamlingssystemet bör vara ansluten till lasern via en extern funktion generator, vilket gör det möjligt att specificera laser pulsparametrar oberoende av datainsamlingssystemet. Alternativt denna utgång kan anslutas direkt tilllaserdrivenheten (kräver pulslängd och upprepningar som skall fastställas av datainsamling programvara). I båda fallen bör den signal som används för att trigga lasern kopplas tillbaka till en ingång till datainsamlingssystemet att säkerställa att tidsplanen och längden på laserpulser kan spelas in samtidigt med elektrofysiologiska signalen.

Tre. Patch Clamp Inspelningar för undersökning av INS

1. Fyll lämplig behållare av perfusionssystemet med extracellulär lösning och justera flödet för att tillhandahålla perfusion av badet med en hastighet av 1-2 ml / min. Vi använder en tyngdkraftssystemet (aspirator flaska, klämventilen, och PE-slang) med en in-line varmare för att möjliggöra snabb uppvärmning av lösningen, och en peristaltisk pump för avlägsnande av förbrukad lösning genom sugning.
2. Placera ett täckglas med odlade celler in i inspelningen kammaren (bad) i en upprätt mikroskop. Använda en hög förstoring vatten-nedsänkning mål (e. G.. 40X) och fas-kontrast (t.ex. differential interferens kontrast eller Dodt lutning kontrast), visuellt lokalisera nervceller spiral ganglion inom kulturen. En typisk spiral ganglion neuron är fas-ljusa, runda och ca 15 ^ m i diameter med en framträdande kärna, såsom visas i figur 1a.
3. När en neuron har lokaliserats, byta till en lägre förstoring mål (t.ex. 10X) och lokalisera målet neuron inom synfältet.
4. Flytta ljus leverans optiska fibern på plats med hjälp av följande procedur (eller motsvarande):
   1. Använd micropositioner att flytta utgångsfiber tills spetsen är nära målet neuron i både de horisontella och vertikala planen. Det vertikala läget av fibern spetsen kan verifieras genom att flytta målet uppåt och nedåt (avsökning av fokus).
   2. Växla tillbaka till den höga förstoringen målet och placera spetsen på optisk fiber i sitt avsedda läge intill than neuron (se figur 2 infälld). När du justerar den vertikala positionen av fibern, är det viktigt att den nedre kanten av fibern vilar på (dvs. bara röra) täckglaset, för att minimera osäkerheten i placeringen av fibern. Optimal anpassning i horisontalplanet beror på vinkeln θ att fibern gör med täckglas och radien för fibern r.. För att positionera fibern så att mitten av målet neuron ligger längs fiberaxeln, bör det horisontella avståndet mellan den övre kanten av fibern och målcellen vara
      Δ _target = r (COSEC θ - 2 sin θ),
      där negativa värden skulle indikera att den optiska fibern överhäng cellen. Vid inriktning av fibern, kan ett avstånd av Δ _mål mellan den övre kanten av fibern och centrum av neuron vara approximativt uppnås genom visuell inspektion. Emellertid Δ _målet är utformad för atttjäna som en ungefärlig riktlinje. Placering av fiber så att det faktiska avståndet Δ mellan den övre kanten av fibern och centrum av neuron skiljer mätbart från Δ _mål (som i figur 1) kan ge insikt i effekten av både radiell förskjutning (dvs från mitten av stråle) och axiell förskjutning (dvs. längs fiberaxeln) av balken relativt målet neuron. Till exempel ställer Δ ≈ 0 kan förväntas öka den lokala temperaturen i närheten av cellen - dvs eftersom strålen profil för typiska multimodfibrer är väl approximeras med en hög hatt fördelning ^26, minskningen i lokalt absorberad energi (temperatur) på grund av förskjutning från mitten av balken är minimal jämfört med den ökade absorberad energi från att röra ansiktet fiberänden närmare till cellen.
      Medan försiktighet bör vidtas för att positionera fibern så noggrant och repeterbart som possible använda visuella ledtrådar, exakt mätning av fiberns läge i förhållande till målet neuron (t.ex. Δ) är av större betydelse än att placera det ett förutbestämt avstånd. Δ kan bestämmas (uppskattad maximal osäkerhet på ± 3 nm) genom bildanalys som beskrivs i steg 3.8.2 i protokollet. I vissa experiment ^5,8, har vita ljuskällor har kopplat genom fiber för att rikta den önskade cellen. Denna metod visade sig vara ineffektiva i upprätt mikroskop setup, som intensiteten av ljus som sprids från målet regionen var relativt lågt på dessa grunda vinklar (θ).
   3. När fibern är i position, flytta ut från en känd mängd för att möjliggöra enkel positionering av mikropipetten. Fibern kan sedan återföras till den ursprungliga positionen när en neural inspelning uppnås.
5. Fyll mikropipett med intracellulära lösning och säkert passa in plats på huvudenaTage av förstärkaren (t.ex. Multiclamp 700B, Molecular Devices). Använda slang fäst vid sidan av mikroelektrod hållaren, applicera en liten mängd av positivt tryck för att förhindra igensättning av mikropipett.
6. Med hjälp av en mikromanipulator, flytta mikropipett i läge strax över målet neuron.
7. Protokoll för hela cellen inspelningar:
   1. Applicera en 10 ms, 10 mV fyrkantpuls (t.ex. Seal Test) i spänning-clamp läget på förstärkaren och justera mikropipett potential (pipett förskjutning) av baslinjen signalen till 0 nA. Tätningen Testet bör också användas för att bestämma om resistansen hos mikroelektrod är inom det önskade området (t.ex. 2-6 MQ).
   2. Under övervakning av resistansen, använda finjustering av mikromanipulator för att försiktigt placera mikropipett på ytan av målet neuron. När mikropipett är i kontakt med neuronen, kommer motståndet öka (med ~ 0,5 till 1 MQ). Jagmmediately efter motståndet ökar, ta bort den positiva vätsketryck och applicera en liten undertryck. När motståndet har passerat 10 - 20 Mohm, fixera membranet potential till en anläggning nivå (t.ex. runt -60 mV).
   3. Elektroden motstånd bör fortsätta att öka tills det överstiger 1 GΩ, vilket innebär att en effektiv tätning (kallas "gigatätning ') har bildats mellan cellmembranet och mikropipett. Vid denna punkt, ta bort allt vätsketryck från mikropipetten.
   4. När gigatätning har bildats, använda korta strömpulser (25 till 100 ^ sek, 1 V) eller korta pulser av negativ fluidtryck till bristning cellmembranet och uppnå helcells konfiguration.
   5. Anteckna membranet kapacitans, serieresistans och ingångsresistans som bestämdes från den exponentiella kurvan monterad på strömmen under tätningen testpulsen. Minimera kapacitans transienter genom att justera CpFast och CpSlow kontrollerna på förstärkaren, då switch förstärkaren till helcells-läge, och kompensera kapacitans och motstånd tills en platt ström observeras under tätningen testet. Ansök ersättning serieresistans (~ 70% korrigering, 70% förutsägelse), justering kapacitans och motstånd kontroller för att bibehålla en platt respons godkännandemärke.
   6. Växla till aktuell-clamp läget i förstärkaren. Ta del av vilomembranpotentialen (i avsaknad av aktuella injektion). Ställ en hållström att stabilisera membranet potentialen på önskad nivå (t.ex. -60 mV). Neutralisera pipetten kapacitans och justera bron balans för att balansera spänningsfallet.
   7. Kontrollera bränning egenskaper neuron genom att stimulera med depolariserande ström (10-200 per år i 10 pA steg, 300 ms varaktighet).
8. 1. Flytta den optiska fibern tillbaka i position intill neuronen. Använda bildbehandlingsprogram kopplad till en CCD-kamera, ta bilder av placeringen av fibern med avseende på det mål neuron, med fokus på planet av neuron initialt, och sedan på den övre kanten av den optiska fibern (se figur 1).
   2. Genom efterföljande analys av de resulterande bilderna (t.ex. figurerna 1b och 1c) är det möjligt att exakt bestämma Δ (läget av den övre kanten av den optiska fibern i förhållande till mitten av målet neuron). När Δ är känt kan parametrar såsom avståndet från fiberns ändyta till målet neuron (längs fiberaxeln) z och den radiella förskjutningen av neuron från mitten av balken δ r beräknas med enkla trigonometriska relationer:
      z = R sin 2θ + Δ cos θ
      δ r = ((r cos 2θ - Δ synd θ) ² + Ay ^{2) 1/2,}
      där Ay är avståndet mellan fiberaxeln och centrum av neuron som sett från ovan (t.ex. se-e Figur 1).
      Analys bör beakta positionella variationer från cell till cell, som exakt kunskap om dessa lokaliseringsparametrar kan krävas för att lösa eventuella skillnader mellan stimulering processer ^25.

4. INS Experiment

1. När du spelar in elektrofysiologiska data i antingen strömtång eller spänning konfigurationer klämma, kör stimulering laser vid de önskade parametrar (t.ex. effekt, pulslängd, repetitionstakt etc.). Med vår laser, är den optiska effekten styrs via en direkt ingång till lasern föraren och är specificerad manuellt före varje inspelning. Pulslängd och repetitionstakt kan styras antingen av en extern signal generator eller datainsamling programvara (såsom beskrivs i steg 2.3.4). Se till att data registreras från både patch clamp-kanalen och laser trigger kanalen.

Laserpulser med längderfrån cirka 500 ps till 15 msek och energier ~ 0,25-5 mJ per puls typiskt ge mätbara elektriska svar. Inställning av repetitionsfrekvens laserpulser för att vara 1 Hz eller mindre kan vara användbara för initiala experiment, eftersom det kommer att minimera effekterna av denna parameter. Typiska resultat som visar ändringen i den registrerade signalen presenteras i följande avsnitt.

Representative Results

Spiral ganglieneuroner svara på laserbelysning med repeterbar vågformer i både spänning-clamp och ström-clamp konfigurationer inspelning. Figur 3a visar typiska förändringar i strömflödet över ett cellmembran som svar på en 2,5 ms, 0,8 mJ laserpuls (genomsnittlig respons från 6 laserpulser, upprepas med 1 sekunds intervall) med membranpotentialen hölls vid -70 mV, -60 mV och -50 mV. Net inåt strömmar ständigt framkallade svar på laserpulser, återvänder till startvärden efter belysning har upphört. Formen av laser inducerade strömmar kan ses att variera som membran potential ändras, tyder på att det kan vara viktigt att genomföra experiment på en rad innehav potentialer för att få en fullständig förståelse av de processer som ligger bakom INS. Dessa experiment kan utföras med mindre modifiering av det nuvarande protokollet och analyseras med etablerade metoder såsom kostnad-spänning (QV) analys (see Referens ⁷ för exempel på QV kurvor som erhållits från INS in vitro).

De data som presenteras i Figur 3b är ett tecken på förändringen i membranpotentialen typiskt framkallas av en 2,5 ms, 0,8 mJ laserpuls (initial membranpotential-73mV, medelvärde över 16 laserpulser levereras vid en upprepning hastighet av 4 Hz). Ström-clamp inspelningar visar en stadig membrandepolarisering under loppet av laserpulsen följt av en ca exponentiell minskning mot vilomembranpotentialen efter pulsen. Exemplet i Figur 3b uppvisar också en liten extra membrandepolarisering efter laserpulsen. Shapiro et al. ⁷ har visat att laser-inducerade förändringar i membranpotential nära samband med lokala förändringar i temperatur (dvs. temperaturen i omedelbar närhet av cellen). Vidare, den modell som beskrivs av Thompson et al. ²⁷har fastställt att under vissa anpassning förhållanden kan diffusion följd av axiella och radiella temperaturgradienter i den belysta regionen leda till lokala temperaturvariationer grad liknar förändringar i membranpotential som visas i figur 3b. Som ett resultat av dessa fynd, är det tänkt att positionen av målcellen relativt ändytan av ljuset leverans fiber spelar en viktig roll för att bestämma både tidsförloppet för laser-framkallade variationer i membran potential och den maximala temperaturen i området för cellen.

Lysande med överdriven energi eller exponering för stora ökningar i temperaturen kan resultera i skador på målet neuron. Detta kan ofta observeras genom försämring av cellens elektriska egenskaper (t.ex. en plötslig ökning i ström krävs för att upprätthålla membranpotential på en jämn nivå, och / eller en stor ökning av buller och instabilitet i signalen). I extrema falls celldöd inträffar nästan omedelbart efter exponering för laser. Figur 4 visar en spänning-clamp inspelning av döden av en spiral ganglion neuron följd av exponering för en 25 ms, 8 mJ laserpuls.

Figur 1. Faskontrast bilder som visar en typisk neuron spiral ganglion och de relativa positionerna för optisk fiber och mikropipett (sett från ovan) under optiska stimulering experiment. A) Typisk spiral ganglion neuron. B) Den optiska fibern i position (är bild fokuserad på toppen kanten av den optiska fibern) c) Överlagrade bilder som visar fibern läge i förhållande till cellen (notera:. den övre kanten av fibern är något överhängande cellen dvs Δ är negativ). Såsom framgår av ovan, δ y och & DelTa; är den radiella förskjutningen av neuron centrum från fiberaxeln och avståndet från den övre kanten av fibern till mitten av neuron respektive. Pilar anger positionen av spiralen ganglion neuron. Skalstrecken 20 uM.

Figur 2. Schematisk ritning av experimentuppställning för optiska stimulering experiment (ej skalenlig) Infällt:. Ställning av optiska fibrer och mikroelektrod i förhållande till målcellen. θ, Δ och z definieras i protokoll steg 3.4.2 och 3.8.2.

Figur 3. A) Spänning-klämman (genomsnittligt svar från 6 laserpulser deliverött med en hastighet av 1 Hz), och b) ström-clamp (genomsnittlig respons från 16 laserpulser upprepas med en hastighet av 4 Hz) inspelningar från spiral ganglieneuroner visar laser inducerade förändringar i membranet ström och membran potential vid belysning med en 2,5 ms , 0,8 mJ laserpuls. Skuggade områden indikerar tidpunkten för laserexponering. Inläggningar visar svaren under laserbelysning mer i detalj. Obs: den infällda i en) fokuserar på kurvan som erhålls med ett membran potential -60 mV. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. Spänning-clamp inspelning visar celldöd till följd av exponering mot en alltför energisk (25 ms, 8 mJ) laserpuls. Observera att amplituden hossignalen visas i NA och är betydligt större än PA strömmarna som visas i figur 3.

Discussion

Använda de protokoll som beskrivs i detta dokument är det möjligt att utvinna och kultur spiral nervceller ganglion och utreda laser-framkallade elektriska aktiviteten genom att utföra helcells experiment patch clamp. Vid användning in vitro, tillhandahåller patch clamp-tekniken en nivå av kontroll över experimentella parametrar som inte kan uppnås in vivo. Laser stimulering parametrar som våglängd, puls energi, pulslängd, pulsformen och pulssekvenserna upprepning kan studeras på ett reproducerbart inställning. Dessutom kan den miljö där de nervceller bibehålls (t.ex. lösning temperatur, kemiska faktorer) systematiskt varierande, vilket gör det möjligt att studera membranegenskaper och därmed mekanismerna bakom infraröd neural stimulering. Samspelet mellan elektriska och optiska stimulering modaliteter kan också undersökas på ett kontrollerat sätt. Dessa grundläggande studier kan vara ytterligare avancerade genom att införa fluorescent sönder för att övervaka ytterligare parametrar såsom joniska koncentrationer eller uttrycket av värmechockproteiner. En klar förståelse av dessa olika parametrar är inte bara avgörande för att nå en fullständig förståelse av fenomenet, men också för att uppnå en effektivare stimulans genom processoptimering.

På grund av den viktiga roll som temperaturen i mekanismen för INS ^5-7, är noggrann mätning av lokal uppvärmning på grund laserbelysning av yttersta vikt att definiera denna mekanism ^27. En detaljerad metod för att erhålla kalibrerade temperaturmätningar genom att spela in den ström som flyter genom en öppen plåstret pipetten har beskrivits av Yao et al. Och ²⁸ anställd av talrika författare, för att bestämma storleken och tidsförloppet för laserinducerad temperaturförändringar i miljöer representativa för dem in vitro (se t.ex. referenser ^{7, 8).} Ged position ljuset leverans fibern kan fastställas exakt (t.ex. med det nuvarande protokollet), är denna metod för temperaturmätning sannolikt att möjliggöra noggrann kartläggning av den lokala förändringen i temperatur på grund av typiska INS stimuli.

Våglängden för den stimulerande lasern är en parameter som bör beaktas i INS experiment, eftersom laser inducerade temperaturförändringar (och därmed den bakomliggande mekanismen av INS) förmedlas av de våglängdsberoende absorptionsegenskaperna hos vatten ⁷ (se Thompson et al. ²⁵ för en detaljerad diskussion av förväntade våglängd effekter). Bortsett från 1,870 nm diod laser som används i detta protokoll (Infraröd nervstimulatorn, Optotech P / L), en mängd olika våglängder och paket laser har använts av andra författare. Några vanliga exempel på de lasrar som används i befintliga INS publikationer är: diodlasrar från Aculight med våglängder på mellan 1,840-1,940 nm ^6,7,10,13,16-18, Holmium: YAG laser (2,12 um) från Laser 1-2-3 ^{6,11,12,14,15,} och diodlasrar arbetar vid 1875 nm ^5,8, 1,470 nm ^8, och 1535 nm ⁸ från Sheaumann laser.

En potentiell nackdel med att tillämpa denna teknik till odlade nervceller spiral ganglion är att på grund av den relativt lilla storleken på nervceller (~ 10-15 ìm diameter), är inspelningen elektroden direkt belyst av lasern. Det har föreslagits att laserbelysning utöver ett visst tröskelvärde kan ändra egenskaperna för inspelning kretsen ⁷ (dvs tätning och pipett motstånd). Shapiro et al. ⁷ mätte denna tröskel genom att övervaka förändringen av återföring potential QV kurvor som laser makt ökades, att hitta en energi tröskel puls av 3 mJ. Som ett alternativt tillvägagångssätt, kan det vara möjligt att bestämma storleken av denna effekt genom att mäta den kombinerade resistansen av tätningen och pipettera i whål celläget (t.ex. genom att registrera den aktuella svar på en 10 ms, 10 mV spänningspuls) under variation av temperaturen av den extracellulära lösningen. För att till fullo förstå de mekanismer INS, är det viktigt att laser inducerad resistens förändringar mätas och beaktas.

Hittills majoriteten av experimentellt arbete rörande infraröd neural stimulering har utförts in vivo. Medan rapporterade strålningsexponering trösklar för infraröd stimulering in vivo varierar något (t.ex. 0,32 Jcm ^-2 kl 2.12 pm för råtta ischiasnerver ^1, <0,1 Jcm ^-2 vid 1,855 um för gerbil hörselnerver ^18), de är betydligt lägre än tröskelvärdena fastställts genom in vitro-studier (t.ex. cirka 20 Jcm ^-2 på 1,875 um för mus näthinneganglieceller och råtta vestibulära celler ganglion ^5,8, 8,3 J cm ^-2 för råtta neonatal cardiomycyter ^9). I detta skede detaljerna i INS processen inte är tillräckligt väl förstått att spekulera om orsaken till denna skillnad, men kan använda in vitro modeller såsom hörselneuronerna som liknar målen i tidigare in vivo arbete vara fördelaktig i att finna en förklaring .

Några andra in vitro-modeller innebär större celler såsom Xenopus oocyter (~ 1 mm diameter) som används av Shapiro et al. ⁷ Dessa kan vara användbara för att sondera rumsliga variationer i effektivitet INS över enskilda celler i syfte att undersöka om cellulära komponenter påverkas genom stimulering. Enklare modeller såsom vesiklar lipiddubbelskikts tillåta ännu mer exakt kontroll över experimentella parametrar än in vitro-försök är dock sådana modeller ganska begränsad omfattning och får inte avslöja den fulla komplexitet INS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips	Lomb Scientific	CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish	VWR International	82050-542
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957
Laminin	Invitrogen	23017-015
Curved forceps	WPI	14101	Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator	ThermoScientific	Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A	Gibco	10888-022
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-148
L-Glutamine	Invitrogen	25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Potassium D-gluconate	Sigma-Aldrich	G4500
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
Potassium hydroxide	LabServ	BSPPL738.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	310166
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	383147
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sodium hydroxide	LabServ	BSPSL740.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope	Zeiss	AxioExaminerD1	Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective	Zeiss	W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage	ThorLabs	Burleigh Gibraltar
Recording chamber	Warner Instruments	RC-26G
Vibration isolation table	TMC	Micro-g 63-532
CCD Camera	Diagnostic Instruments	RT1200
Camera software	Diagnostic Instruments	SPOT Basic
In-line solution heater	Warner	SH-27B
Temperature controller	Warner	TC-324B
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Micropipette glass	Sutter Instruments	GBF100-58-15	Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P2000
Recording Software	AxoGraph		Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle	Sigma-Aldrich	CLS12201L	1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing	Harvard	PolyE #340
Masterflex peristaltic pump	Cole-Parmer	HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode	Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC)	AFW Technologies	MM1-FC2-200/220-5-C-0.22	Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC)	Thorlabs	ADAFC2
Optical fiber cleaver	EREM	FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm)	Siemens		For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm)	Siemens		For removing outer coating of patch cord
Signal generator			Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner			Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck	Newport	FPH-DJ
Laser power meter and detector head	Coherent	FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.