Summary
Infrarood zenuwstimulatie is voorgesteld als een alternatief voor elektrische stimulatie in een reeks zenuw types, waaronder die gepaard gaan met het gehoorsysteem. Dit protocol beschrijft een patch clamp methode voor het bestuderen van het mechanisme van infrarood zenuwstimulatie in een kweek van primaire auditieve neuronen.
Abstract
Aangetoond is de laatste jaren dat gepulste, infrarood laserlicht kan worden gebruikt om elektrische reacties uitlokken in neuraal weefsel, onafhankelijk van de verdere modificatie van het doelweefsel. Infrarood zenuwstimulatie gerapporteerd in een verscheidenheid van perifere sensorische en neuraal weefsel in vivo, met weergegeven in stimulatie van neuronen in de gehoorzenuw bijzonder belang. Echter, terwijl de INS is aangetoond dat het werken in deze instellingen, het mechanisme (of mechanismen) waardoor infrarood licht veroorzaakt neurale excitatie is op dit moment niet goed begrepen. Het protocol hier gepresenteerde beschrijft een hele cel patch clamp methode ontwikkeld om het onderzoek van de infrarode neurale stimulatie in gekweekte primaire auditieve neuronen vergemakkelijken. Door grondig karakteriseren van de respons van deze cellen infrarode laser belichting in vitro onder gecontroleerde omstandigheden, kan het mogelijk zijn om een beter begrip van de fundamentele Physica krijgenl en biochemische processen die ten grondslag liggen infrarode neurale stimulatie.
Introduction
De velden van de neurofysiologie en de medische bionica sterk afhankelijk van technieken die regelbare stimulatie van elektrische reacties in zenuwweefsel kunnen. Terwijl elektrische stimulatie blijft de gouden standaard zenuwopwekplaatsen, lijdt aan een aantal nadelen, zoals de aanwezigheid van stimulatie artefacten bij het opnemen neurale respons, en een gebrek aan stimulatie specificiteit door de verspreiding van stroom in omringende weefsel 1.
De laatste twee decennia hebben de ontwikkeling van optisch gemedieerde stimulatie technieken 2 gezien. Een aantal van deze technieken vereisen aanpassing van het doelweefsel, via de toevoeging van een bepaald molecuul (bijv. gekooide moleculen) 3 of enige vorm van genetische manipulatie (bijv. optogenetics) 4, die geen van beide gemakkelijk buiten onderzoeksverband te passen. Van bijzonder belang is dan ook infrarood neurale stimulatie (INS), whereby zenuwweefsel wordt opgewekt door gepulseerd infrarood laserlicht. INS heeft de potentie om veel van de tekortkomingen van elektrische stimulatie overwinnen doordat zeer specifieke, contactloze stimulatie van zenuwweefsel 2. Hoewel INS met succes aangetoond in diverse instellingen in vivo, het precieze mechanisme van excitatie blijft onzeker.
Enkele recente publicaties hebben aangetoond vooruitgang naar het blootleggen van het mechanisme achter INS 5-7. Snelle verwarming als gevolg van absorptie van het laserlicht door het water lijkt een belangrijke rol te spelen. Daarnaast echter een consensus nog worden bewerkstelligd. Shapiro et al.. 7 stellen een zeer algemeen mechanisme waarmee snel verwarmen veroorzaakt een verstoring in de verdeling van geladen deeltjes naast de celmembraan, wat leidt tot een verandering in de capaciteit van de celmembraan en daaropvolgende depolarisatie. Bovendien Albert et al.. 5 beweren dat laser geïnduceerde verwarming activeert een specifieke klasse van temperatuurgevoelige ionkanalen (transient receptor potential vanilloid kanalen), waardoor ionen om door het celmembraan. In dit stadium is het onduidelijk hoe deze mechanismen te combineren, of zelfs of er andere factoren die nog moeten worden geïdentificeerd.
Hoewel een klein aantal publicaties (referenties 5,7-9) INS hebben in vitro onderzocht, heeft de overgrote meerderheid van het werk gepubliceerd op dit gebied is uitgevoerd in vivo (bv. referenties 1,6,10-18). Infrarode stimulatie van de auditieve neuronen is een gebied van bijzonder belang, gezien de potentiële toepassingen in cochleaire implantaten 10,14-18. Terwijl in vivo experimenten zijn belangrijk voor de effectiviteit van de techniek in verschillende instellingen, over de toegenomen geboden door in vitro studies controle naar verwachting leiden tot een meer gedetailleerd begrip van de mech controlerennisme verantwoordelijk voor de INS. Dit rapport beschrijft de bereiding van gekweekte ganglion spirale neuronen voor patch clamp onderzoeken, omdat deze kunnen worden gebruikt om fundamentele mechanismen bestuderen tegelijkertijd verbinden met de grote hoeveelheid bestaande gegevens uit het gehoorsysteem.
De patch clamp techniek is een uitstekend hulpmiddel voor het onderzoeken van elektrofysiologische fenomenen, een middel van het opnemen van elektrische activiteit in enkele cellen en het bestuderen van de bijdrage van de individuele onderliggende stromingen 19. Wanneer deze techniek wordt toegepast op een stabiele in vitro bereiding van primaire neuronen, zoals gekweekte ganglion spirale neuronen, biedt de mogelijkheid te bestuderen in de mechanismen waardoor neurale activiteit wordt gecontroleerd en gemanipuleerd diepte.
De in dit werk schema onderzoeken van het effect van laserstimulatie op de elektrische eigenschappen van de ganglion spirale neuronen door patch clamp protocollenopnames. De benadering is gebaseerd op een vezel-gekoppelde laser in plaats van een vrije ruimte laser, waardoor veiliger werken en gemakkelijker en herhaalbare uitlijning zonder de standaard microscoop configuratie te wijzigen. Op grond van deze protocollen, moet het mogelijk zijn een groot aantal experimenten om meer duidelijk het mechanisme of mechanismen achter INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultuur van Spiral ganglionneuronen
- Steriliseren kleine ronde (bv. 10 mm diameter) dekglaasjes en gebogen pincet in een autoclaaf. Breng de gesteriliseerde dekglaasjes in afzonderlijke putjes van een steriele 4-ring 35 mm petrischaaltje of 4-well plaat, met behulp van de gesteriliseerde tang. Breng 150 pi van poly-L-ornithine (500 ug / ml) en muis laminine (0,01 mg / ml) op het bovenoppervlak van het dekglaasje en in een incubator (37 ° C) gedurende 48 uur. Zorg ervoor dat de dekglaasjes niet wegdrijven van de bodem van de put.
- Bereid 50 ml steriel Neurobasal media (NBM) voor elke neurale cultuur: 47,5 ml Neurobasal A, 0,5 ml N2 supplement, 1 ml B27 supplement, 0,5 ml L-glutamine, en 0,5 ml penicilline-streptomycine. Opmerking: Supplementen worden ingevroren, opgeslagen bij -20 ° C en toegevoegd aan de media op de dag vereist.
- Distantiëren spiraal ganglion neuronen van postnatale dag 4-7 rattenpups zoals eerder beschreven 20,21, onsIng zowel enzymatische (0,025% trypsine en 0,001% DNase I) en mechanische technieken. Zie Whitlon et al.. 22 en Vieira et al. 23. voor gedetailleerde procedures van spiraal ganglion neuron cultuur, of Parker et al.. 24 voor een demonstratie van modiolus isolement.
- Aspireren resterende poly-L-ornithine/laminin oplossing uit de dekglaasjes en kort wassen met NBM.
- Voeg 150-200 ul van de gedissocieerde ganglion spirale neuron suspensie de dekglaasjes en het in een incubator (37 ° C, 10% CO2). Opmerking: tot 20 dekglaasjes kunnen worden bereid uit een gemiddelde nest van 8 ratten.
- Vier uur na het uitplaten neuronen, zuigen de oplossing celresten te verwijderen en te vervangen door 150-200 ul voorverwarmde verse NBM. Opmerking: media kunnen de dagelijkse aanvulling nodig om uitdroging te voorkomen.
- Terug dekglaasjes naar de couveuse tot het moment van elektrofysiologische opnames. Opmerking: los spiraalganglion neuron culturen uur na dissociatie en tot twee dagen daarna gebruikt voor elektrofysiologische experimenten. Tijd in vitro moeten tijdens de analyse van de resultaten rekening worden gehouden. Vullen NBM elke 24-48 uur.
2. Voorbereiding voor Patch Clamp Recordings
- Bereid oplossingen
- Intracellulaire (micropipet) oplossing: 115 mM K-gluconaat, 7 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,05 mM EGTA, 2 mM Na 2 ATP, 2 mM MgATP, 0,5 mM Na2 GTP (op pH 7,3 met KOH, aanpassen 295 mOsmol / kg met sucrose). Laat de oplossing door een steriel filter (0,2 pm) en verdelen in 200 pi fracties bij -20 ° C tot de dag van de opname worden opgeslagen.
- Extracellulaire (bad) oplossing: 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose (op pH 7,4 met NaOH; aanpassen 300-310 mOsmol / kg met sucrose) . Deze oplossing wordt op de dag van opname.
- Bereid opname micropipetten met een weerstand van 2-6 MQ. We maken gebruik van een CO 2 laser puller (P-2000; Sutter Instruments) en borosilicaatglas (1,0 mm buitendiameter; 0,58 mm binnendiameter; 75 mm lengte).
- Bereid de laser. Dit protocol is bedoeld voor gebruik met een vezel-gekoppelde laser, zoals 1870 nm infrarood zenuwstimulator van Optotech P / L. De optische vezel gebruikt voor lichte levering in onze experimenten is een 200/220 um kern / mantel diameter silica vezel met een numerieke opening van 0,22 en FC-PC connectors aan beide uiteinden (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). De patch koorden gehalveerd tot twee vezels vlechten (ie voorzien van een connector aan een einde en gesplitst op de andere) produceren. De effecten van vezels kerndiameter en numerieke opening op laser-geïnduceerde veranderingen in temperatuur zijn uitvoerig besproken door Thompson et al.. 25
- Splijt het uiteinde van het licht levering vezel met behulp van standaard techniekenen ervoor zorgen dat de resulterende tip is van hoge kwaliteit door observatie met een optische microscoop (dwz de tip moet loodrecht op de vezel-as en lijken plat na visuele inspectie). Sluit het licht levering fiber to the fiber-gekoppelde uitgang van de stimulatie laser met behulp van een geschikte via connector (bijv. Thorlabs ADAFC2).
- Meet de uitgang laservermogen van het gesplitste uiteinde van het licht levering vezel met behulp van een geschikt instrument (bv. Coherent FieldMate met LM-3 melderkop). Het wordt aanbevolen om het laservermogen iedere keer het licht aflevering vezel wordt gesplitst of een belangrijke aanpassing wordt gedaan om de laser (bv vervoer van het ene laboratorium naar het andere) te controleren.
- Breng licht levering vezel in een vezel klauwplaat of vergelijkbare voorziening en brengen zij de boorkop naar de juiste micropositioner. Het is belangrijk om de hoek θ die de optische vezel maakt het dekglaasje nauwkeurig bepalen. Dit angle kan worden gemeten door een foto van de experimentele opstelling en met beeldverwerkingssoftware (bijvoorbeeld ImageJ) om de stand te verkrijgen. De hoek θ (of bereik van mogelijke hoeken) wordt voornamelijk beperkt door ruimtelijke beperkingen van de proefopstelling - vooral de microscoop. Typische waarden van θ in onze experimenten (gebaseerd op een rechtopstaande microscoop) zijn ongeveer 36 °, maar de optimale hoek aanzienlijk verschillen alternatieve opstellingen (bijvoorbeeld die met behulp van een omgekeerde microscoop).
- Verbanden tussen de laser en de patch clamp meetsysteem (bijv. Digidata 1440A, Molecular Devices) zoals getoond in figuur 2. De digitale uitgang van de patch clamp meetsysteem moet worden aangesloten op de laser via een externe functie generator, waardoor het mogelijk laserpuls parameters onafhankelijk van het meetsysteem te geven. Alternatief deze uitgang kan direct worden aangesloten opde laser driver (waarbij de puls lengte en de herhalingsfrequentie van de data-acquisitie software in te stellen). In beide gevallen dient het signaal gebruikt om de laser activeren terug verbonden met een ingang van het meetsysteem dat de timing en lengte van de laserpulsen gelijktijdig kunnen worden opgenomen met de elektrofysiologische signaal.
3. Patch Clamp Recordings voor Onderzoek van INS
- Vul het juiste container van de perfusie-systeem met extracellulaire oplossing en pas het debiet aan perfusie van het bad te leveren tegen een snelheid van 1-2 ml / min. We gebruiken een zwaartekracht gevoed systeem (aanzuigfles, afknijpventiel, en PE slang) met een in-line heater snel verwarmen van de oplossing en een peristaltische pomp verbruikte oplossing te verwijderen door afzuigen mogelijk.
- Plaats een dekglaasje met gekweekte cellen in de opname kamer (bad) van een rechtopstaande microscoop. Met behulp van een hoge vergroting water-immersie objectief (e. G. 40x) en fase-contrast (bijv. differentieel interferentie contrast of Dodt gradiënt contrast), visueel lokaliseren de spiraal ganglion neuronen binnen de cultuur. Een typische ganglion spirale neuron fase-helder, rond en ongeveer 15 micrometer in diameter met een prominente kern, zoals getoond in figuur 1a.
- Zodra een neuron is gevestigd, over te schakelen naar een kleinere vergroting doelstelling (bv. 10X) en zoek de doelgroep neuron binnen het gezichtsveld.
- Verplaats het licht levering optische vezel in positie met behulp van de volgende procedure (of gelijkwaardig):
- Gebruik micropositioner de uitgangsvezel bewegen totdat de punt dicht bij het doel neuron in zowel de horizontale en verticale vlak. De verticale positie van de vezel tip kan worden geverifieerd door de doelstelling op en neer bewegen (het scannen van de focus).
- Ga terug naar de hoge objectiefvergroting en plaats het uiteinde van de optische vezel in de bedoelde positie naast tHij neuron (zie figuur 2 inzet). Het instellen van de verticale positie van de vezel, is het belangrijk dat de onderrand van de vezel rust op (dus slechts raken) het dekglaasje worden onzekerheid over de locatie van de vezel te minimaliseren. Optimale positionering in het horizontale vlak zal afhangen van de hoek θ die de vezel maakt het dekglaasje en de straal van de vezel r. Om de vezels te positioneren zodat het midden van het doelwit neuron ligt langs de vezelas, dient de horizontale afstand tussen de bovenkant van de vezel en de doelcel
Δ target = r (cosec θ - 2 sin θ),
Indien negatieve waarden zouden aangeven dat de optische vezel hangt de cel. Bij het instellen van de vezel, kan een afstand Δ doel tussen de bovenrand van de vezel en het centrum van de neuron benadering worden bereikt door visuele inspectie. Echter Δ doel is ontworpendienen enkel als ruwe richtlijn. Plaatsing van de vezel zodanig dat de feitelijke afstand Δ tussen de bovenrand van de vezel en het centrum van de neuron meetbaar verschilt van Δ doel (zoals in figuur 1) kan inzicht verschaffen in het effect van zowel radiale verplaatsing (dat wil zeggen van het centrum van de beam) en axiale verplaatsing (bijvoorbeeld langs de vezelas) van de bundel ten opzichte van het doelwit neuron. Bijvoorbeeld, het instellen Δ ≈ 0 zou naar verwachting de lokale temperatuur te verhogen in de nabijheid van de cel - dat wil zeggen sinds de bundel profiel voor typische multimode vezels is goed benaderd door een hoge hoed verdeling 26, de daling van lokaal geabsorbeerde energie (temperatuur) door verplaatsing van het centrum van de bundel minimaal in vergelijking met de toename van de geabsorbeerde energie uit dichter bij de cel beweegt het vezeleindvlak.
Terwijl zorg moeten worden genomen om de vezels zo nauwkeurig en herhaalbaar als po positionerenssible behulp van visuele aanwijzingen, nauwkeurige meting van de vezel locatie ten opzichte van het doel neuron (bv. Δ) is van groter belang dan het plaatsen van een vooraf bepaalde afstand. Δ kan worden vastgesteld (met een geschatte maximale onzekerheid van ± 3 micrometer) door beeldanalyse zoals beschreven in stap 3.8.2 van het protocol. In sommige experimenten 5,8 hebben witlichtbronnen aangekoppeld door de vezel om de gewenste cel te richten. Deze aanpak bleek effectief te zijn in de rechtopstaande microscoop setup, zoals de intensiteit van het licht verstrooid uit het doelgebied was relatief laag in deze ondiepe hoeken (θ). - Zodra de vezel is in staat, zet het uit door een bekende hoeveelheid tot een eenvoudige positionering van de micropipet mogelijk. De vezel kan dan worden teruggebracht naar de oorspronkelijke positie wanneer een neuraal opname wordt bereikt.
- Vul het micropipet met intracellulaire oplossing en veilig te passen in plaats van de koppentage van de versterker (bv. Multiclamp 700B, Molecular Devices). Middels slang aan de zijkant van de micro-elektrode houder, een kleine hoeveelheid positieve druk verstopping van de micropipet te voorkomen.
- Met behulp van een micromanipulator, verplaatsen de micropipet in positie net boven de doelstelling neuron.
- Protocol voor het gehele cel opnames:
- Breng een 10 msec, 10 mV rechthoekimpuls (bv. Seal Test) in voltage-clamp-modus van de versterker en de micropipet potentiële (pipet offset) van de basislijn signaal naar 0 nA passen. De dichtheidstest moet worden bepaald of de weerstand van de micro-elektrode binnen het gewenste bereik (bijv. 2-6 MQ).
- Terwijl het toezicht op de weerstand, gebruik fijne aanpassingen van de micromanipulator om voorzichtig te positioneren de micropipet op het oppervlak van het doel neuron. Wanneer de micropipet in contact met de neuron, zal de weerstand te verhogen (van ~ 0,5 tot 1 MQ). Ikmmediately na de weerstand te verhogen, verwijder de positieve druk vloeistof en breng een kleine negatieve druk. Zodra weerstand is geslaagd 10 - 20 MQ, fix het membraan potentieel om een holding niveau (bijvoorbeeld rond -60 mV).
- De elektrode weerstand moet blijven stijgen tot het hoger is dan 1 GQ, betekent dat een effectieve afdichting (zogenaamde 'gigaseal') is gevormd tussen het celmembraan en de micropipet. Op dit punt, verwijder alle vloeistofdruk van de micropipet.
- Zodra de gigaseal is gevormd, gebruik korte stroompulsen (25 tot 100 psec, 1 V) of korte pulsen van negatieve fluïdumdruk scheuren de celmembraan en het bereiken van volledige celconfiguratie.
- Noteer de membraancapaciteit, serie weerstand en input weerstand zoals bepaald uit de exponentiële curve gemonteerd op de huidige tijdens de dichtheidsbeproeving pols. Het minimaliseren van de capacitieve transiënten door het aanpassen van de CpFast en CpSlow controles op de versterker, dan switch de versterker in de gehele cel modus, en compenseren capaciteit en weerstand tot een vlakke stroom wordt waargenomen tijdens de dichtheidsbeproeving. Solliciteer serieweerstand compensatie (~ 70% correctie; 70% predictie), het aanpassen van capaciteit en weerstand controles om een vlakke keurmerk respons te handhaven.
- Schakel over naar de huidige-clamp-modus in de versterker. Kennis te nemen van de rust membraanpotentiaal (in afwezigheid van de huidige injectie). Stel een holding stroom naar de membraanpotentiaal stabiliseren op het gewenste niveau (bijv. -60 mV). Neutraliseren de pipet capaciteit en stel de brug saldo aan het spanningsverlies evenwicht.
- Controleer het afvuren eigenschappen van het neuron door het stimuleren met depolariserende stroom (10-200 pA in 10 pA stappen; 300 msec duur).
- Verplaats de optische vezel terug op zijn plaats naast het neuron. Gebruik imaging software gekoppeld aan een CCD camera beelden van de positie van de vezel vast te leggen ten opzichte van het doel neuron, gericht op het vlak van de neuron aanvankelijk, en vervolgens de bovenste rand van de optische vezel (zie figuur 1).
- Bij verdere analyse van de beelden (bijvoorbeeld figuren 1b en 1c) is het mogelijk om precies te bepalen Δ (de positie van de bovenrand van de optische vezel ten opzichte van het midden van het doelwit neuron). Zodra Δ bekend is, kunnen parameters zoals de afstand tussen het vezeleindvlak het doelwit neuron (langs de vezelas) z en de radiale verplaatsing van het neuron van het centrum van de bundel δ r worden berekend met behulp van eenvoudige trigonometrische relaties:
z = r sin 2θ + Δ cos θ
δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) 2 + Ay 2) 1/2,
wanneer Ay de afstand tussen de vezel-as en het midden van het neuron van boven gezien (bijv. see Figure 1).
Analyse moet rekening worden gehouden met positionele varianten van cel naar cel, zoals nauwkeurige kennis van deze locatie parameters kan worden verplicht om mogelijke verschillen tussen stimulatie processen 25 te lossen.
4. INS Experimenten
- Tijdens het opnemen van elektrofysiologische gegevens in beide stroomtang of voltage clamp configuraties, draaien de stimulatie laser op de gewenste parameters (bv. vermogen, pulslengte, herhalingsfrequentie etc.). Met onze laser, wordt het optische vermogen aangestuurd via een directe ingang naar de laser driver en wordt handmatig bepaald vóór elke opname. Impulsen en herhalingssnelheid kan worden gecontroleerd door ofwel een externe generator of het data acquisitie software (zoals beschreven in stap 2.3.4). Ervoor te zorgen dat de gegevens worden geregistreerd vanaf zowel de patch clamp-kanaal en de laser triggerkanaal.
Laserpulsen met lengtes variërendvan ongeveer 500 msec naar 15 msec en energieën van ~ 0,25-5 mJ per impuls levert doorgaans meetbaar elektrisch reacties. Instellen herhalingssnelheid van laserpulsen 1 Hz of minder zijn nuttig kan zijn eerste experimenten, omdat de effecten van deze parameter zal minimaliseren. Typische resultaten tonen de verandering in de opgenomen signaal worden gepresenteerd in de volgende paragraaf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ganglion spirale neuronen reageren op laser belichting met herhaalbare golfvormen in het voltage-clamp en stroom-clamp opname configuraties. Figuur 3a toont typische veranderingen in stroom over een celmembraan in respons op een 2,5 msec, 0,8 mJ laserpuls (gemiddelde reactietijd van 6 laserpulsen herhaald met intervallen van 1 seconde) met de membraanpotentiaal gehouden op -70 mV, -60 mV en -50 mV. Net naar binnen stromen worden consequent opgeroepen als reactie op laserpulsen, terug te keren naar de initiële waarden na belichting heeft opgehouden. De vorm van de laser geïnduceerde stromen kunnen worden gezien variëren de membraanpotentiaal verandert, wat aangeeft dat het belangrijk kan zijn om proeven bij verschillende potentialen die voeren om een volledig begrip van de processen die INS krijgen. Deze experimenten kunnen met geringe wijziging van het huidige protocol worden uitgevoerd en geanalyseerd met behulp van gevestigde technieken zoals lading-voltage (QV) analyse (see Reference 7 voor voorbeelden van QV curves verkregen uit INS in vitro).
De gegevens in figuur 3b indicatie van de verandering in de membraanpotentiaal doorgaans opgewekt door een 2,5 msec, 0,8 mJ laserpuls (Eerste membraanpotentiaal-73mV, gemiddeld over 16 laser pulsen met een herhalingsfrequentie van 4 Hz). Voor-clamp branden continu membraan depolarisatie in de loop van de laserpuls gevolgd door een ongeveer exponentiële afname richting rust membraanpotentiaal na de puls. Het voorbeeld in figuur 3b vertoont ook een kleine extra membraan depolarisatie na de laserpuls. Shapiro et al.. 7 hebben aangetoond dat laser-geïnduceerde veranderingen in membraanpotentiaal nauw verwant aan de lokale veranderingen in temperatuur (de temperatuur in de directe nabijheid van de cel). Verder, het model beschreven door Thompson et al.. 27heeft vastgesteld dat onder bepaalde harmonisatievoorwaarden, diffusie als gevolg van axiale en radiale temperatuurgradiënten in het verlichte gebied tot plaatselijke temperatuurschommelingen gelijkenis vertonen met de veranderingen in de membraanpotentiaal in figuur 3b. Als gevolg van deze bevindingen wordt aangenomen dat de positie van de doelcel opzichte van het eindvlak van het licht productietijd vezel een belangrijke rol bij het bepalen van zowel het tijdsverloop van laser-geïnduceerde veranderingen in membraanpotentiaal en de maximum temperatuur speelt in het gebied van de cel.
Het verlichten van overmatige energie of blootstelling aan grote toename in temperatuur kan schade aan het doelwit neuron. Dit kan vaak worden waargenomen door verslechtering van cel elektrische eigenschappen (bijv. een abrupte stijging van de lopende moeten de membraanpotentiaal handhaven op een stabiel niveau, en / of een grote toename van ruis en instabiliteit in het signaal). In het uiterste gevals celdood vrijwel onmiddellijk bij blootstelling laser. Figuur 4 toont een voltage-clamp registratie van de dood van een spiraal ganglion neuronen als gevolg van blootstelling aan een 25 msec, 8 mJ laserpuls.
Figuur 1. Fasecontrastbeelden dat een typische spiraal ganglion neuronen en de relatieve posities van de optische vezel en micropipet (van bovenaf gezien) bij optische stimulatie experimenten. A) Typische spiraal ganglion neuronen. B) De optische vezel in positie (afbeelding is gericht op de top rand van de optische vezel) c) Overlaid beelden die de vezel ten opzichte van de cel (note:. de bovenrand van de vezel enigszins boven de cel dat wil zeggen Δ negatief). Zoals gezien van boven, en δ y & Delta, de radiale verplaatsing van het neuron midden van de vezel-as en de afstand van de bovenrand van de vezel respectievelijk het centrum van het neuron. Pijlen geven de positie van de ganglion spirale neuron. Schaalbalken 20 urn.
Figuur 2. Schema van de experimentele opstelling voor optische stimulatie experimenten (niet op schaal) Inzet:. Positie van glasvezel en micro-elektrode ten opzichte van de doelcel. θ, Δ en z zijn zoals gedefinieerd in protocol stappen 3.4.2 en 3.8.2.
Figuur 3. A) Voltage-clamp (gemiddelde responstijd van 6 laserpulsen deliverood met een snelheid van 1 Hz) en b) de huidige-clamp (gemiddelde respons van 16 laser pulsen herhaald met een frequentie van 4 Hz) opnamen van spiraal ganglion neuronen tonen laser geïnduceerde veranderingen in de membraan huidige en membraanpotentiaal bij belichting door een 2,5 msec , 0,8 mJ laserpuls. Gearceerde gebieden geven de timing van de blootstelling laser. Inzetstukken tonen responsen tijdens laser belichting in meer detail. Opmerking: de inzet in een) richt zich op het verkrijgen van een membraanpotentiaal van -60 mV spoor. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Voltage-clamp-opname geeft celdood door blootstelling aan een te energetische (25 msec, 8 mJ) laserpuls. Merk op dat de amplitude vanhet is getoond in nA en is significant groter dan het pA stromen figuur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van de in deze paper protocollen is het mogelijk om uit te pakken en cultuur spiraal ganglion neuronen en laser-opgewekte elektrische activiteit te onderzoeken door hele cellen patch clamp experimenten uitvoeren. Bij gebruik in vitro, de patch clamp techniek geeft een mate van controle over de experimentele parameters die niet haalbaar in vivo. Laserstimulatie parameters zoals golflengte, pulsenergie, pulslengte, pulsvorm, en pulsherhalingsfrequentie sequenties kunnen worden onderzocht in een reproduceerbare. Bovendien kan de omgeving waarin de neuronen worden gehouden (bijv. oplostemperatuur, chemische factoren) systematisch worden gevarieerd, waardoor de membraan eigenschappen te bestuderen en daarmee de mechanismen infrarood zenuwstimulatie. De interactie tussen elektrische en optische stimulatie modaliteiten kunnen ook worden onderzocht in een gecontroleerde manier. Deze fundamentele studies kunnen verder gevorderd worden door de invoering van fluorescentie probes aanvullende parameters zoals ionische concentraties of de expressie van heat shock eiwitten volgen. Een duidelijk begrip van deze verschillende parameters niet alleen essentieel om een volledig begrip van het fenomeen te bereiken, maar ook efficiëntere stimulering bereiken door procesoptimalisatie.
Vanwege de belangrijke rol van de temperatuur in het mechanisme van INS 5-7, nauwkeurige meting van de plaatselijke verwarming te wijten aan laser verlichting is van groot belang bij het bepalen van dit mechanisme 27. Een gedetailleerde werkwijze voor het verkrijgen gekalibreerde metingen door registratie van de stroom die door een open patch pipet is beschreven door Yao et al.. 28 werkzaam zijn bij talrijke auteurs, de omvang en tijdsverloop van laser geïnduceerde temperatuurveranderingen in omgevingen die representatief zijn vast gevonden in vitro (bijvoorbeeld zie Referenties 7, 8). Verstrekkend de positie van de licht productietijd vezel nauwkeurig kan worden bepaald (bijvoorbeeld met het huidige protocol), deze wijze van temperatuurmeting wil nauwkeurigere afstemming van de lokale verandering in temperatuur door typische INS stimuli mogelijk.
De golflengte van het stimulerende laser is een parameter die moet worden beschouwd in INS experimenten, aangezien laser geïnduceerde temperatuursveranderingen (en dus de onderliggende mechanismen van INS) worden gemedieerd door de golflengte afhankelijke absorptie eigenschappen van water 7 (zie Thompson et al.. 25 voor een gedetailleerde bespreking van de verwachte effecten golflengte). Afgezien van de 1870 nm diode laser gebruikt in dit protocol (Infrared Nerve Stimulator, Optotech P / L), diverse golflengten en laser pakketten zijn gebruikt door andere auteurs. Enkele veel voorkomende voorbeelden van de lasers worden gebruikt in bestaande INS publicaties zijn: diode lasers uit Aculight met golflengtes variërend van 1,840-1,940 nm 6,7,10,13,16-18; Holmium: YAG lasers (2,12 pm) van Laser 1-2-3 6,11,12,14,15, en diode lasers werkend bij 1875 nm 5,8, 1470 nm 8 en 1535 nm 8 van Sheaumann laser.
Een mogelijk nadeel van het toepassen van deze techniek gekweekte ganglion spirale neuronen dat vanwege de betrekkelijk geringe omvang van de neuronen (~ 10-15 micrometer diameter), wordt de registratie-elektrode direct door de laser belicht. Er is gesuggereerd dat laser verlichting boven een bepaalde drempel de eigenschappen van de registratieschakeling 7 (dwz afdichting en pipetteer weerstand) kunnen veranderen. Shapiro et al.. 7 gemeten deze drempel door het toezicht op de verandering in de omkering potentieel van QV curves zoals laservermogen werd verhoogd, het vinden van een drempel puls energie van 3 mJ. Als alternatieve benadering kan het mogelijk zijn om de grootte van dit effect bepaald door het meten van de gecombineerde weerstand van de afdichting en tube whole celmodus (bijvoorbeeld door opname van het huidige reactie op een 10 msec, 10 mV spanningspuls) onder variatie van de temperatuur van de extracellulaire oplossing. Om de mechanismen van INS begrijpen, is het essentieel dat laser geïnduceerde resistentie veranderingen worden gemeten en meegenomen.
Tot op heden de meeste experimentele werk inzake infrarode neurale stimulatie is uitgevoerd in vivo. Terwijl gemeld bestralingsdosis drempels voor infrarode stimulatie in vivo enigszins variëren (bv. 0.32 Jcm -2 bij 2,12 micrometer voor rat sciatische zenuwen 1, <0,1 Jcm -2 op 1,855 micrometer voor gerbil auditieve zenuwen 18), ze zijn aanzienlijk lager dan de drempels bepaald door in vitro studies (bv. ongeveer 20 Jcm -2 op 1,875 micrometer voor muis retinale ganglioncellen en ratten vestibulaire ganglion cellen 5,8, 8,3 J cm -2 voor rat neonatale cardiomyopathiecyten 9). In dit stadium van de details van de INS proces niet voldoende goed begrepen te speculeren over de oorzaak van dit verschil, maar met in vitro modellen zoals auditieve neuronen die sterk de doelstellingen van eerder in vivo werken voordelig kan zijn in een verklaring te .
Enkele andere in vitro modellen omvatten grotere cellen zoals Xenopus oöcyten (~ 1 mm diameter) die door Shapiro et al.. 7 Deze kunnen dienen voor het aangeven ruimtelijke variatie in de effectiviteit van de INS in afzonderlijke cellen Om te onderzoeken of cellulaire componenten werden beïnvloed door stimulatie. Eenvoudigere modellen zoals lipidebilaag blaasjes kan nog preciezere controle over de experimentele parameters dan in vitro experimenten toelaten, worden echter dergelijke modellen enigszins beperkt in omvang en kan niet onthullen de volledige complexiteit van de INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Australische Raad voor Onderzoek onder Linkage Project subsidie LP120100264.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. | |||
References
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al.
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T.
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscience. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. Optical Waveguide Theory. , Chapman and Hall. (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
