Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

A منصة الآلي تنوعا للتجارب تحفيز الخلية الصغيرة الحجم

Published: August 6, 2013 doi: 10.3791/50597
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 4, 2
1Department of Systems Biology, Sandia National Laboratories, 2Department of Biotechnology and Bioengineering, Sandia National Laboratories, 3Canon U.S. Life Sciences, 4Department of Advanced Systems Engineering and Deployment, Sandia National Laboratories

Summary

لقد قمنا بتطوير زراعة الخلايا الآلي ومنصة الاستجواب للتجارب التحفيز الخلية الصغيرة الحجم. منصة يوفر تحكم بسيطة، وتنوعا، ودقيق في زراعة وتحفيز المجموعات الصغيرة من الخلايا، واستعادة لست] للالتحليلات الجزيئية. منصة هي مناسبة تماما للدراسات التي تستخدم الخلايا الثمينة و / أو الكواشف.

Abstract

وقد وفرت دراسة الخلايا في الثقافة (في تحليل المختبر) نظرة متبصرة في النظم البيولوجية المعقدة. الأساليب التقليدية والمعدات اللازمة لفي تحليل المختبر هي مناسبة تماما لدراسة أعداد كبيرة من الخلايا (≥ 10 5) في مجلدات على نطاق وملليلتر (≥ 0.1 مل). ومع ذلك، هناك العديد من الحالات التي كان من الضروري أو المرغوب فيه إلى تقليص حجم الثقافة للحد من استهلاك الخلايا من الفائدة و / أو الكواشف اللازمة لثقافتهم، والتحفيز، أو المعالجة. للأسف، والنهج التقليدي لا تدعم التلاعب دقيقة وقابلة للتكرار من الثقافات الصغيرة الحجم، والنظم الآلية القائمة على على microfluidics المتوفرة حاليا هي معقدة جدا ومتخصصة للاستخدام الروتيني من قبل معظم المختبرات. لمعالجة هذه المشكلة، قمنا بتطوير منصة تقنية بسيطة وتنوعا للثقافة الآلي، والتحفيز، واستعادة مجموعات صغيرة من الخلايا (100 - 2،000 الخلايا) في حجم الصغيرة الحجمق (1-20 ميكرولتر). تتكون منصة لمجموعة من فبرونيكتين المغلفة microcapillaries ("غرف نضح الخلية")، التي وضعت ضمن الثقافات الصغيرة الحجم، حافظ، وحفز؛ وعلى microfluidics (DMF) جهاز رقمي تجهيزه مع "نقل" microcapillaries ("المحور المركزي ")، التي المسارات الخلايا والكواشف من وإلى غرف نضح؛ مضخة محقنة عالية الدقة، والذي نقل صلاحيات المواد بين الغرف نضح والمحور المركزي؛ وواجهة الإلكترونية التي توفر السيطرة على نقل المواد، والتي هي منسقة والآلي عبر البرامج النصية محددة سلفا. وكمثال على ذلك، استخدمنا منصة لتسهيل دراسة استجابات النسخي أثارت في الخلايا المناعية على التحدي مع البكتيريا. استخدام منصة مكنتنا من تقليل استهلاك الخلايا والكواشف، وتقليل التباين التجربة إلى التجربة، وإعادة توجيه التدريب العملي على العمل. وبالنظر إلى المزايا التي تمنح، وكذلك في إمكانية الوصول والتنوع، سمنصة اور ينبغي أن تجد استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من المختبرات والتطبيقات، وتكون مفيدة خاصة في تسهيل تحليل الخلايا والمحفزات التي تتوفر بكميات محدودة فقط.

Introduction

وقد وفرت دراسة خلايا المحافظة في الثقافة (في تحليل المختبر) نظرة لا تقدر بثمن في المبادئ الأساسية والآليات الجزيئية التي تحكم النظم البيولوجية المعقدة وصحة الإنسان. تم تصميم الطرق التقليدية للثقافة، والتحفيز، ومجموعة من الخلايا لتحليلها، التي تستخدم أطباق بتري ووحات microtiter، لدراسة أعداد كبيرة من الخلايا (≥ 10 5) في مجلدات الثقافة على نطاق وملليلتر (≥ 0.1 مل). ومع ذلك، هناك العديد من الحالات التي ليست سوى كميات محدودة من الخلايا المتاحة (مثل الخلايا الأولية)، أو المجموعات الصغيرة من الخلايا المرغوب فيه (على سبيل المثال للحد من خلية الى خلية تقلب عبر السكان)، أو الكواشف المطلوبة يصعب الحصول عليها أو باهظة التكاليف (مثل تنقية العوامل الخلية يفرز). مثل هذه القضايا لا يمكن معالجتها بنجاح من قبل تقليص حجم والثقافة، والتي لها فائدة إضافية تتمثل في خفض استهلاك جميعالكواشف اللازمة للتحليل في المختبر 1،2. للأسف، المعدات والأساليب التقليدية لا تعتمد التلاعب دقيقة وقابلة للتكرار من الثقافات الصغيرة الحجم والنظم الآلية القائمة على على microfluidics المتاحة حاليا 3-11 معقدة جدا ومتخصصة للاستخدام الروتيني من قبل معظم المختبرات.

في هذا التقرير، وصفنا التجمع واستخدام منصة تكنولوجيا بسيطة وتنوعا للثقافة الآلي، والتحفيز، واستعادة مجموعات صغيرة من الخلايا (100 - 2،000 الخلايا) في أحجام الصغيرة الحجم (1-20 ميكرولتر). بنية منصة (الشكل 1) هي وحدات مستقلة في تصميم: مجموعة من فبرونيكتين المغلفة microcapillaries ("غرف نضح الخلية" وحدة نمطية) يخدم كموقع لإنشاء، والصيانة، والتحفيز من الثقافات على نطاق والجزئي؛ وعلى microfluidics الرقمية (DMF ) 12،13 الجهاز تجهيزه مع "نقل" microcapillaries ("المحور المركزي" وحدة نمطية) 14،15 المسارات الخلاياوالكواشف من وإلى غرف نضح. DMF تمكن المستخدم من معالجة فردي قطرات متعددة في نفس الوقت وإلى تغيير أو إعادة ترتيب التلاعب (أي إعادة تكوين نموذج القطارات التجهيز) دون تغيير الأجهزة الجهاز. لها مرونة هائلة هو واضح في ظهور في الآونة الأخيرة باعتباره التكنولوجيا الرئيسية في مجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك الثقافة خلية 16،17، المقايسات انزيم 18،19، 20،21 المناعية، وتحليل الحمض النووي 22،23، وتجهيز بروتين، 24،25 وتجهيز العينات السريرية. 26،27 محور مركزي لدينا يستفيد من المرونة الملازمة لأجهزة DMF، وكذلك يعزز ذلك من خلال إضافة واجهات microcapillary، الذي يوفر فرصة لتنفيذ مجموعة فرعية من التلاعب (مثل زراعة الخلايا) في الطرفية المتخصصة وحدات، وليس على جهاز DMF نفسها. تجزئة وحدات لمعالجة بهذه الطريقة أيضا يبسط تصميم جيش التحرير الشعبى الصينىtform العمارة (لا حاجة لبناء جهاز DMF التي يمكن تنفيذ جميع خطوات التجهيز) ويسهل تطورها، وظائف جديدة مطلوبة (ببساطة دمج وحدات طرفية جديدة حسب الضرورة). هو الدافع وراء نقل الخلايا والكواشف داخل محور مركزي من قبل electrowetting القوات التي تولدها تفعيل متتابعة من الأقطاب الكهربائية داخل الجهاز DMF 13،28؛ النقل من وإلى وداخل غرف نضح هو مدعوم من وتغيرات الضغط الناتجة عن حقنة عالية الدقة مضخة. يتم التحكم في جميع هذه الحركات السوائل عبر واجهة إلكترونية بسيطة ومؤتمتة من خلال استخدام البرامج النصية محددة سلفا.

كمثال ممثل، ونحن لشرح استخدام منصة لدراسة استجابات النسخي أثارت في الخلايا المناعية على التحدي مع البكتيريا (الشكل 2). تنفيذ هذه التجارب على منصة مكنتنا من العمل مع أعداد صغيرة من الخلايا (~ 1،000 في التجربهحالة TAL)، تقليل التباين التجربة إلى التجربة، الكواشف الحفاظ، وإعادة توجيه التدريب العملي على العمل. وبالنظر إلى المزايا التي تمنح، وكذلك في إمكانية الوصول والتنوع، ينبغي أن هذا المنبر تجد استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من المختبرات والتطبيقات وتكون مفيدة خاصة في تسهيل تحليل الخلايا والمحفزات التي تتوفر بكميات محدودة فقط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ويهدف هذا البروتوكول العام لدعم تطبيق منصة لمجموعة واسعة من الدراسات؛ يتم فصل جوانب محددة لدراسة ممثل وصفها في هذا التقرير بين قوسين ويوضح الشكل 2 دراسة ممثل نفذت باستخدام بروتوكول. لاحظ أنه في البروتوكول، وأتمتة كافة الأوامر "إرشاد" من خلال استخدام البرامج النصية محددة سلفا. لاحظ أيضا أن الخطوة 2 يمكن القيام بها بالتوازي مع الخطوة 1 (على سبيل المثال خلال خطوات 1.7 و 1.8)، وهذه الخطوة 2.1 في كثير من الأحيان تجاوزها (لأن منقوشة / المغلفة لوحات الجهاز DMF يمكن غسلها وإعادة استخدامها، وانظر الخطوة 5.2) .

1. تجميع وتعبئة الدوائر الإرواء الخليوي

  1. معطف السطوح الداخلية من تعقيمها (تعقيمها) microcapillaries (تنصهر السيليكا؛ 679 ميكرون OD، 534 معرف ميكرون؛ 15 سم) مع فبرونيكتين، وذلك بإعطاء تعليمات ضخ حقنة لرسم الحل فبرونيكتين العقيمة (30 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل) في كلmicrocapillary، يحتضنها (37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة)، تعليمات ضخ حقنة لسحب الحل، والسماح للmicrocapillaries الجافة (درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 6 ساعة).
  2. ربط كل فبرونيكتين المغلفة microcapillary (غرفة التروية) لأنابيب البولي (OD 500 ميكرون، 100 ميكرون معرف) والأنبوب إلى مضخة محقنة متعدد الميناء، وذلك باستخدام التجهيزات CapTite (6 غرف نضح، 8 منافذ ضخ حقنة).
  3. باستخدام الشريط، تأمين جسم كل غرفة نضح إلى كتلة الحرارة لتعيين درجة الحرارة المطلوبة (37 ° C).
  4. تزج نهايات مفتوحة للدوائر نضح في خزان (أنبوب أو microcentifuge وحة microtiter جيدا) الخلايا التي تحتوي على (P388D.1 الضامة الفئران) معلقة في متوسطة النمو الطازجة (RPMI-1640، FBS 10٪، 500 وحدة / مل البنسلين، 500 ميكروغرام / مل الستربتوميسين) في التركيز المطلوب (10 6 خلية / مل).
  5. إرشاد ضخ حقنة لرسم الخلايا (10 ميكرولتر، 10 4 خلايا) في كل غرفة نضح تليها بما فيه الكفاية لمنظمة العفو الدوليةr لتحريك المكونات السائلة (~ 4.5 سم) إلى قسم تأمين إلى كتلة الحرارة.
  6. تسمح للخلايا على الانضمام إلى الأسطح الداخلية فبرونيكتين المغلفة للدوائر نضح (37 درجة مئوية لمدة 1 - 2 ساعة). في غضون ذلك، نقل نهايات مفتوحة للدوائر نضح من الخزان الخلايا إلى خزان جديد يحتوي متوسطة النمو الطازجة.
  7. بعد فترة الالتزام، إرشاد ضخ حقنة لإرسال المقابس السائل (سائل الإعلام مكيفة والخلايا غير مرتبط) سدى، سحب متوسطة جديدة (10 ميكرولتر)، واتبع مع ما يكفي من الهواء لوضع سدادات سائلة جديدة (المتوسطة الطازجة) على مدى الالتزام الخلايا.
  8. مواصلة تنفيذ التبادلات المتوسطة (أي كرر الخطوة 1.7) على فترات منتظمة (كل 2 ساعة) حتى السكان الخلية هي معايرتها بما فيه الكفاية والموسع (16-24 ساعة من الثقافة على نطاق والصغرى ولدت من السكان ~ 1،000 خلية / غرفة).

2. تلفيق جهاز DMF وتجميع العمارة المحور

    14،29، نمط لوحة السفلي من الجهاز DMF مع ستة وأربعين الإنديوم أكسيد القصدير (ITO) أقطاب (سائق قطيرة يشتغل) بواسطة ضوئيه والحفر، ومعطف مع 5 ميكرون من Parylene-C و 50 نانومتر من تفلون-AF. تشكل لوحة العلوي من الجهاز DMF بواسطة طلاء على unpatterned ايتو الركيزة الزجاج مع تفلون-AF، على النحو الوارد أعلاه.
  1. باستخدام إطارات ضغط المعادن، إصلاح لوحات DMF إلى الزهر البوليمر 14،30 مع فترات الاستراحة التي تحافظ على تباعد ميكرون 400 بين لوحات، وهذا التباعد، جنبا إلى جنب مع حجم القطب يشتغل (2.5 مم 2)، يحدد حجم القطيرات (2.5 ميكرولتر في القطب). لاحظ أن DMF الجمعية يمكن أن يتحقق عن طريق ابسط 24.
  2. إدراج تفلون المغلفة نقل microcapillaries (360 ميكرون OD، 100 معرف ميكرون؛ 3،5-4،0 سم طويلة) في الفضاء بين لوحات DMF، وتحديد المواقع كل لتمتد إلى حافة القطب لها يشتغل وما شابه ذلك.
  3. إلى EN المعاكسد من كل نقل يضعوا microcapillary من المناسب CapTite.
  4. إشراك الموصلات الكهربائية لتزويد التيار الكهربائي إلى الأقطاب ايتو. يتم آليا تسلسل التنشيط الكهربائي من خلال استخدام واجهة الإلكترونية الكمبيوتر التي تسيطر عليها تشغيل البرامج النصية محددة سلفا.
  5. اختياري: حرك محور DMF تجميعها على خشبة المسرح متعدية من المجهر (SZ-6145TR (أوليمبوس، اليابان)) مجهزة بجهاز المسؤول عن جانب (CCD) كاميرا (DCR-HC96 (سوني، اليابان)) لتسهيل تتبع من قطرات 31

3. ربط الدوائر الإرواء إلى محور DMF وحفز السكان الخلية

  1. إزالة نهايات مفتوحة للدوائر نضح من الخزان المتوسطة (انظر الخطوة 1.6) وإدراجها في التجهيزات CapTite الملصقة على طرفي نقل microcapillaries من محور DMF (انظر الخطوة 2.4).
  2. إرشاد ضخ حقنة لإرسال المقابس السائل (سائل الإعلام مكيفة) في غرف نضح لنضيعه.
  3. انستruct محور DMF لرسم التحفيز (E. القولونية BioParticles في 100 ميكروغرام / مل في متوسطة جديدة مع 0.1٪ بلورونيك F127 ث / ت) من خزان على متن وتسليم قطرات من الحجم المناسب (10 ميكرولتر) إلى كل نقل microcapillary . وتتألف الخزانات على متن مقصورات على شكل أسطواني (1.5 × 1.5 سم لكل منهما) ومتصلا محور DMF عبر أنابيب.
  4. إرشاد ضخ حقنة لرسم التحفيز المقابس في نقل microcapillaries، واتبع مع ما يكفي من الهواء لوضع سدادات على السكان الخلية في غرف نضح.
  5. احتضان الخلايا مع التحفيز (37 درجة مئوية لمدة 1-4 ساعة). اختياري: صرف العملة لتحفيز الطازجة (أي تكرار خطوات 3،2-3،4) على فترات منتظمة.

4. إنهاء تحفيز واسترداد الخلية لست لتحليل

  1. اختياري: إذا كنت بحاجة لفترة ما بعد التحفيز، تبادل المقابس السائلة التي تحتوي على التحفيز لمتوسطة جديدة (أي تكرار خطوات 3،2-3.4، استبدال متوسطة جديدة لتحفيز)، والاستمرار في احتضان وتبادل حسب الحاجة.
  2. تبادل المقابس السائل في غرف نضح لغسل العازلة (مقدمة وحدة تحلل مباشر العازلة B) (أي تكرار خطوات 3،2-3،4، استبدال غسل العازلة للالتحفيز)، واحتضان حسب الحاجة (5 دقائق).
  3. تبادل المقابس السائل (غسل العازلة) للحصول على حل تحلل (مقدمة تحلل مباشر العازلة وحدة A مع 0.1٪ بلورونيك F127 ث / ت) (أي تكرار خطوات 3،2-3،4، استبدال حل تحلل لالتحفيز)، واحتضان حسب الحاجة (5 دقائق) .
  4. إرشاد ضخ حقنة لإرسال المقابس السائل (لست] خلية) إلى محور DMF.
  5. تفكيك محور DMF، وإزالة لوحة العلوي من الجهاز DMF (باستخدام الحرص على عدم إمالة لوحة جانبية، وهذا يمكن أن يؤدي إلى خلط الحبرية)، وجمع لست] باستخدام Pipetman أو حقنة للتحليل خارج منصة (الجينات التنميط التعبير عبر QPCR).

5. نظيفة وقطع غيار منهاجإعادة استخدام

  1. تزج نقل microcapillaries والتجهيزات CapTite في التبييض 10٪ (V / V في الماء) لمدة 10 دقيقة في RT، وشطف جيدا مع الماء منزوع الأيونات، والجاف باستخدام غاز النيتروجين.
  2. تزج لوحات الجهاز DMF في التبييض 10٪ لمدة 10 دقيقة في RT، وشطف جيدا مع الأيزوبروبانول يليه الماء منزوع الأيونات، والجاف باستخدام غاز النيتروجين تليها الخبز على 160 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. ضخ حقنة في أنابيب البولي، ويلقي البوليمر الجهاز DMF والإطار ضغط، ويمكن إعادة استخدامها دون تنظيف. يتم تجاهل نضح غرفة microcapillaries بعد كل تجربة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كدليل على منصة الآلي، ونحن استخدامه لإجراء دراسة في التي كانت تزرع المجموعات الصغيرة من الخلايا المناعية في الثقافات الصغيرة الحجم، تحدى مع البكتيريا، و lysed للتحليل خارج منصة من الردود المؤيدة للالتهابات (الشكل 2 ).

وكان المصنف كل من ستة غرف نضح الخلية مع 10 4 الخلايا المناعية (P388D.1 الضامة الفئران) معلق في 10 ميكرولتر من متوسط ​​النمو. بعد فترة الالتزام (37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة) وتبادل المتوسطة، وظلت ~ 500 الخلايا التي تعلق على الأسطح الداخلية في كل دائرة (الشكل 3A)، كما تم قياسها من خلال تحليل الثقافات الميكروسكيل تكرار (خلايا صدر عن طريق علاج خالب وعدها عبر عدادة الكريات والمجهر الضوئي). مزيد من التوسع الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة، مع تبادل المتوسطة في 2 فترات الموارد البشرية، والسكان الخلية إلى ~ 1،000 خلايا لكل غرفة (الشكل 3B) (ال مقاسا تحليل الخام من الثقافات الميكروسكيل تكرار، كما هو موضح أعلاه). في أربع من الدوائر نضح ستة، وقد تم الطعن على السكان الخلية مع E. البكتيريا القولونية (BioParticles pHrodo)، معلق في متوسطة النمو، وتسليمها في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 20 (أي وطعن كل خلية في عدد السكان مع 20 BioParticles، في المتوسط). في الغرفتين المتبقية، تلقى السكان الخلية تحديا وهمية (أي متوسط ​​النمو فقط). بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (ثقافتين البكتيريا تحدى) أو 4 ساعات (اثنان البكتيريا التي تواجه تحديات، واثنين وهمية تحدى والثقافات)، وكانت تغسل الخلايا و lysed، ولست] تعافى من محور DMF. استخدمت طرق على نطاق ومقاعد البدلاء التقليدية لإعداد [كدنا] من لست]، وقياس مستويات النص للوسطاء التهاب: كيموكينات MIP-1β (CCL4) وRANTES (CCL5)، محرض انزيمات الأكسدة الحلقية COX-2 (PTGS2)، وخلوى TNFα (TNF ).

يلخص> الشكل 4 نتائج من ثلاث تجارب تكرارها بشكل مستقل. وجدنا أن الخلايا المناعية نمت وتحدى في الثقافات الصغيرة الحجم (الحانات الحمراء) التي شنت استجابات النسخي الموالية للالتهابات التي كانت أساسا مطابقة لتلك التي أثارت في الخلايا المزروعة وتحدى في الثقافات التقليدية (أشرطة زرقاء). وعلاوة على ذلك، أظهرت على منصة (الصغيرة الحجم) التجارب أقل تقلب (كما يتبين من أشرطة الخطأ أصغر) وتستهلك كميات أقل من خلايا والكواشف (الجدول 1).

الشكل 1
الشكل 1. صورة لمنصة الآلي للمايكرو مقياس تجارب تحفيز الخلية.

الشكل 2
الشكل 2. نظرة عامة على الممثل تجربة منصة تمكين: النسخي لخلايا المناعة تحدى مع البكتيريا في الثقافات الصغيرة الحجم.

الشكل (3)
الشكل (3). صور لخلايا المناعة مثقف في غرفة نضح الصغيرة الحجم. كان معلق الضامة الفئران (P388D.1 خط الخلية) في متوسط ​​النمو عند تركيز 10 6 خلية / مل، و 10 ميكرولتر (10 4 خلايا) المستخدمة في البذور وفبرونيكتين المغلفة microcapillary (غرفة التروية). وقد أخذت الصور مشرق الميدان باستخدام مجهر MVX10 (أوليمبوس) مجهزة بكاميرا CCD (Qimaging). لقياس حجم السكان، وأفرج عن الخلايا من تكرار الثقافات الصغيرة الحجم من السطوح غرفة نضح باستخدام المتعرية الخليوي، ملطخة باستخدام التريبان الأزرق، وعدها باستخدام عدادة الكريات والمجهر الضوئي. A. B. بعد 16 ساعة من ثقافة (الحضانة عند 37 درجة مئوية مع تبادل المتوسطة كل 2 ساعة)، وكان السكان توسعت إلى ~ 1،000 الخلايا.

الشكل 4
الشكل 4. الملامح النسخي لخلايا المناعة مثقف وحفزت في السفن التقليدية مقابل الدوائر الإرواء الصغيرة الحجم. كان معلق الضامة الفئران (P388D.1 خط الخلية) في متوسط ​​النمو عند تركيز 10 6 خلية / مل. للثقافات التقليدية، واستخدمت 50 ميكرولتر (5 × 10 4 خلايا) إلى البذور 150 ميكرولتر من متوسط ​​النمو في بئر من لوحة microtiter 96-جيدا؛ للثقافات الصغيرة الحجم، و 10 ميكرولتر (10 4 خلايا) كانت تستخدم لبذور وmicrocapil فبرونيكتين المغلفةاري (غرفة التروية). بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة، وقد تم الطعن الخلايا (~ 5 × 10 4 في الثقافة التقليدية، ~ 10 3 في الثقافة على نطاق والصغرى) مع E. البكتيريا القولونية (BioParticles pHrodo) في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 20 (أي، 20 BioParticles لكل خلية في الثقافة)؛ سيطرة سلبية (وهمية تحدى) الثقافات وردت وسائل الإعلام الجديدة فقط. بعد مزيد من الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 أو 4 ساعات، وكانت تغسل الخلايا و lysed باستخدام الكواشف من مقدمة وحدة تحلل المباشر. تم تضخيم الحمض النووي الريبي المحللة وتحويلها إلى [كدنا] باستخدام الحفاوة PicoSL WTA، و(≥ 200 NT) المنتجات [كدنا] أكبر تنقيتها باستخدام Agencourt RNAClean XP، وهذه المنتجات تستخدم في قالب TaqMan فحوصات QPCR لقياس مستويات النص لMIP-1β (CCL4)، RANTES (CCL5)، COX-2 (PTGS2)، وTNFα (TNF)، وكذلك GAPDH (لتطبيع مستويات [كدنا] بين لست]). وأجري فحص كل QPCR في ثلاث نسخ، وبلغ متوسط ​​النتائج. EAالتجربة CH تم تكرارها بشكل مستقل ثلاث مرات. قضبان تشير أضعاف متوسط ​​الزيادة في مستويات النص في الثقافات التقليدية (الازرق) أو الثقافات على نطاق والصغرى (الحمراء) تحدى مع البكتيريا، بالمقارنة مع سيطرة السلبية (وهمية تحدى) الثقافات؛ أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري عبر التجارب الثلاث.

مطلب التجربة التقليدية التجربة الصغيرة النطاق
الخلايا 3،000،000 60،000
نمو متوسط 2.4 مل 0.7 مل
BioParticles 200 ميكروغرام 4 ميكروغرام
غسل وتحلل الكواشف 300 ميكرولتر كل 60 ميكرولتر كل

الجدول 1. متطلبات التقليدية مقابل الصغرى، مقياس التجربة تحفيز الخليوييتم رسمها ق. أرقام من التجربة ممثل وصفها في هذا التقرير (الشكل 2)، والتي كانت تزرع الضامة الفئران (P388D.1 خط الخلية) في ستة التقليدية (96 جيدا وحة microtiter) مقابل الصغيرة الحجم (غرفة التروية) الثقافات ، تحدى مع E. البكتيريا القولونية (BioParticles pHrodo) في وزارة الداخلية من 20، و lysed لتحليل QPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد قمنا بتطوير منصة بسيطة وتنوعا الآلي للثقافة الخلية الصغيرة الحجم والتجارب التحفيز. منصة تمكننا من العمل مع وحدات التخزين الصغيرة وثقافة السكان الخلية (1-20 ميكرولتر و 100 - 2،000 خلايا، لكل غرفة)؛ الأحجام ثقافة يمكن تخفيض أكبر من خلال استخدام microcapillaries من قطر أصغر. يعمل في هذه المقاييس يقلل من تكلفة الدراسات الروتينية ويجعل دراسات جدوى التي تتطلب استخدام الكواشف الثمينة و / أو الخلايا. تظهر التجارب التي تنفذها منصة أيضا أقل تقلباته، ويفترض أن يعود إلى الدقة والتكاثر التي يتم التعامل مع الخلايا والسوائل عن طريق المنصة الآلي.

التكوين الحالي للمنصة توجه الخلايا وسائل الإعلام من خارج المجلس الخزانات (أنابيب microcentrifuge أو عيار مكروي لوحة الآبار) للبذار، موازنة، وتوسيع السكان الخلية في غرف نضح. هذا هو وسيلة بسيطة لمعالجة عدم تطابق بينمتطلبات النمو المتوسطة (على سبيل المثال 700 ميكرولتر المستهلكة في التجربة ممثل المذكورة أعلاه) وقدرة الجهاز DMF من على متن الخزانات (24 ميكرولتر لكل منهما). ومع ذلك، هذا التكوين يتطلب منتصف تجربة التدخل اليدوي، للتبديل بين اثنين من الخزانات (الخطوة 1.6) وتوصيل الدوائر نضح إلى محور DMF (الخطوة 3.1). ويمكن أن تشمل تكوينات المستقبل ذات قدرة كبيرة (على سبيل المثال 1 مل) على متن الخزانات، والتي من شأنها أن تمكن التوجيه لجميع المواد من خلال محور DMF، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى منتصف تجربة التدخل اليدوي.

تجاربنا المطلوبة فقط على المدى القصير ثقافة (<24 ساعة) من الخلايا على المنصة. لقد التحقق من أن بقاء الخلية على منصة هي مماثلة لتلك في الثقافات التقليدية لمدة 24 ساعة على الأقل (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، ونحن لم تحاول حتى الآن للحفاظ على الثقافات على منصة لفترات أطول من الوقت. التبخر ليس مصدر قلق كبير لأن المنبرغرف نضح والخزانات المتوسطة النمو هي أنظمة مغلقة جزئيا ويتم تجديد موارد المقابس السائل الذي يغطي الخلايا بسهولة عبر تبادل المتوسطة. من ناحية أخرى، للحفاظ على درجة الحموضة في الثقافات على المدى الطويل قد يكون من الضروري لإيواء الخزانات المتوسطة النمو في 5-10٪ CO 2 جو أو التحول إلى وسيلة النمو الذي لا يتضمن CO-2 بيكربونات درجة الحموضة عازلة مقرها . بالإضافة إلى ذلك، فإن الثقافة على المدى الطويل من تقسيم الخلايا بنشاط توسيع السكان إلى نقطة confluency (أي تغطية جميع الأسطح المتاحة داخل غرفة نضح)، مما يستلزم الركض الخلايا (نشرة، وغسل، وتمييع، وإعادة البذور) . قد أنجزت الآخرين في هذه الأنظمة ميكروفلويديك 3،5،6،9،17 وفي شكلها الحالي منصة ينبغي أن تكون قادرة على تنفيذ كل من التلاعب المطلوبة. وباختصار، فإننا نتوقع أنه مع التعديل متواضعة (في المقام الأول إلى البروتوكولات، بدلا من الأجهزة) منصة لدينا يجب أن تكون جapable من دعم الثقافة خلايا الثدييات على المدى الطويل. ويبدو أن هذا اتجاها واعدا خصوصا المستقبل، لأن الأساليب التقليدية تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة؛ مضيفا قدرة الثقافة على المدى الطويل إلى ذخيرة من برنامجنا الآلي مزيد من تمكين مستخدميها إلى إعادة توجيه عملهم بشكل أكثر إنتاجية.

على الرغم من أننا قد اختبرت سوى عدد قليل من أنواع مختلفة من الخلايا حتى الآن (مثل الفئران خط خلية بلعم RAW264.7؛ الفئران نخاع العظام المستمدة الضامة (BMDM))، يجب أن تكون منصة قادرة على استيعاب تقريبا أي نوع من الخلايا الملتصقة. في بعض الحالات، قد يكون من الضروري تغيير طلاء غرفة نضح من فبرونيكتين إلى عنصر المصفوفة خارج الخلية آخر (أو خليط من المكونات)، أو لتغيير متوسطة النمو، ولكن مصنوعة بسهولة هذه التعديلات. يمكن أن تعمل مع أنواع الخلايا غير ملتصقة تكون أكثر تحديا، ولكن كانت استراتيجيات الربط خلية ناجحة في سياقات مماثلة 32-34. فإنه SHOULD أيضا يكون من الممكن لخلق ثقافات مختلطة تتألف من أنواع خلايا متعددة، بل ينبغي أن الدقة التي منصة يعالج الخلايا والسوائل ضمان بناء الثقافات المختلط هو تكرار للغاية.

وفيما يتعلق المحفزات، ينبغي تقريبا أي مادة التي يمكن نقلها ضمن المكونات السائلة مائي تكون متوافقة مع منصة لدينا 5،13،16،35. في حالة الجزيئات الكبيرة أو الكثيفة، والتي يمكن أن يستقر مع مرور الوقت، قد يكون من الضروري ل resuspend دورية لهم داخل الخزانات؛ في الماضي، ونحن قد عالجت هذه القضية من خلال استخدام عالي الكثافة الناقل السائل 36 أو الانفعالات بسيطة نظام (لا تظهر البيانات)، والحلول التي ينبغي أن تكون سهلة التنفيذ على منصتنا.

حتى الآن، لدينا توصيف الخلايا المستزرعة، وحفزت على منصة ركزت في المقام الأول على تحليل QRT-PCR من السمة المميزة الردود المؤيدة للالتهابات. كخطوة والتحليل الشامل القادم من رانه Transcriptome على السكان الخلية (عبر ميكروأرس الحمض النووي أو الجيل تسلسل (SGS) (أي تسلسل الحمض النووي الريبي 37،38))، ما يرام في متناول؛ مع التعديل متواضعة من الخطوة إعداد [كدنا]، وينبغي أن لدينا منصة والبروتوكولات تكون قادرة تماما على دعم عالمي دراسات النسخي. وبالمثل، ينبغي تحليل استجابات السكان الخلية في مستوى البروتين (عن طريق ELISA، مناعي، قياس الطيف الكتلي، أو ميكروأرس البروتين) تتطلب التعديل فقط من خطوات إعداد المحللة. تدعم منصة أيضا التحليل القائم على التصوير من استجابات الخلايا. ولا يمكن تصوير الخلايا داخل غرفة نضح (على سبيل المثال الشكل 3)، وكان استخدام على السطح شقة (بدلا من تقريب) microcapillaries من أجل وحدة غرفة نضح تسهيل هذا النوع من التحليل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تصوير الخلايا على DMF محور 14،15، قبل زرع البذور من الدوائر نضح و / أو بعد الإفراج عنهم. كما يجوز تصوير الخلايا سراح الخروج منالمنصة. حتى الآن، وقد استخدمنا المجهر الضوئي ومضان إلى الخلايا صورة في كل مرحلة من هذه المراحل من أجل تحليل مورفولوجيا بهم، والسلامة، ومعدل الانتشار، والتفاعلات المادية مع المثيرات (مثل BioParticles) وبعضها البعض (لا تظهر البيانات). المجهر أيضا ينبغي أن تمكن من تحليل محتوى الأيض (تقييمها من خلال استخدام الأصباغ الفلورية)، والنشاط النسخي (تقييمها من خلال استخدام بنيات مراسل)، ومستويات بروتين / التعريب (تقييمها من خلال استخدام بنيات مراسل، فلوري بنيات انصهار بروتين، و / أو مناعية ). يمكن تحليل الخلايا أفرج عنه باستخدام التدفق الخلوي أيضا. العديد من هذه التحليلات يمكن تنفيذها كليا على منصة في شكلها الحالي، والبعض الآخر يتطلب تحليل خارج منصة أو دمج وحدات متخصصة مقرها على microfluidics (على سبيل المثال انظر المراجع 36،39-41) في منصة عبر اتصال DMF محور. أخذت معا، ويبدو من المرجح رسوف قبعة برنامجنا تثبت قيمة في تمكين تحليل متعدد الأبعاد من المجموعات الصغيرة من الخلايا، التي على خلاف ذلك لا يمكن أن يتحقق إلا من خلال استخدام أنظمة روبوتية معقدة جدا ومكلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

المؤلفان بالشكر رونالد F. رينزي ومايكل S. بارتش لمساهماتها في مجال تصميم وتطوير أجهزة DMF والمحور DMF. وأيد هذا البحث بالكامل من قبل مختبر إخراج برنامج البحوث والتنمية في مختبرات سانديا الوطنية. سانديا هو مختبر برنامج متعدد إدارتها وتشغيلها من قبل شركة سانديا، وهي شركة تابعة مملوكة بالكامل لشركة لوكهيد مارتن كوربوريشن، عن وزارة الخارجية الأمريكية في إدارة الأمن النووي الوطنية للطاقة بموجب عقد DE-AC04-94AL85000.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Prelude Direct Lysis Module NuGEN 1400-24
Trypan Blue (0.4% w/v) GIBCO 15250-061
Cell Stripper Cellgro 25-056-C1
Ovation PicoSL WTA NuGEN 3310-048
Agencourt RNAClean XP Beckman Coulter Genomics A63987
pHrodo BioParticles Invitrogen P35361
CCL4 TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm00443111_m1
CCL5 TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm01302428_m1
PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm00478374_m1
TNF TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm00443258_m1
GAPDH TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm99999915_g1
Pluronic F127 Sigma Chemical 2594628
Fluorinert FC-40 Sigma Chemical 51142-49-5
Parylene C dimer Specialty Coating Systems 28804-46-8
Teflon-AF DuPont AF1600
Polyimide tape ULINE S-11928
Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates Delta Technologies CB-40IN-1107
DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries Polymicro Technologies TSU100375
Perfusion chamber microcapillaries Polymicro Technologies TSP530700
Tubing and microcapillary fittings Sandia National Laboratories
Polycarbonate tubing Paradigm Optics CTPC100-500-5
8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes Hamilton Company 54848-01
Parylene-C vapor deposition instrument Specialty Coating Systems PDS 2010 Labcoter 2
High-voltage function generator Trek 615A-1 615-3
MVX10 microscope Olympus Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)
QIClick digital CCD camera QImaging QIClick-F-CLR-12 Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
  2. Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. Microfluidic devices for bioapplications. Small. 7, 12-48 (2011).
  3. Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
  4. Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
  5. Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
  6. Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
  7. Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
  8. Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
  9. Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
  10. King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
  11. Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
  12. Wheeler, A. R. Chemistry - Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
  13. Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
  14. Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
  15. Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
  16. Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
  17. Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
  18. Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
  19. Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
  20. Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
  21. Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
  22. Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
  23. Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
  24. Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
  25. Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
  26. Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
  27. Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R. Digital microfluidics. Annual Review of Analytical Chemistry. 5, 413-440 (2012).
  28. Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
  29. Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , Submitted (2012).
  30. Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
  31. Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
  32. Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
  33. Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
  34. Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
  35. Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
  36. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
  37. Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
  38. Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
  39. Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
  40. Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 78، الهندسة الطبية الحيوية، علم الأحياء الخلوية والبيولوجيا الجزيئية وعلم الأحياء الدقيقة، الفيزياء الحيوية، الكيمياء الحيوية، تقنية النانو، والتصغير، التكنولوجيات الدقيقة، وتقنيات زراعة الخلايا، الموائع الدقيقة، التفاعلات المضيف الممرض، زراعة الخلايا الآلي، وتحفيز الخلية، استجابة الخلية، خلية خلية التفاعلات، على microfluidics الرقمية، مايكروسيستمز التكامل، ثقافة الخلية
A منصة الآلي تنوعا للتجارب تحفيز الخلية الصغيرة الحجم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sinha, A., Jebrail, M. J., Kim, H.,… More

Sinha, A., Jebrail, M. J., Kim, H., Patel, K. D., Branda, S. S. A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments. J. Vis. Exp. (78), e50597, doi:10.3791/50597 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter