Summary
Nós desenvolvemos uma cultura de células automatizado e uma plataforma de interrogação para experiências de estimulação de células micro-escala. A plataforma oferece um controle simples, versátil e preciso para cultivar e estimular pequenas populações de células e recuperar lisados para análises moleculares. A plataforma é bem adequado para os estudos que utilizam células preciosos e / ou reagentes.
Abstract
Estudo de células em cultura (análise in vitro) forneceu importantes insights sobre sistemas biológicos complexos. Os métodos convencionais e equipamentos para a análise in vitro são bem adequados ao estudo de um grande número de células (≥ 10 5) em volumes mililitro escala ≥ (0,1 ml). No entanto, há muitos casos em que é necessário ou desejável reduzir a dimensão de tamanho para reduzir o consumo de cultura das células de interesse e / ou os reagentes necessários para a sua cultura, a estimulação ou processamento. Infelizmente, as abordagens convencionais não suportam manipulação precisa e reprodutível de culturas micro-escala, e os sistemas automatizados baseados em microfluídica atualmente disponíveis são muito complexos e especializados para uso de rotina pela maioria dos laboratórios. Para resolver este problema, foram desenvolvidos uma plataforma de tecnologia simples e versátil para a cultura automatizado, estimulação e recuperação de pequenas populações de células (100 - 2000 células) no volume de micro-escalas (1 - 20 ul). A plataforma é constituído por um conjunto de microcapilares revestidos com fibronectina ("câmaras de perfusão de células"), no qual as culturas de micro-escala são estabelecidos, mantida e estimulada, um dispositivo digital de microfluidos (DMF) equipado com "transfer" microcapilares ("hub central "), que as células e reagentes rotas de e para as câmaras de perfusão, uma bomba de seringa de alta precisão, que o transporte de materiais de poderes entre as câmaras de perfusão eo hub central, e uma interface eletrônica que fornece controle sobre o transporte de materiais, o que é coordenado e automatizados via pré-determinados scripts. Como um exemplo, utilizou-se a plataforma para facilitar o estudo de respostas eliciadas transcrição em células imunes ao desafio com bactérias. A utilização da plataforma permitiu-nos a reduzir o consumo de células e reagentes, minimizar a variabilidade experiência para experiência e reorientar as mãos sobre o trabalho. Dadas as vantagens que ela confere, assim como a sua acessibilidade e versatilidade, oplataforma ur deve encontrar o uso em uma ampla variedade de laboratórios e aplicações, e revelar-se especialmente útil para facilitar a análise de células e os estímulos que estão disponíveis apenas em quantidades limitadas.
Introduction
O estudo de células mantidas em cultura (análise in vitro) forneceu uma visão valiosa sobre os princípios fundamentais e os mecanismos moleculares que regem os sistemas biológicos complexos ea saúde humana. Os métodos convencionais de cultura, estimulação e coleta de células para análise, que utilizam placas de Petri e placas de poliestireno, foram projetados para o estudo de grandes populações de células (≥ 10 5) em volumes de cultura mililitro escala (≥ 0,1 ml). No entanto, há muitos casos em que apenas quantidades limitadas de células estão disponíveis (por exemplo, as células primárias), ou de pequenas populações de células são desejáveis (por exemplo, para reduzir a variabilidade de-célula através da população), ou os reagentes necessários são de difícil obtenção ou proibitivamente caro (por exemplo, células purificadas fatores secretados). Tais questões podem ser abordadas com sucesso pelo redimensionamento tamanho cultura, que tem a vantagem de reduzir o consumo de todos osOs reagentes necessários para a análise in vitro, em 1,2. Infelizmente, equipamentos e métodos convencionais não suportam manipulação precisa e reprodutível de culturas micro-escala e os sistemas automatizados baseados em microfluídica atualmente disponíveis 3-11 são muito complexas e especializadas para uso de rotina pela maioria dos laboratórios.
Neste relatório, nós descrevemos a montagem e utilização de uma plataforma de tecnologia simples e versátil para a cultura automatizada, estimulação e recuperação de pequenas populações de células (100 - 2000 células) em volumes micro-escala (1-20 mL). A arquitetura da plataforma (Figura 1) é um projeto modular: um conjunto de fibronectina revestido microcapilares ("câmaras de perfusão de células" Módulo), que serve como local para o estabelecimento, manutenção e estimulação das culturas micro-escala, e uma microfluídica digital (DMF ) 12,13 dispositivo equipado com "transfer" microcapilares (módulo central "hub") 14,15 células rotase reagentes de e para as câmaras de perfusão. DMF permite ao usuário resolver individualmente várias gotas em simultâneo e de alterar ou re-ordenar as manipulações (ou seja, os trens de processamento de amostras reconfigurar) sem alterar o hardware do dispositivo. A sua grande flexibilidade é evidente em seu surgimento recente como uma tecnologia chave numa vasta gama de aplicações, incluindo a cultura da célula 16,17 18,19 ensaios enzimáticos, os imunoensaios 20,21, 22,23 A análise do DNA, o processamento de proteínas, 24,25 e processamento de amostras clínicas. 26,27 Nossa cubo central aproveita a flexibilidade inerente aos dispositivos de DMF, e aumenta ainda mais através da adição de interfaces de microcapilares, que proporciona oportunidade para a realização de um subconjunto de manipulações (por exemplo, cultura de células) em periférico especializado módulos, em vez de no próprio dispositivo de DMF. A compartimentalização dos comboios de processamento deste modo também simplifica a concepção do plaarquitetura TForm (não é necessário para construir um dispositivo DMF que pode realizar todas as etapas de processamento) e facilita a sua evolução à medida que novas funções são necessárias (simplesmente integrar novos módulos periféricos como necessário). Transporte de células e reagentes dentro do cubo central é accionado por electrowetting forças geradas pela activação sequencial dos eléctrodos no interior do dispositivo de DMF 13,28; transporte para, de e no interior das câmaras de perfusão é alimentado por alterações de pressão geradas por uma seringa de alta precisão bomba. Todos esses movimentos fluidos são controlados através de uma interface eletrônica simples e automatizado através da utilização de pré-determinados scripts.
Como um exemplo representativo, que demonstram a utilização da plataforma para o estudo das respostas da transcrição induzida em células do sistema imune após o desafio com bactérias (Figura 2). Realizar esses experimentos na plataforma nos permitiu trabalhar com um pequeno número de células (~ 1.000 por experimentaçãotal condição), para minimizar a variabilidade experiência-to-experimento, reagentes conservar e re-direta hands-on de trabalho. Dadas as vantagens que ela confere, assim como a sua acessibilidade e versatilidade, esta plataforma deve encontrar utilização numa ampla variedade de aplicações e de laboratórios e ser especialmente útil para facilitar a análise de células e os estímulos que estão disponíveis em quantidades limitadas.
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Protocol
Este protocolo geral é concebida para suportar a aplicação da plataforma para uma ampla variedade de estudos, aspectos específicos do estudo representativo descrito neste relatório são separados em suportes Figura 2 ilustra um estudo representativo realizado utilizando o protocolo.. Note-se que no protocolo, todos os "instruir" os comandos são automatizados através do uso de pré-determinados scripts. Note também que o Passo 2 pode ser efectuado em paralelo com o Passo 1 (por exemplo, durante os Passos 1.7 e 1.8), e que é muitas vezes Passo 2.1 contornado (porque as placas do dispositivo modelado DMF / revestido pode ser lavado e reutilizado, ver Passo 5.2) .
1. Montar e preencher as Câmaras de Perfusão celulares
- Revestir as superfícies interiores das esterilizado (autoclavado) microcapilares (sílica fundida; od 679 uM, 534 uM ID; 15 cm de comprimento), com a fibronectina, por instruir a bomba de seringa para estabelecer uma solução estéril de fibronectina (30 ul de 50 ug / ml) em cadamicrocapilar, incubação (37 ° C durante 2 horas), instruindo a bomba de seringa para retirar a solução, e deixando o microcapilares seco (temperatura ambiente (RT), durante 6 h).
- Conecte cada fibronectina revestido microcapilar (câmara de perfusão) para tubos de policarbonato (500 mM od, ID 100 mm) e da tubulação para a bomba de seringa multi-porta, usando acessórios CapTite (6 câmaras de perfusão, de 8 portas bomba de seringa).
- Utilizando fita, proteger o corpo de cada câmara de perfusão para um bloco de aquecimento até à temperatura definida desejada (37 ° C).
- Mergulhar as extremidades abertas das câmaras de perfusão em um reservatório (microcentifuge tubo ou placa de microtitulação) células contendo P388D.1 (macrófagos murinos) suspensas em meio de crescimento fresco (RPMI-1640, 10% FBS, 500 unidades / ml de penicilina, 500 ug / mL de estreptomicina) a concentração desejada (10 6 células / ml).
- Instruir a bomba de seringa para extrair células (10 uL, 10 4 culas) em cada câmara de perfusão seguido por ai suficienter para mover o tampão líquido (~ 4,5 cm) para a secção fixada ao bloco de calor.
- Permitir que as células a aderir às superfícies internas revestidas com fibronectina das câmaras de perfusão (37 ° C durante 1 - 2 h). Ao mesmo tempo, transferir as extremidades abertas das câmaras de perfusão a partir do reservatório de células para um novo reservatório contendo meio de crescimento fresco.
- Após o período de adesão, instruir a bomba de seringa para enviar as fichas líquidos (meios condicionados e células acopladas) para o lixo, retirar meio fresco (10 ml), e seguir com ar suficiente para posicionar os novos plugues líquidos (meio fresco) sobre o aderido células.
- Continuar a realizar trocas médio (ou seja, repita o Passo 1.7) em intervalos regulares (a cada 2 horas) até as populações de células são suficientemente equilibrada e expandido (16 - 24 horas de micro-escala da cultura de populações gerados ~ 1.000 células / Câmara).
2. Fabricar o dispositivo de DMF e montar o Hub Architecture
- Uso de quadros de metal de compressão, fixar as placas de DMF em um molde de polímero 14,30 com recessos que mantêm o espaçamento de 400 um entre as chapas, o espaçamento, combinada com o tamanho do eléctrodo de accionamento (2,5 mm 2), define o volume de gotas (2,5 ul por eletrodo). Note-se que a montagem de DMF pode ser conseguida por meios mais simples 24.
- Inserir revestida de Teflon transferência microcapilares (360 mM OD, 100 uM ID; 3,5-4,0 cm de comprimento) para o espaço entre as placas de DMF, posicionando cada um para o rebordo do seu eléctrodo de accionamento cognato.
- Para o en opostod de cada transferência apor microcapilar um encaixe CapTite.
- Envolver os conectores elétricos para tensão de alimentação para os eletrodos de ITO. Seqüências de ativação de eletrodos são automatizados através do uso de uma interface eletrônica controlada por computador funcionando pré-determinados scripts.
- Opcional: Mova o hub DMF montada no palco de translação de um microscópio (SZ-6145TR (Olympus, Japão)) equipado com um dispositivo de carga acoplada (CCD) da câmera (DCR-HC96 (Sony, Japão)) para facilitar o rastreamento de gotículas 31.
3. Ligue as câmaras de perfusão para o Hub DMF e estimular a populações de células
- Remover as extremidades abertas das câmaras de perfusão do reservatório de meio (ver Passo 1.6) e inseri-los nos encaixes CapTite apostos nas extremidades da transferência microcapilares do cubo DMF (ver Passo 2.4).
- Instrua a bomba de seringa para enviar as fichas líquidos (meios condicionados) nas câmaras de perfusão para o lixo.
- Instruct o cubo DMF para desenhar estímulo (E. coli biopartículas a 100 ug / ml em meio fresco com 0,1% de Pluronic F127 w / v) a partir de um reservatório de bordo e proporcionar uma gota de dimensão adequada (10 ul) para cada transferência microcapilar . Os reservatórios de bordo são constituídos por compartimentos em forma cilíndrica (1,5 x 1,5 cm cada) e ligado ao cubo por meio da tubagem de DMF.
- Instruir a bomba de seringa para extrair o estímulo conecta à transferência de microcapilares, e seguir com ar suficiente para posicionar os tampões sobre as populações de células nas câmaras de perfusão.
- Incubar as células com estímulo (37 ° C durante 1-4 horas). Opcional: Troca de estímulo fresco (ou seja, repita os passos 3,2-3,4) em intervalos regulares.
4. Terminar Estimulação e recuperar lisados celulares para Análise
- Opcional: Se é necessário um período de pós-estimulação, trocar as fichas contendo estímulo líquido por meio fresco (ou seja, repita os passos 3,2-30,4, substituindo meio fresco para o estímulo), e continuar a incubar e trocar, se necessário.
- Troca as fichas líquidos nas câmaras de perfusão para tampão de lavagem (Prelude Lise direto Módulo tampão B) (ou seja, repita os passos 3,2-3,4, substituindo o tampão de lavagem de estímulo), e incubar conforme necessário (5 min).
- Troca as fichas líquidos (tampão de lavagem) para a solução de lise (Prelude direto Lise módulo A, com 0,1% Pluronic F127 w / v) (ou seja, repita os passos 3,2-3,4, substituindo solução de lise de estímulo), e incubar conforme necessário (5 min) .
- Instruir a bomba de seringa para enviar os tampões líquidos (lisados de células) para o centro de DMF.
- Desmontar o cubo DMF, remover a placa de topo do dispositivo de DMF (tomando cuidado para não inclinar a placa de lado, como o que pode resultar em gotículas de mistura), e recolher os lisados usando um Pipetman ou seringa para análise off-plataforma (perfil de expressão do gene através qPCR).
5. Limpo Plataforma de Hardware paraRe-use
- Imergir a transferência microcapilares e acessórios CapTite em lixívia a 10% (v / v em água) durante 10 min à TA, lave bem com água desionizada, e seco usando gás azoto.
- Mergulhar as placas do dispositivo de DMF em lixívia a 10% durante 10 min à RT, enxaguar bem com isopropanol e depois com água desionizada, e utilizando gás de azoto seco, seguido por cozedura a 160 ° C durante 10 min.
- Policarbonato tubulação da bomba de seringa, e elenco polímero do dispositivo DMF e quadro de compressão, pode ser reutilizado sem limpeza. A câmara de perfusão microcapilares são descartados após cada experimento.
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Representative Results
Como uma demonstração da plataforma automatizada, que utilizado para levar a cabo um estudo em que as pequenas populações de células imunitárias foram cultivados em culturas em micro-escala, desafiado com bactérias, e lisadas para análise off-plataforma de respostas pró-inflamatórias (Figura 2 ).
Cada uma das seis câmaras de perfusão de células foi semeada com 10 4 P388D.1 células imunitárias (macrófagos murinos) foram ressuspensas em 10 ul de meio de crescimento. Após um período de adesão (37 ° C durante 2 horas) e uma troca de meio, ~ 500 células permaneceu ligado às superfícies interiores de cada uma das câmaras (Figura 3A), como medido através da análise das culturas replicadas microescala (células libertado por tratamento quelante e contadas via hemocitômetro e microscopia de luz). Mais incubação à temperatura de 37 ° C durante 16 horas, com trocas de meio com intervalos de 2 horas, as populações de células expandidas para ~ 1.000 células por câmara (Figura 3B) (th como medidoanálise geral das culturas microescala idênticos, como descrito acima). Em quatro dos seis câmaras de perfusão, as populações de células foram desafiados com E. coli (pHrodo biopartículas), ressuspensas em meio de crescimento, e entregue a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20 (ou seja, cada célula da população foi desafiada com 20 biopartículas, em média). Nas restantes duas câmaras, as populações de células receberam um desafio simulado (isto é, só de meio de crescimento). Após incubação a 37 ° C durante 1 hora (duas culturas de bactérias desafiados) ou 4 horas (duas bactérias-desafiado e dois falsamente desafiadas, culturas), as células foram lavadas e lisadas e os lisados recuperados a partir do cubo de DMF. Métodos convencionais em escala de bancada foram utilizados para preparar cDNA a partir dos lisados e, para medir os níveis de transcrição de mediadores da inflamação Quimiocinas: MIP-1β (CCL4) e RANTES (CCL5), ciclo-oxigenase induzível COX-2 (PTGS2), TNFa e citocina (TNF ).
A Figura 4 resume os resultados de três experiências replicadas de forma independente. Descobrimos que as células imunes crescido e desafiou em culturas de micro-escala (barras vermelhas) montado respostas de transcrição pró-inflamatórios que eram essencialmente idênticas às atingida em células cultivadas e desafiou em culturas convencionais (barras azuis). Além disso, as plataformas (em micro-escala) experiências mostraram menor variabilidade (como indicado pelas barras de erro mais pequenos) e consumidas quantidades menores de células e reagentes (Tabela 1).
Figura 1. Fotografia da plataforma automatizada para micro-escala experiências de estimulação de células.
Figura 2. Visão geral de um representante Platform Experiment-Enabled: perfil transcricional de células imunes desafiados com bactérias em culturas de micro-escala.
Figura 3. De fotografias de células imunes cultivadas numa câmara de perfusão micro-escala. P388D.1 macrófagos de murino (linha de células) foram ressuspensas em meio de crescimento a uma concentração de 10 6 células / ml, e 10 ul (10 4 culas) usado para semear um fibronectina microcapilar revestido (câmara de perfusão). Fotografias Bright-campo foram feitas usando um microscópio MVX10 (Olympus) equipado com uma câmera CCD (Qimaging). Para medir o tamanho da população, as células de replicar culturas micro-escala foram liberados das superfícies da câmara de perfusão com Stripper celular, corados com azul de tripano, e contou com um hemocitômetro e microscópio de luz. A. B. Após 16 horas de cultura (incubação a 37 ° C com meio de intercâmbios cada 2 horas), a população havia crescido para ~ 1.000 células.
Figura 4. Perfis de transcrição de células imunes cultivadas e estimuladas in navios convencionais contra Chambers Perfusão em micro-escala. P388D.1 macrófagos de murino (linha de células) foram ressuspensas em meio de crescimento a uma concentração de 10 6 células / ml. Para culturas convencionais, 50 ul (5 x 10 4 culas) foram usadas para semear 150 mL de meio de crescimento em um poço de uma placa de microtitulação de 96 poços, para culturas em micro-escala, 10 ul (10 4 culas) foram usadas para semear um microcapil fibronectina revestidoLary (câmara de perfusão). Após incubação a 37 ° C durante 16 horas, as células (5 x 10 ~ 4 por cultura convencional, ~ 10 3 por cultura de micro-escala) foram desafiados com E. coli (pHrodo biopartículas) a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20 (isto é, 20 biopartículas para todas as células na cultura), controlo negativo (falsamente desafiadas) culturas recebeu apenas meio fresco. Após incubação adicional a 37 ° C durante 1 ou 4 h, as células foram lavadas e lisadas utilizando reagentes a partir do Módulo de lise directa prelúdio. RNA lisado foi amplificado e convertido em cDNA utilizando Ovation PicoSL WTA, os (≥ 200 nt) produtos de cDNA maiores purificados usando Agencourt RNAClean XP, e estes produtos utilizados como modelo em ensaios TaqMan qPCR para medir os níveis de transcrição para o MIP-1β (CCL4) RANTES (CCL5), a COX-2 (PTGS2) e TNFa (TNF), bem como GAPDH (para a normalização dos níveis de cDNA entre lisados). Cada ensaio foi realizado de qPCR em triplicado e a média dos resultados. Each experiência foi replicada independentemente três vezes. Barras indicam aumento médio de vezes nos níveis de transcrição em culturas convencionais (azul) ou culturas micro-escala (vermelho) desafiados com bactérias, como em relação ao controle negativo (mock-desafiou) culturas; barras de erro indicam o desvio padrão nos três experimentos.
| Exigência | Experiência convencional | Experiência em micro-escala |
| Células | 3000000 | 60000 |
| Meio de Crescimento | 2,4 ml | 0,7 ml |
| Biopartículas | 200 ug | 4 ug |
| Lavagem de Lise Reagentes | 300 ul de cada | 60 ul cada |
Tabela 1. Requisitos para convencional versus micro-escala Estimulação Experiment celulars. números são extraídos a partir da experiência representativa descritos neste relatório (Figura 2), em que os macrófagos de murino (linha celular P388D.1) foram cultivadas em seis convencional (placa de microtitulação de 96 poços) contra micro-escala (câmara de perfusão) culturas , desafiados com E. coli (pHrodo biopartículas) a uma moi de 20, e lisaram-se por análise de qPCR.
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Discussion
Nós desenvolvemos uma plataforma automatizada simples e versátil para a cultura de células micro-escala e experiências de estimulação. A plataforma permite-nos trabalhar com pequenos volumes de cultura e populações celulares (1-20 mL e 100 - 2000 células, por câmara); tamanhos cultura pode ser ainda mais reduzida com o uso de microcapilares de menor diâmetro. Trabalhando em ambas as escalas reduz o custo de estudos de rotina e faz estudos viáveis, que requerem o uso de reagentes preciosos e / ou de células. Experimentos plataforma executados também mostram menor variabilidade, presumivelmente devido à precisão e reprodutibilidade com que as células e fluidos são manipulados pela plataforma automatizada.
A configuração atual da plataforma atrai células e meios de comunicação a partir de off-board reservatórios (microtubos ou poços da placa de microtitulação) para a semeadura, equilíbrio e expansão de populações de células nas câmaras de perfusão. Esta é uma maneira simples de resolver o descompasso entrerequisitos do meio de cultura (por exemplo, 700 ul consumida na experiência representativa descrito acima) e da capacidade do dispositivo de DMF é bordo reservatórios (24 mL cada). No entanto, esta configuração requer intervenção manual meados de experiência, para alternar entre dois reservatórios (Passo 1.6) e ligar as câmaras de perfusão ao hub DMF (Passo 3.1). Configurações futuras poderão incluir de grande capacidade (por exemplo, 1 ml) a bordo reservatórios, o qual permitiria de encaminhamento de todos os materiais através do cubo de DMF, eliminando assim a necessidade de uma intervenção manual meados de experiência.
As nossas experiências necessárias apenas cultura de curto prazo (<24 h) de células na plataforma. Temos verificado que a viabilidade celular na plataforma é comparável à que, em culturas convencionais para, pelo menos, 24 horas (dados não mostrados). No entanto, não foram ainda tentaram manter as culturas na plataforma por longos períodos de tempo. A evaporação não é uma grande preocupação porque a plataformacâmaras de perfusão e de crescimento a médio reservatórios são sistemas parcialmente fechados e os plugues líquido de cobertura das células são facilmente repostos via câmbio médio. Por outro lado, para manter o pH em culturas a longo prazo, pode ser necessário para abrigar os reservatórios de crescimento médio de 5 - 10% de CO2, ou alterar para um meio de crescimento que não inclui um tampão de pH base de 2-CO bicarbonato . Além disso, a cultura de longo prazo de células em divisão activa iria expandir populações até ao ponto de confluência (isto é, a cobertura de todas as superfícies disponíveis dentro da câmara de perfusão), o que implicaria passaging das células (libertação, lavar, diluir, e re-semente) . Outros têm feito isso em regimes microfluídicos 3,5,6,9,17 e em sua configuração atual a plataforma deve ser capaz de realizar todas as manipulações necessárias. Em resumo, acreditamos que com a modificação modesto (principalmente para os protocolos, ao invés de hardware) nossa plataforma deve ser capable de apoio a uma cultura de células de mamífero de longo prazo. Isto parece uma futura direção particularmente promissora, pois os métodos convencionais são demorados e trabalhosos, adicionando uma capacidade de cultura de longo prazo para o repertório de nossa plataforma automatizada seria ainda permitir aos seus utilizadores a re-direcionar o seu trabalho de forma mais produtiva.
Embora tenhamos testado apenas alguns tipos de células diferentes, até agora, (por exemplo a linha celular de macrófagos de murino RAW264.7; murino macrófagos derivados de medula óssea (BMDM)), a plataforma deve ser capaz de acomodar praticamente qualquer tipo de célula aderente. Em alguns casos, pode ser necessário mudar o revestimento de câmara de perfusão da fibronectina para outro componente da matriz extracelular (ou uma mistura de componentes), ou para mudar o meio de crescimento, mas estas modificações são facilmente feitas. Trabalho com tipos de células não-aderentes pode ser mais difícil, mas as estratégias tethering celulares têm sido bem sucedidos em contextos semelhantes 32-34. Ele should também ser possível criar culturas mistas constituídas por vários tipos de células, de facto, a precisão com que a plataforma de alças células e fluidos devem assegurar que a construção de culturas mistas é altamente reprodutível.
No que diz respeito aos estímulos, praticamente qualquer substância que pode ser transportado dentro de um tampão líquido aquoso deverá ser compatível com a plataforma 5,13,16,35. No caso de grandes partículas ou densas, o que pode estabelecer-se fora ao longo do tempo, pode ser necessário para voltar a suspender as periodicamente dentro dos reservatórios, no passado, têm abordado este problema através da utilização do fluido de transporte de alta densidade 36, ou uma simples agitação sistema (dados não apresentados), as soluções que devem ser fácil de implementar na nossa plataforma.
Até agora, a caracterização das células cultivadas e estimuladas em que a plataforma tem focado principalmente na análise de qRT-PCR, das respostas pro-inflamatórias indicação. Como passo seguinte, uma análise abrangente de tele transcriptoma da população celular (via microarranjos de DNA ou Generation Sequencing (SGS) (ie RNA-Seq 37,38)), está bem ao nosso alcance, com modesta modificação da etapa de preparação de cDNA, a nossa plataforma e protocolos devem ser totalmente capaz de suportar mundial estudos de perfis de transcrição. Da mesma forma, a análise das respostas de população celular ao nível da proteína (por ELISA, imunoprecipitação, espectrometria de massa, ou de microarrays de proteína) deve exigir apenas a modificação das etapas de preparação de lisados. A plataforma também suporta a análise baseada em imagiologia de respostas celulares. As células podem ser visualizados no interior da câmara de perfusão (por exemplo, Figura 3), a utilização de produtos de superfície plana (ao invés de arredondada) microcapilares para o módulo de câmara de perfusão iria facilitar este tipo de análise. Além disso, as células podem ser visualizados no cubo DMF 14,15, antes da semeadura das câmaras de perfusão e / ou após a libertação a partir deles. Lançamentos células também pode ser trabalhada fora dea plataforma. Até agora, temos usado microscopia de luz e de fluorescência de células de imagem para todas estas fases, a fim de analisar a sua morfologia, a viabilidade, a taxa de proliferação, e as interacções físicas com estímulos (por exemplo, biopartículas) e o outro (dados não mostrados). Microscopia também deve permitir a análise do teor de metabolito (avaliada através da utilização de corantes fluorescentes), a actividade de transcrição (avaliada através da utilização de construções repórter), e os níveis de proteína / localização (avaliada através da utilização de construções repórter fluorescentes, construções de fusão de proteína, e / ou imunocitoquímica ). Células libertadas podem ser analisados utilizando citometria de fluxo, bem. Muitas destas análises podem ser realizadas inteiramente sobre a plataforma, na sua configuração actual, outros exigiria análise off-plataforma ou a integração de módulos microfluidos baseados especializadas (por exemplo, ver referências 36,39-41) na plataforma através de uma ligação para o DMF hub. Tomados em conjunto, parece provável tchapéu a plataforma vai revelar-se útil para permitir uma análise multi-dimensional de pequenas populações de células, o que de outra forma apenas podem ser alcançados através da utilização de sistemas robóticos muito complexos e caros.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem Ronald F. Renzi e Michael S. Bartsch por suas contribuições para a concepção e desenvolvimento de dispositivos de DMF eo hub DMF. Esta pesquisa foi totalmente suportado pelo Laboratório Direção de Pesquisa e Programa de Desenvolvimento do Sandia National Laboratories. Sandia é um laboratório multi-programa gerenciado e operado pela Sandia Corporation, uma subsidiária integral da Lockheed Martin Corporation, para o Departamento de Administração de Segurança Nacional de Energia Nuclear dos EUA sob contrato DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
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- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R.
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