Summary
Biz mikro ölçekli hücre stimülasyonu deneyler için otomatik bir hücre kültürü ve sorgulama platformu geliştirdik. Platform yetiştirilmesi ve hücrelerin küçük nüfus uyarıcı ve moleküler analizler için lizatları kurtarma, basit, çok yönlü ve hassas kontrol sağlar. Platform de değerli hücreleri ve / veya reaktif kullanmak çalışmalar için uygundur.
Abstract
Kültür hücreleri (in vitro analizi) çalışması karmaşık biyolojik sistemlerin içine önemli fikir sağlamıştır. In vitro analizi için geleneksel yöntemler ve sistemler de mililitre ölçekli birimleri (≥ 0.1 ml) hücreleri (≥ 10 5), çok sayıda çalışma için uygundur. Ancak, bu ilgi ve / veya kültür, uyarılma ya da işlem için gerekli reaktiflerin hücre tüketimini azaltmak için kültür boyutunu aşağı ölçekte gerekli ya da arzu edilir olduğu birçok örneği vardır. Ne yazık ki, geleneksel yaklaşımlar mikro ölçekli kültürlerin hassas ve tekrarlanabilir manipülasyon desteklemez ve mevcut Mikroakiskan tabanlı otomatik sistemler çok karmaşık ve en laboratuvarlar tarafından rutin kullanım için uzmanlaşmıştır. Mikro ölçekli hacminde - Bu sorunu çözmek için, otomatik kültür, stimülasyon ve hücrelerin küçük nüfus (2.000 hücre 100) geri kazanımı için basit ve çok yönlü teknoloji platformu geliştirdiks (1-20 ul). Platform mikro ölçekli kültür, kurulan muhafaza ve uyarılır, içinde fibronektin kaplı mikrokapilerler ("hücre perfüzyon odaları"), bir dizi oluşur "transfer" mikrokapilerler ("merkez ile donatılmış bir dijital Mikroakiskan (DMF) cihazı "), ve perfüzyon odalarından yolları hücreleri ve reaktif olan, güçler perfüzyon odaları ve merkez arasında malzeme nakliyesi bir yüksek hassasiyetli şırınga pompası, hangi ve malzeme nakliyesi üzerinde kontrol sağlayan bir elektronik arayüz, hangi koordine ve önceden belirlenmiş komut ile otomatik. Bir örnek olarak, bakteri ile meydan bağlı bağışıklık hücrelerinde ortaya çıkardı transkripsiyonel yanıtlar çalışmayı kolaylaştırmak için platform kullanılır. Platformun kullanın bize, hücre ve reaktif tüketimini azaltmak deneme-için-deney değişkenliği en aza indirmek için etkin ve yeniden doğrudan eller emek. Bu bahşeder avantajları, hem de onun erişilebilirlik ve çok yönlülük, o göz önüne alındığındaur platformu laboratuar ve geniş bir uygulama çeşitli kullanım alanı bulur ve sadece sınırlı miktarlarda mevcut olan hücrelerin ve uyaranların çözümlenmesini kolaylaştıran çok özellikle faydalı olabilir gerekir.
Introduction
(In vitro analizinde) kültür muhafaza hücrelerin çalışma karmaşık biyolojik sistemlerin ve insan sağlığı düzenleyen temel ilke ve moleküler mekanizmaları içine değerli fikir sağlamıştır. Kültür, uyarılma ve Petri kutularına ve mikro-titer plakalar kullanmak analizi için hücreler, toplanması için konvansiyonel yöntemler mililitre çapta kültür hacmi hücreleri (≥ 10 5) (≥ 0.1 ml) arasında geniş popülasyonların çalışması için tasarlanmıştır. Ancak, hücrelerin sadece sınırlı bir miktarda mevcut olduğu bir çok durumda (örneğin, birincil hücreler), ya da küçük hücre popülasyonları (örneğin nüfus içerisindeki hücre-hücre değişkenliği azaltmak için) arzu edilir veya gerekli reaktiflerin elde etmek zordur veya pahalı (örneğin saflaştırılmış hücre-salgılanan faktörler). Bu tür sorunlar başarıyla kültür boyutunu küçültme tarafından ele alınabilir, hangi tüm tüketimi azaltmak yararı vardırReaktifler in vitro analiz 1,2 için gerekli. Ne yazık ki, geleneksel ekipman ve yöntemleri mikro ölçekli kültür ve 3-11 çok karmaşık ve en laboratuvarlar tarafından rutin kullanım için özel olan mevcut Mikroakiskan tabanlı otomatik sistemlerin hassas ve tekrarlanabilir manipülasyon desteklemez.
Mikro ölçekli hacimlerde (1 - 20 ul) - Bu yazıda, otomatik kültür, stimülasyon ve hücrelerin küçük nüfus (2.000 hücre 100) geri kazanımı için basit ve çok yönlü teknoloji platformu montajı ve kullanımı açıklanmaktadır. Fibronektin kaplı mikrokapilerler ("hücre perfüzyon odaları" modülü) mikro ölçekli kültürlerin kurulması, bakım ve uyarılması için site olarak hizmet veren bir dizi ve bir dijital Mikroakiskan (DMF: platform mimarisi (Şekil 1) modüler yapıda olup "transfer" mikrokapilerler ("merkez" modülü) 14,15 yolları hücreleri ile donatılmış) 12,13 cihazve ve perfüzyon odaları reaktifleri. DMF kullanıcı ayrı ayrı aynı anda birden fazla damlacıkları ele ve cihaz donanım değiştirmeden manipülasyonlar (yani yeniden örnek işleme tren) değiştirmek veya yeniden sipariş edebilirsiniz. Onun büyük esneklik hücre kültürü 16,17, enzim testleri 18,19, immün 20,21, DNA analizi 22,23, protein işleme, 24,25 de dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesi, önemli bir teknoloji olarak son ortaya çıkması belirgindir ve klinik örnek işleme. 26,27 Bizim merkez DMF cihazlara doğal esneklik yararlanır, ve daha fazla uzman periferik manipülasyonlar bir alt kümesi (örneğin hücre kültürü) gerçekleştirmek için bir fırsat sunuyor microcapillary arayüzleri, ilavesi aracılığıyla artırır DMF yerine aygıtın kendisinde daha modülleri. Bu şekilde işleme tren bölümlere de pla tasarımı kolaylaştırırtform mimari (tüm işlem adımları taşıyabilen bir DMF cihaz oluşturmak için gerek yok) ve yeni fonksiyonlar olarak evrimi kolaylaştırır (sadece gerekli gibi yeni çevresel modüller entegre) gerekmektedir. Merkez içinde hücreleri ve reaktiflerin taşıma DMF cihaz 13,28 içinde elektrotlar sıralı aktivasyon tarafından oluşturulan kuvvetler electrowetting tarafından sürülür; gelen, ulaşım ve perfüzyon odaları içinde yüksek hassasiyetli şırınga tarafından oluşturulan basınç değişiklikleri tarafından desteklenmektedir pompa. Bu sıvı hareketlerin tüm basit bir elektronik arabirimi üzerinden kontrol ve önceden belirlenmiş komut kullanımı ile otomatik vardır.
Temsili bir örnek olarak, bakteri ile meydan okuma (Şekil 2) üzerine bağışıklık hücrelerinde ortaya çıkardı transkripsiyonel yanıtların çalışma için platformun kullanımını göstermektedir. Platformda bu deneyler bize hücrelerin az sayıda (deneysel başına ~ 1000 ile çalışmak için etkintal durumu), deneme-to-deney değişkenliği, tasarrufu reaktifler ve emek eller yeniden doğrudan en aza indirmek. Bu avantaj sağladığını, hem de onun erişilebilirlik ve çok yönlülüğü göz önüne alındığında, bu platform laboratuar ve geniş bir uygulama çeşitli kullanım alanı bulur ve sadece sınırlı miktarlarda mevcut olan hücrelerin ve uyaranların çözümlenmesini kolaylaştıran çok özellikle faydalı olabilir gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu genel bir protokol çalışmaları geniş bir yelpazede için platformun uygulamayı desteklemek için tasarlanmıştır, bu raporda açıklanan temsilcisi çalışma özgü yönleri parantez içinde dışarı ayrılır Şekil 2 protokolü kullanılarak gerçekleştirilen temsili bir çalışma göstermektedir.. Protokolde, tüm "talimat" komutları önceden belirlenmiş komut kullanımı ile otomatik unutmayın. Adım 2 Adım 1 (Adım 1.7 ve 1.8 sırasında örneğin) paralel olarak yapılabilir bu da unutmayın ve bu adım 2.1 genellikle atlanır (desenli / kaplı DMF cihaz levhalar yıkanır ve tekrar kullanılabilir, çünkü; Adım 5.2) .
1. Hücre Perfüzyon Odalar montaj ve doldurmak
- Coat sterilize (otoklav) mikrokapilerler (erimiş-silis 15 cm uzunluğunda,, 679 mikron od, 534 mikron id) iç yüzeyleri steril fibronektin solüsyonu (50 mg / ml 30 ul) çizmek için şırınga pompası talimat ile fibronektin ile, her birinemikrokılcal, (2 saat boyunca 37 ° C) kuluçkaya çözeltiyi çekmek için bir şırınga pompası talimat ve mikrokapilerler kuru (6 saat boyunca oda sıcaklığında (RT)) izin vermek.
- CapTite parçaları (6 perfüzyon odaları, 8-port şırınga pompası) kullanarak, polikarbonat tüp (500 mikron od, 100 mikron id) ve çok portlu şırınga pompası için boru her fibronektin kaplı microcapillary (perfüzyon odası) bağlayın.
- Bant kullanarak, istenilen sıcaklığa ayarlanmış bir ısı bloğu (37 ° C) her perfüzyon odasının vücut sabitleyin.
- Bir rezervuar içinde perfüzyon odaları arasında açık uçları (de microcentifuge tüp veya mikrotitre plaka) taze büyüme ortamı içinde süspansiyon haline içeren hücreler (P388D.1 sıçangil makrofaj) (RPMI-1640,% 10 FBS, 500 ünite / ml penisilin, 500 ug daldırın / istenilen konsantrasyonda (10 6 hücre / ml), streptomisin ml 'de).
- Yeterli ai ardından her perfüzyon odasına hücreleri (10 ul, 10 4 hücre) çizmek için şırınga pompası talimatr ısı bloğuna güvenli bölümüne sıvı fişi (~ 4.5 cm) taşımak için.
- Hücrelerin perfüzyon odaları arasında fibronektin kaplı iç yüzeyleri (-, 2 saat 37 ° C'de 1) uyması için izin verir. Bu arada, hücreler rezervuar taze büyüme ortamı içeren yeni bir rezervuara perfüzyon odaları arasında açık uçları aktarın.
- Uyum döneminden sonra, atık taze orta (10 ul) geri ve yapıştırılır üzerinde yeni sıvı fişleri (taze orta) konumlandırmak için yeterli hava ile takip sıvı fişleri (klimalı ortam ve serbest hücreler) göndermek için şırınga pompası talimat hücreler.
- Hücre popülasyonlarının (- ~ 1.000 hücre / odasının mikro ölçekli kültür oluşturulan nüfus 24 saat 16) yeterince dengelenir ve genişletilmiş kadar düzenli aralıklarla (her 2 saat) orta değişim (yani tekrar Adım 1.7) yürütmek için devam edin.
2. DMF Cihaz imal ve Hub Mimarlık monte
- Bu aralık, çalıştırma elektrot boyutu 2,5 mm (2) ile bir araya damlacık hacmi (2.5 ul tanımlar, metal sıkıştırma kareler kullanılarak, plakalar arasındaki bir 400 mikron aralığı korumak girintiler sahip bir polimer döküm 14,30 içine DMF levhaları sabitlemek elektrot başına). DMF montaj basit yollarla 24 gerçekleştirilebilir unutmayın.
- Ekle Teflon kaplı transferi mikrokapilerler (360 mikron od, 100 mikron id; 3.5 - 4.0 cm uzunluğunda) DMF plakalar arasındaki boşluğa, kendi soydaş harekete elektrot kenarına uzatmak için her konumlandırma.
- Ters trher transfer microcapillary yapıştırmayın bir CapTite uygun d.
- İTO elektrotlara voltaj sağlamak için elektrik bağlantıları meşgul. Elektrot aktivasyon dizileri önceden belirlenmiş komut çalıştıran bir bilgisayar kontrollü elektronik arayüzü kullanılarak otomatik vardır.
- İsteğe bağlı: damlacıkların izleme kolaylaştırmak için bir şarj bağlı cihaz (CCD) kamera (DCR-HC96 (Sony, Japonya)) ile donatılmış bir mikroskop öteleme aşamasında (SZ-6145TR (Olympus, Japonya)) üzerine monte DMF merkezi Taşı . 31
3. DMF Hub için Perfüzyon Odalar bağlayın ve Hücre Nüfus teşvik
- Orta hazneden perfüzyon odaları açık uçları (Adım 1.6 bakınız) çıkarın ve DMF merkezi devri mikrokapilerler (Adım 2.4) ucuna yapıştırılmış CapTite parçaları içine yerleştirin.
- Atık perfüzyon odalarında sıvı fişleri (klimalı ortam) göndermek için şırınga pompası söyleyin.
- Öğrbir on-board rezervuar (E. coli% 0.1 Pluronic F 127 a / h taze ortamda 100 mg / ml 'de BioParticles) uyaran çekmek ve her transfer microcapillary uygun boyutu (10 ul) bir damlacık sunmak için DMF merkezi ruct . On-board rezervuarları silindirik şekilli bölmeleri (1.5 x 1.5 cm her biri) oluşan ve boru ile DMF Hub bağlanır.
- Uyaran transfer mikrokapilerler takılan çekmek ve perfüzyon odalarında hücre popülasyonlarının üzerinde fişler konumlandırmak için yeterli hava ile takip etmek şırınga pompası söyleyin.
- Uyarıcı hücreler ile (-, 4 saat 37 ° C'de 1 için) inkübe edin. İsteğe bağlı: düzenli aralıklarla taze uyaran (yani Adımları 3.2-3.4) için değişimi.
4. Uyarım sona ve Analiz için Hücre Lizatları Kurtar
- İsteğe bağlı: bir post-stimülasyon süresi gerekiyorsa, (yani Adımları 3.2 taze orta uyarıcı içeren sıvı fişler alışverişi - 3.4,) Teşvik için taze orta yerine ve inkübasyon ve gerektiğinde alışverişi devam ediyor.
- Değişimi yıkama tamponu (Prelüd Direkt modülü Lizis Tampon B) (yani Adımları 3,2-3,4, uyarıcı için yıkama tamponu yerine) için perfüzyon odaları içindeki sıvı fişleri, ve benzeri gibi (5 dakika) tabi inkübe edin.
- Döviz lizis çözüm için sıvı fişleri (tampon yıkama) (Prelude Doğrudan Lizis Modülü Tampon 0,1% Pluronik F 127 a / h ile) (yani tekrar Adımlar 3,2-3,4, teşvik için lizis çözüm yerine), ve inkübe gerektiği gibi (5 dakika) .
- DMF merkezi için sıvı fişleri (hücre lizatları) göndermek için şırınga pompası söyleyin.
- DMF merkezi sökün, DMF cihazı (bu damlacık karıştırma neden olabilir gibi, yan plaka yatırmak için dikkat kullanarak) üst plaka kaldırmak ve off-platformu analizi için bir Pipetman veya şırınga kullanarak lizatları (gen ekspresyon profili toplamak QPCR aracılığıyla).
5. Için temiz Platformu DonanımYeniden kullanmak
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 10 çamaşır transferi mikrokapilerler ve CapTite parçaları (su, v / v) batırmak, azot gazı kullanılarak iyonu giderilmiş su ve kuru ile durulayın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 10 çamaşır DMF cihaz plakaları daldırın, izopropanol ile iyice yıkayın deiyonize su ile devam eder ve kuru bir nitrojen gazı kullanılarak 10 dakika boyunca 160 ° C'de pişirme izledi.
- Şırınga pompa polikarbonat tüp ve DMF cihazın polimer döküm ve sıkıştırma çerçeve, temizlik olmadan yeniden kullanılabilir. Perfüzyon odasının mikrokapilerler her bir deney sonra atılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Otomatik platformunun bir gösteri olarak, bu bakteri ile meydan bağışıklık hücrelerinin küçük nüfus mikro ölçekli Üreyen edildiği bir çalışma, yürütmek için kullanılan ve (Şekil 2 pro-inflamatuar yanıtların kapalı platform analizi için parçalanmış .)
Altı hücre perfüzyonu odaların her büyüme ortamı 10 ml içinde tekrar süspanse 10 4 bağışıklık hücreleri (P388D.1 sıçangil makrofaj) ile tohumlandı. Bir bağlılık süresi (37 ° C, 2 saat) ve bir ortam değiştirme sonra, ~ 500 hücre olarak tekrarlanan mikro kültür analizi (hücre celatçı tedavi metotları ile serbest bırakılır ve sayılan ile ölçülen her bir bölme (Şekil 3A) iç yüzeyinde, ekli kalmıştır Hemasitometre ve ışık mikroskobu ile). 2 saatlik aralıklarla ortam değişimleri ile 16 saat süre ile 37 ° C 'de ayrıntılı inkübasyon, oda başına yaklaşık 1.000 hücreleri (Şekil 3B) (ölçülen inci hücre popülasyonlarının genişletilmişYukarıda açıklandığı gibi çoğaltmak mikro kültür,) kaba analizi. Altı perfüzyon odaları dördünde, hücre popülasyonlarının E. ile karşı karşıya getirilmiştir koli bakterileri (pHrodo BioParticles), büyüme ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve 20 'lik bir enfeksiyon çokluğu (İB) (örneğin, her bir hücre popülasyonunda ortalama 20 BioParticles ile meydan) teslim. Geri kalan iki bölme, hücre popülasyonlan bir sahte bir konudur (yani yalnızca büyüme ortamı) aldı. 1 saat (iki bakteri kültürleri meydan) ya da 4 saat (iki bakteri-meydan ve iki, kültürler mock-meydan) boyunca 37 ° C'de inkübasyondan sonra, hücreler yıkandı ve lize ve lisatlar DMF göbeğinden elde edildi. Kemokinler, MIP-1β (CCL4) ve RANTES (CCL5), indüklenebilir siklooksijenaz COX-2 (PTGS2) ve sitokin TNFa (TNF: Geleneksel tezgah ölçekli yöntemler lizatlarından cDNA hazırlamak için, enflamasyon aracıları için transkript seviyelerini ölçmek için kullanıldı .)
Şekil 4 üç bağımsız çoğaltılmış deneylerden elde edilen sonuçlar özetlenmektedir. Biz bağışıklık hücreleri (mavi bar) yetiştirilen ve geleneksel kültürlerde meydan hücrelerde ortaya çıkarılan bu esasen aynı olan pro-inflamatuar transkripsiyonel yanıtları monte büyüdü ve mikro ölçekli kültürler (kırmızı bar) meydan bulundu. Ayrıca, ilgili platform (mikro ölçekli) deneyleri daha az değişkenliğe (daha küçük hata çubukları ile gösterilir) gösterdi ve hücreler ve küçük miktarlarda reaktifler (Tablo 1) tüketir.
Şekil 1. Mikro Ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Otomatik Platformu Fotoğraf.
Şekil 2. Mikro Ölçekli Kültürler bakteriler ile Engelliler Bağışıklık Hücreleri transkripsiyonel Profil: Temsilci Platform-Etkin Deney genel bakış.
Şekil 3,. Bağışıklık hücrelerinin fotoğraf murin makrofaj (P388D.1 hücre hattı) 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda büyüme ortamı içinde yeniden süspansiyona alınmıştır. Bir mikro ölçekli perfüzyon odası içinde kültüre edildi ve 10 ul (10 4 hücre) tohum fibronektine el (perfüzyon odası) microcapillary kaplı. Parlak alan fotoğrafları bir CCD kamera (Qimaging) ile donatılmış bir MVX10 mikroskobu (Olympus) kullanılarak alındı. Nüfus büyüklüğü ölçmek için, çoğaltmak mikro ölçekli kültür hücreleri, hücre Stripper kullanarak perfüzyon odasının yüzeylerden serbest tripan mavisi kullanılarak boyandı ve bir hemasitometre ve ışık mikroskobu kullanılarak sayıldı. A. B. (37 ° C'de inkübasyon ile orta değişim her 2 saat), nüfusun ~ 1000 hücrelere genişletti.
Şekil 4. İmmün hücreler transkripsiyonel profilleri mikro ölçekli perfüzyon odaları konvansiyonel Gemiler kültürlendi ve uyarılmış. Murin makrofaj (P388D.1 hücre hattı) 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda büyüme ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirildi. Geleneksel kültürler için, 50 ul (5 x 10 4 hücre), 96 oyuklu mikro titer plaka iyi büyüme ortamı tohum 150 ul için kullanılan, mikro ölçekli kültürler, 10 ul (10 4 hücreleri) tohum için kullanıldı bir fibronektin kaplı microcapillary (perfüzyon odası). 16 saat boyunca 37 ° C'de inkübasyondan sonra, hücreler (mikro ölçekli kültür başına yaklaşık 5 x 10 4, geleneksel kültür başına, ~ 10 3) E. ile karşı karşıya getirilmiştir 20 'lik bir enfeksiyon çokluğu (İB) (yani, kültür, her bir hücre için 20 BioParticles tercih edilir) koli bakterileri (pHrodo BioParticles) ve negatif kontrol (mock-meydan) kültürler sadece taze ortam verildi. 37 ° daha inkübasyondan sonra, 1 ya da 4 saat sonrasında, hücreler yıkandı ve Prelude Doğrudan Lizis Modülünden reaktifler kullanılarak lize edildi. Lizat RNA, güçlendirilmiş ve kullanılarak cDNA Ovation PicoSL ATP, Agencourt RNAClean XP kullanılarak saflaştırılmıştır daha büyük (≥ 200 nt) cDNA ürünleri, ve MIP-1β (CCL4) için transkript düzeylerinin ölçülmesi için TaqMan QPCR tahlillerde şablon olarak kullanılır, bu ürünlere dönüştürülmüştür RANTES (CCL5), COX-2 (PTGS2) ve TNFa (TNF), yanı sıra, GAPDH (lizatlar arasındaki cDNA seviyelerinin normalleştirilmesi için). Her bir tahlil QPCR üç kere gerçekleştirilmiştir ve sonuçlar ortalama alındı. Each deney bağımsız üç kez tekrar edilmiştir. Barlar geleneksel kültürlerde transkript düzeyleri ortalama kat artış (mavi) veya negatif kontrol (mock-meydan) kültürlere göre bakteri ile meydan mikro ölçekli kültürler (kırmızı), gösterir; hata çubukları üç deney genelinde standart sapma gösterir.
| Gereklilik | Geleneksel Deney | Mikro Ölçekli Deney |
| Hücreler | 3.000.000 | 60.000 |
| Büyüme ortamı | 2.4 mL | 0.7 mi |
| BioParticles | 200 mg | 4 mg |
| Yıkama ve Lizis Reaktifler | 300 ul her bir | 60 ul her |
Tablo 1. Geleneksel karşı Mikro Ölçekli Hücre Stimülasyon Deney için gerekenlers. Numaraları temsilcisi fare makrofajlar (P388D.1 hücre hattı) altı geleneksel (96-mikrotiter plate) yetiştirilen edildiği bu raporda açıklanan deney (Şekil 2), karşı mikro ölçekli (perfüzyon odası) kültürlerden gelen çekilir , E. ile meydan bir MOI 20 de koli bakterileri (pHrodo BioParticles) ve QPCR analizi için parçalanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu mikro ölçekli hücre kültürü deneyleri ve uyarılması için basit ve çok yönlü bir otomatik bir platform geliştirdik. Kültür boyutları daha küçük çaplı mikrokapilerler kullanımı ile azaltılabilir; platformu bize küçük kültür hacimleri ve hücre popülasyonlarının (- - 20 ul ve 100 2.000 hücreleri, oda başına 1) ile çalışmasını sağlar. Bu ölçeklerde çalışan rutin çalışmaların maliyetini düşürür ve değerli reaktifler ve / veya hücrelerin kullanımı gerektiren mümkün çalışmalar yapar. Platform-idam deneyler de hücre ve sıvı otomatik platformu tarafından işlenir hangi ile hassasiyet ve tekrarlanabilirlik için muhtemelen nedeniyle daha az değişkenlik, göstermektedir.
Platformun geçerli yapılandırma ekim, dengeleme ve perfüzyon odaları hücre popülasyonlarının genişleme için kapalı-board rezervuar (mikrosantrifüj tüpler veya mikrotiter plaka kuyu) hücreleri ve medya çekiyor. Bu arasındaki uyumsuzluk ele almak basit bir yoludurbesi gereksinimleri (örneğin yukarıda açıklanan temsilcisi deney tüketilen 700 ul) ve DMF cihazın kapasitesi rezervuar (24 ul her) on-board var. Ancak, bu yapılandırma iki rezervuar (Adım 1.6) arasında geçiş ve DMF hub (Adım 3.1) için perfüzyon odaları bağlamak için, orta deney elle müdahale gerektirir. Gelecek yapılandırmaları orta deney manuel müdahale gerekir böylece ortadan kaldırarak, DMF hub üzerinden tüm malzemelerin yönlendirme sağlayacak olan, on-board rezervuar (örneğin 1 ml) yüksek kapasiteli içerebilir.
Bizim deneyler platformda hücrelerin kısa süreli (<24 saat) kültür sadece gerekli. Biz platformda hücre canlılığı en az 24 saat (veriler gösterilmemiştir) için geleneksel kültürlerde ile karşılaştırılabilir olduğunu doğruladıktan. Ancak, henüz daha uzun süre için platformda kültürleri korumak için teşebbüs değil. Buharlaşma büyük bir endişe olmadığı için platformunperfüzyon odaları ve büyüme ortamı tanklar kısmen kapalı sistemlerdir ve hücreleri çevreleyen sıvı fiş kolayca ortam değişikliği ile takviye edilir. Öte yandan, uzun süreli kültürlerde pH değerini muhafaza etmek için bir 5 büyüme ortamı rezervuar ev için gerekli olabilir - bir CO2-bikarbonat bazlı pH tampon içermez% 10 CO2 atmosfer veya bir besiyerine anahtar . Ayrıca, aktif bölünen hücreleri uzun süreli kültür confluency noktasına nüfus genişletecek (perfüzyon odasının içinde tüm yüzeylerin yani kapsama), (sürüm, yıkama sulandırmak ve yeniden tohum) hücreleri Pasajlanması gerektirecek hangi . Diğerleri mikroakışkan rejimleri 3,5,6,9,17 bu başarılı ve mevcut yapılandırma platformu gerekli manipülasyonlar tüm yürütmek gerekir. Özetle, biz mütevazı değişiklik (öncelikle yerine donanım daha protokoller için) ile tüm forex c olması gerektiğini tahminUzun vadeli memeli hücre kültürü destek apable. Geleneksel yöntemler zaman alıcı ve emek yoğun, çünkü bu özellikle gelecek vaat yönde gibi görünüyor, bizim otomatik platformunun repertuarına uzun vadeli bir kültür özelliği ekleyerek daha da kullanıcıların daha üretken emek yeniden doğrudan sağlayacak.
Böylece şimdiye kadar sadece birkaç farklı hücre tipleri (örneğin, mürin makrofaj hücre çizgisi RAW264.7; fare kemik iliğinden elde edilen makrofajlar (BMDM)) test edilmiş olmasına rağmen, platformun hemen hemen yapışık hücre tipi karşılamak mümkün olmalıdır. Bazı durumlarda, bu fibronektin başka bir hücre dışı matris bileşeni (ya da bileşenlerinin karışımı) perfüzyon odasının kaplama değiştirmek için, ya da büyüme ortamı değiştirmek için gerekli olabilir, fakat, bu değişiklikler kolayca yapılır. Olmayan yapışık hücre tipleri ile çalışmak daha zor olabilir, ancak cep bağlama stratejileri benzer bağlamlarda 32-34 başarılı olmuştur. Bu should aynı zamanda birden fazla hücre tipleri oluşur karışık kültür oluşturmak mümkün, gerçekten, platform hücreleri ve sıvı kolları hangi ile hassas karışık kültürlerin, inşaat yüksek tekrarlanabilir sağlamalıdır.
Uyaranlara ile ilgili olarak, bir sulu sıvı fiş içinde taşınabilmektedir hemen hemen herhangi bir madde platformumuzun 5,13,16,35 ile uyumlu olmalıdır. Zaman içinde yerleşebilirsiniz büyük veya yoğun parçacıklar durumunda, periyodik rezervuar içinde onları tekrar süspansiyon gerekli olabilir, geçmişte, yüksek yoğunluklu taşıyıcı akışkan 36 kullanımı ile bu sorunu ele ya da basit bir ajitasyon var sistemi (veriler gösterilmemiştir), bizim platformda uygulamak kolay olmalıdır çözümleri.
Şu ana kadar, platformda kültür ve uyarılmış hücre bizim karakterizasyonu öncelikle damgasını pro-inflamatuar yanıtların Mah-PCR analizi odaklanmıştır. T bir sonraki adım, kapsamlı bir analiz olarako hücre popülasyonu en transcriptome (DNA mikroarrayler veya Üretimi Sıralama (SGS) (yani RNA-Seq 37,38) ile), iyi ulaşmak içinde olduğunu, cDNA hazırlık adım mütevazı değişiklik ile, bizim platformu ve protokoller küresel destek tamamen yetenekli olmalıdır transkripsiyonel profil çalışmaları. Benzer şekilde, protein seviyesinde hücre popülasyonunun cevapların analizi (ELISA, immünopresipitasyon, kütle spektrometresi, ya da protein mikroarray yoluyla) lizat hazırlama aşamaları tek değişiklik gerektirir gerekir. Platform aynı zamanda hücre yanıtları görüntüleme tabanlı analiz destekler. Hücreler perfüzyon odasının (örneğin Şekil 3) içinde görüntülü olabilir; perfüzyon odasının modülü için (yuvarlak yerine) düz yüzeyli mikrokapilerler kullanım analizi bu tür kolaylaştıracaktır. Ayrıca, hücreler önce perfüzyon odaları ve / veya onlardan serbest bırakıldıktan sonra bir tohumlama için, DMF hub 14,15 üzerinde görüntülenebilir. Çıkış hücreleri de kapalı yansıması olabilirplatformu. Şu ana kadar, biz uyaranlara (örneğin BioParticles) ve birbirlerine (veriler gösterilmemiştir). Ile morfolojisi, canlılığı, proliferasyon hızı ve fiziksel etkileşimleri analiz etmek için bu aşamaların hiç görüntü hücrelere ışık ve floresan mikroskobu kullandık Mikroskopi da (floresan boya ile değerlendirildi) metaboliti içeriği analiz edilmesini sağlar, transkripsiyonel aktivitesi (muhabiri yapıları ile değerlendirildi) ve protein düzeyleri / lokalizasyonu (muhabiri yapıları, floresan proteini füzyon yapıları ve / veya immünsitokimya kullanımı ile değerlendirildi .) Çıkış hücreler flow sitometri de kullanılarak analiz edilebilir. Bu analizlerin çoğu mevcut yapılandırma platformda tamamen yürütülen olabilir, diğerleri DMF bağlantı ile platforma (örneğin Referanslar 36,39-41 bakınız) özel Mikroakiskan tabanlı modülleri kapalı platform analiz veya entegrasyon gerektirir hub. Birlikte ele alındığında, büyük olasılıkla t görünüyorşapka bizim platformu aksi takdirde sadece çok karmaşık ve pahalı robotik sistemlerin kullanımı ile elde edilebilir hücreleri, küçük nüfusun çok boyutlu analiz sağlayan değerli ispat edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar DMF cihazları ve DMF merkezi tasarım ve geliştirme katkıları için Ronald F. Renzi ve Michael S. Bartsch teşekkür ederim. Bu araştırma tam Sandia Ulusal Laboratuarlarında Laboratuvarı Yönetmen Araştırma ve Geliştirme Programı tarafından desteklenmiştir. Sandia sözleşme DE-AC04-94AL85000 altında Enerji Ulusal Nükleer Güvenlik İdaresi ABD için Sandia A.Ş., Lockheed Martin Corporation'ın iştiraki, tarafından yönetilen ve işletilen bir çok programı laboratuvardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R.
- Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
- Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
- Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
- Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
- King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
- Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
- Wheeler, A. R. Chemistry - Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
- Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
- Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
- Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
- Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
- Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
- Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
- Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
- Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
- Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
- Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R.
- Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
- Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , Submitted (2012).
- Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
- Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
- Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
- Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
- Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
- Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
- Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
- Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).
