Summary
Abbiamo sviluppato una coltura cellulare automatizzata e piattaforma di interrogatorio per esperimenti di stimolazione cellulare micro-scala. La piattaforma offre un controllo semplice, versatile e preciso nel coltivare e stimolare le piccole popolazioni di cellule, e recuperando lisati per le analisi molecolari. La piattaforma è adatto a studi che impiegano cellule preziosi e / o reagenti.
Abstract
Studio delle cellule in coltura (analisi in vitro) ha fornito indicazioni importanti in sistemi biologici complessi. I metodi convenzionali e attrezzature per analisi in vitro sono adatti per lo studio di un gran numero di cellule (≥ 10 5) in volumi millilitro scala (≥ 0,1 ml). Tuttavia, ci sono molti casi in cui è necessario o auspicabile ridimensionare dimensione coltura per ridurre il consumo delle cellule di interesse e / o reagenti richiesti per la loro cultura, la stimolazione, o la trasformazione. Purtroppo, gli approcci tradizionali non supportano la manipolazione precisa e riproducibile di culture micro-scala, e dei sistemi automatizzati microfluidica a base attualmente disponibili sono troppo complesse e specializzate per l'uso di routine dalla maggior parte dei laboratori. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato una piattaforma tecnologica semplice e versatile per la cultura automatizzata, la stimolazione, e il recupero di piccole popolazioni di cellule (100 - 2.000 cellule) nel volume di micro-scalas (1 - 20 l). La piattaforma è costituita da un insieme di microcapillari fibronectina-rivestito ("camere di perfusione delle cellule"), all'interno del quale sono stabilite le culture micro-scala, mantenuti e stimolati; un dispositivo digitale di microfluidica (DMF) equipaggiati con "trasferimento" microcapillari ("hub centrale "), quali cellule rotte e reagenti da e verso le camere di perfusione; una pompa a siringa ad alta precisione, che trasportano i poteri di materiali tra le camere di perfusione e il mozzo centrale, e un'interfaccia elettronico che consente di controllare il trasporto di materiali, che è coordinato e automatizzato tramite script pre-determinati. Come esempio, abbiamo utilizzato la piattaforma per facilitare lo studio di risposte trascrizionali indotte in cellule immunitarie upon sfida con i batteri. Utilizzo della piattaforma ci ha permesso di ridurre il consumo di cellule e reagenti, minimizzare la variabilità esperimento a esperimento, e ri-diretti hands-on del lavoro. Considerati i vantaggi che essa conferisce, così come la sua accessibilità e versatilità, opiattaforma ur dovrebbe trovare uso in un'ampia varietà di laboratori e applicazioni, e rivelarsi particolarmente utile nel facilitare l'analisi di cellule e stimoli che sono disponibili solo in quantità limitate.
Introduction
Lo studio delle cellule mantenute in coltura (analisi in vitro) ha fornito preziose informazioni sui principi fondamentali e dei meccanismi molecolari che regolano i complessi sistemi biologici e la salute umana. I metodi convenzionali per la cultura, la stimolazione, e la raccolta di cellule per l'analisi, che utilizzano capsule di Petri e micropiastre, sono stati progettati per lo studio di grandi popolazioni di cellule (≥ 10 5) in volumi di coltura millilitro scala (≥ 0,1 ml). Tuttavia, ci sono molti casi in cui sono disponibili soltanto quantità limitate di cellule (per esempio cellule primarie), o piccole popolazioni di cellule sono desiderabili (es. ridurre cellula-cellula variabilità nella popolazione), o reagenti necessari sono difficili da ottenere o costi proibitivi (ad es purificati fattori cellula-secrete). Tali problemi possono essere affrontati con successo dal ridimensionamento dimensione culturale, che ha il vantaggio di ridurre il consumo di tutti ireagenti necessari per l'analisi in vitro 1,2. Purtroppo, attrezzature e metodi convenzionali non supportano la manipolazione precisa e riproducibile di culture micro-scala ed i sistemi automatizzati di microfluidica a base attualmente disponibili 3-11 sono troppo complesse e specializzate per l'uso di routine dalla maggior parte dei laboratori.
In questo rapporto, descriviamo il montaggio e l'uso di una piattaforma tecnologica semplice e versatile per la cultura automatizzata, la stimolazione, e il recupero di piccole popolazioni di cellule (100 - 2.000 cellule) in volumi di micro-scala (1-20 ml). L'architettura della piattaforma (Figura 1) ha un design modulare: una serie di fibronectina rivestito microcapillari ("camere di perfusione delle cellule" modulo) serve come sito per la creazione, la manutenzione e la stimolazione delle colture micro-scala, e una microfluidica digitale (DMF ) 12,13 dispositivo equipaggiato con il "trasferimento" microcapillari (modulo "centrale hub") 14,15 celle rottee reagenti da e per le camere di perfusione. DMF consente all'utente di affrontare individualmente multiple goccioline simultaneamente e per modificare o ri-ordinare le manipolazioni (cioè riconfigurare i treni di trattamento del campione) senza modificare l'hardware del dispositivo. La sua grande flessibilità è evidente nella sua recente comparsa come una tecnologia chiave in una vasta gamma di applicazioni, tra cui la coltura cellulare 16,17, saggi enzimatici 18,19, 20,21 immunologici, analisi del DNA 22,23, trasformazione delle proteine, 24,25 clinica e trattamento dei campioni. 26,27 nostro mozzo centrale sfrutta la flessibilità inerente ai dispositivi DMF, e migliora ulteriormente attraverso l'aggiunta di interfacce microcapillari, che fornisce opportunità di realizzare un sottoinsieme di manipolazioni (es. coltura cellulare) in periferico specializzato moduli, piuttosto che sul dispositivo DMF stesso. Compartimentazione dei treni di elaborazione in questo modo semplifica anche la progettazione del plaarchitettura TForm (nessun bisogno di costruire un dispositivo di DMF in grado di eseguire tutte le fasi di lavorazione) e facilita la sua evoluzione come nuove funzioni sono necessarie (semplicemente integrare nuovi moduli periferici, se necessario). Trasporto delle cellule e reagenti all'interno del mozzo centrale è guidato da elettrowetting forze generate mediante attivazione sequenziale di elettrodi all'interno del dispositivo di DMF 13,28, trasporti verso, da e all'interno delle camere di perfusione è alimentato da variazioni di pressione generate da una siringa ad alta precisione pompa. Tutti questi movimenti fluidi sono controllati tramite una semplice interfaccia elettronica e automatizzata mediante l'utilizzo di script pre-determinati.
Come esempio rappresentativo, dimostriamo l'utilizzo della piattaforma per lo studio delle risposte trascrizionali suscitato in cellule del sistema immunitario su sfida con i batteri (Figura 2). Svolgimento di tali esperimenti sulla piattaforma ci ha permesso di lavorare con un piccolo numero di cellule (~ 1.000 per sperimentazionecondizione Tal), ridurre al minimo la variabilità esperimento a esperimento, i reagenti conservare, e ri-diretto hands-on del lavoro. Considerati i vantaggi che essa conferisce, così come la sua accessibilità e versatilità, questa piattaforma dovrebbe trovare uso in un'ampia varietà di laboratori e applicazioni e rivelarsi particolarmente utile nel facilitare l'analisi di cellule e stimoli che sono disponibili solo in quantità limitate.
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Protocol
Questo protocollo generale è progettata per supportare l'applicazione della piattaforma per un'ampia varietà di studi; aspetti specifici allo studio rappresentativo descritta nella presente relazione vengono separati tra parentesi Figura 2 illustra uno studio rappresentativo effettuato utilizzando il protocollo.. Si noti che nel protocollo, tutte le "istruire" i comandi sono automatizzati attraverso l'uso di script pre-determinati. Si noti anche che la Fase 2 può essere effettuata in parallelo con la fase 1 (ad esempio durante le fasi 1.7 e 1.8), e che la Fase 2.1 è spesso bypassato (perché modellata / piastre rivestite dispositivo DMF possono essere lavati e riutilizzati; vedi passo 5.2) .
1. Assemblare e popolare le camere di perfusione delle cellule
- Ricoprire le superfici interne di sterilizzato (autoclave) microcapillari (silice fusa; 679 micron od, id 534 micron; lunghezza 15 cm) con fibronectina, istruendo la pompa a siringa per disegnare una soluzione sterile di fibronectina (30 pl di 50 ug / ml) in ciascunmicrocapillari, incubando (37 ° C per 2 h), istruendo la pompa a siringa per aspirare la soluzione, e lasciando che il microcapillari secco (temperatura ambiente (RT) per 6 ore).
- Collegare ogni fibronectina rivestito microcapillare (camera di perfusione) per tubi in policarbonato (500 micron od, id 100 micron) e il tubo alla pompa siringa multi-porta, utilizzando raccordi CapTite (6 camere di perfusione, 8 porte pompa siringa).
- Con del nastro, fissare il corpo di ogni camera di perfusione ad un blocco di calore impostato temperatura desiderata (37 ° C).
- Immergere le estremità aperte delle camere di perfusione in un serbatoio (tubo microcentifuge o micropiastra bene) le celle che contengono (P388D.1 macrofagi murini) sospese in terreno di crescita fresca (RPMI-1640, 10% FBS, 500 unità / ml di penicillina, 500 mg / ml di streptomicina) alla concentrazione desiderata (10 6 cellule / ml).
- Istruire la pompa a siringa per disegnare le celle (10 ml, 10 4 cellule) in ogni camera di perfusione seguita da sufficiente air per spostare il tappo di liquido (~ 4,5 cm) alla sezione fissata al blocco di calore.
- Permettono alle cellule di aderire alle superfici interne rivestite di fibronectina delle camere di perfusione (37 ° C per 1 - 2 ore). Nel frattempo, trasferire le estremità aperte delle camere di perfusione dal serbatoio cellule per un nuovo serbatoio contenente terreno di coltura fresco.
- Dopo il periodo di adesione, istruire la pompa a siringa per inviare i tappi di liquidi (mezzi condizionati e cellule non collegata) da perdere, ritirarsi mezzo fresco (10 ml), e seguire con aria sufficiente per posizionare i nuovi tappi di liquido (mezzo fresco) sulla aderito cellule.
- Continuare a svolgere scambi medi (cioè ripetere il punto 1.7) a intervalli regolari (ogni 2 ore) fino a quando le popolazioni cellulari sono sufficientemente equilibrato ed espansa (16 - 24 ore di coltura di micro-scala generate popolazioni di ~ 1.000 cellule / camera).
2. Realizzare il dispositivo DMF e montare il mozzo Architettura
- Utilizzando telai metallici di compressione, fissare le piastre DMF in un cast polimero 14,30 con rientranze che mantengono una spaziatura 400 micron tra le piastre, questa spaziatura, unitamente al volume elettrodo azionamento (2,5 mm 2), definisce il volume delle gocce (2,5 microlitri per ogni elettrodo). Notare che DMF assemblaggio può essere realizzato con mezzi più semplici 24.
- Inserto teflonato trasferimento microcapillari (360 micron od, id 100 micron; 3,5 - lunghezza 4,0 cm) nello spazio tra le piastre DMF, posizionando ciascuno di estendere al bordo del suo affine elettrodo di azionamento.
- Al contrario end di ogni trasferimento apporre microcapillare un raccordo CapTite.
- Innestare i connettori elettrici per fornire tensione agli elettrodi ITO. Sequenze di attivazione degli elettrodi sono automatizzate con l'uso di una interfaccia elettronica controllato dal computer che esegue gli script di pre-determinati.
- Opzionale: Spostare il mozzo DMF montato sul palco traslazionale di un microscopio (SZ-6145TR (Olympus, Giappone)) dotato di un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) fotocamera (DCR-HC96 (Sony, Giappone)) per facilitare il monitoraggio delle goccioline 31.
3. Collegare le camere di perfusione al Hub DMF e stimolare le popolazioni di cellule
- Rimuovere le estremità aperte delle camere di perfusione dal serbatoio mezzo (vedere il punto 1.6) e inserirli nei raccordi CapTite fissate alle estremità del trasferimento microcapillari del mozzo DMF (vedere il punto 2.4).
- Istruire la pompa a siringa per inviare i tappi di liquidi (mezzi condizionati) nelle camere di perfusione da perdere.
- Instruct il mozzo DMF per disegnare stimolo (E. coli bioparticelle a 100 pg / ml in terreno fresco contenente 0.1% Pluronic F127 w / v) da un serbatoio di bordo e fornire una gocciolina di dimensione appropriata (10 microlitri) per ogni trasferimento microcapillari . Le bordo serbatoi sono costituiti da scomparti di forma cilindrica (1,5 x 1,5 cm ciascuno) e collegato all'hub DMF tramite un tubo.
- Istruire la pompa a siringa per disegnare lo stimolo collega al trasferimento microcapillari, e seguire con aria sufficiente per posizionare i tappi sulle popolazioni cellulari nelle camere di perfusione.
- Incubare le cellule con stimolo (37 ° C per 1 - 4 ore). Optional: Cambio di stimolo fresco (cioè ripetere i passaggi 3,2-3,4) ad intervalli regolari.
4. Terminate stimolazione e recuperare lisati cellulari per l'analisi
- Opzionale: Se è richiesto un periodo di post-stimolazione, scambiarsi gli stimoli che contengono spine liquidi per mezzo fresco (cioè ripetere i passi 3,2-30,4, sostituendo mezzo fresco di stimolo), e continuare a incubare e scambiare, se necessario.
- Scambio i tappi liquido nelle camere di perfusione per la soluzione di lavaggio (Prelude diretto Lysis Buffer Modulo B) (cioè ripetere i passaggi 3,2-3,4, in sostituzione del tampone di lavaggio per stimolo), e incubare come necessario (5 min).
- Scambio i tappi liquidi (tampone di lavaggio) per la soluzione di lisi (Preludio diretto Lysis Buffer Modulo A con 0,1% Pluronic F127 w / v) (cioè ripetere i passaggi 3,2-3,4, sostituendo la soluzione di lisi per stimolo), e incubare come necessario (5 min) .
- Istruire la pompa a siringa per inviare i tappi liquidi (lisato cellulare) al mozzo DMF.
- Smontare il mozzo DMF, rimuovere la piastra superiore del dispositivo DMF (facendo attenzione a non inclinare il piatto di lato, in quanto questo può portare a delle gocce di miscelazione), e raccogliere i lisati utilizzando una Pipetman o siringa per l'analisi off-piattaforma (profili di espressione genica tramite qPCR).
5. Clean piattaforma hardware perRiutilizzare
- Immergere il trasferimento microcapillari e raccordi CapTite in candeggina al 10% (v / v in acqua) per 10 min a RT, sciacquare bene con acqua deionizzata e asciugare con gas azoto.
- Immergere le piastre dispositivo DMF nel 10% di candeggina per 10 min a RT, sciacquare bene con isopropanolo e poi con acqua deionizzata e asciugare con azoto seguita da cottura a 160 ° C per 10 min.
- Tubi in policarbonato della pompa siringa, e polimero fuso del dispositivo DMF e telaio di compressione, può essere riutilizzato senza pulizia. La camera di perfusione microcapillari vengono scartati dopo ogni esperimento.
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Representative Results
A dimostrazione della piattaforma automatizzata, lo abbiamo utilizzato per realizzare uno studio in cui piccole popolazioni di cellule immunitarie sono state fatte crescere in colture di micro-scala, provocati con i batteri, e lisate per l'analisi off-piattaforma di risposte pro-infiammatorie (Figura 2 ).
Ognuno dei sei camere di perfusione delle cellule è stato seminato con 10 4 cellule immunitarie (P388D.1 macrofagi murini) risospeso in 10 ml di terreno di crescita. Dopo un periodo di adesione (37 ° C per 2 ore) e un fluido di scambio, ~ 500 cellule rimaste attaccate alle superfici interne di ciascuna camera (Figura 3A), misurata mediante analisi delle colture microscala repliche (cellule rilasciate mediante trattamenti chelanti e contati tramite emocitometro e microscopia ottica). Ulteriore incubazione a 37 ° C per 16 ore, con scambi medi con intervalli di 2 ore, le popolazioni di cellule espanse a ~ 1000 cellule per camera (Figura 3B) (th come misuratoanalisi approssimativa delle culture microscala repliche, come descritto sopra). In quattro delle sei camere di perfusione, le popolazioni di cellule si sono sfidati con E. coli (pHrodo bioparticelle), risospese in terreno di crescita, e consegnato ad una molteplicità di infezione (MOI) di 20 (cioè ogni cella nella popolazione è stata impugnata con 20 bioparticelle, in media). Nei restanti due camere, le popolazioni di cellule hanno ricevuto una sfida finto (cioè solo mezzo di coltura). Dopo incubazione a 37 ° C per 1 ora (due colture di batteri sfidato) o 4 ore (due batteri-sfidato, e due mock-sfidato, culture), le cellule sono state lavate e lisate, ed i lisati recuperati dal mozzo DMF. Metodi banco scala convenzionali sono stati usati per preparare cDNA da lisati, e per misurare livelli di trascrizione per mediatori dell'infiammazione: chemochine MIP-1β (CCL4) e RANTES (CCL5), ciclossigenasi inducibile COX-2 (PTGS2), e citochine (TNFa TNF ).
Figura 4 riassume i risultati di tre esperimenti replicati in modo indipendente. Abbiamo scoperto che le cellule immunitarie cresciuti e sfidati in colture di micro-scala (barre rosse) montato risposte trascrizionali pro-infiammatorie che erano sostanzialmente identici a quelli ottenuti in cellule coltivate e sfidato in colture convenzionali (barre blu). Inoltre, il (micro-scala) esperimenti a piattaforma mostrato meno variabilità (come indicato da barre di errore più piccole) e consumati minori quantità di cellule e reagenti (Tabella 1).
Figura 1. Fotografia di piattaforma automatica per Micro-Scale cellulari esperimenti di stimolazione.
Figura 2. Panoramica di un rappresentante Esperimento Platform-Enabled: profilo trascrizionale di cellule immunitarie Challenged con i batteri nelle colture micro-scala.
Figura 3. Fotografie di cellule immunitarie coltivate in un perfusione Camera micro-scala. Macrofagi murini (P388D.1 linea cellulare) sono state risospese in terreno di coltura ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml e 10 ml (10 a 4 celle) utilizzati per inizializzare una fibronectina rivestito microcapillare (camera di perfusione). Fotografie in campo chiaro state scattate con un microscopio MVX10 (Olympus) equipaggiato con una telecamera CCD (Qimaging). Per misurare la dimensione della popolazione, le cellule provenienti da culture micro-scala replicati sono stati rilasciati dalle superfici della camera di perfusione utilizzando cellule Spogliarellista, testate in base trypan blu, e contate con un emocitometro e microscopio ottico. A. B. Dopo 16 ore di coltura (incubazione a 37 ° C con scambi di media ogni 2 ore), la popolazione si era esteso a ~ 1.000 celle.
Figura 4. Profili trascrizionali delle cellule immunitarie colto e stimolato in vasi convenzionale rispetto camere di perfusione micro scala. Macrofagi murini (P388D.1 linea cellulare) sono state risospese in terreno di coltura ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml. Per colture convenzionali, 50 microlitri (5 x 10 4 cellule) sono stati utilizzati per seme 150 pl di mezzo di crescita in un pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetti, per colture micro-scala, 10 microlitri (10 4 cellule) sono stati utilizzati per seme un microcapil fibronectina rivestitelary (camera di perfusione). Dopo incubazione a 37 ° C per 16 ore, le cellule (~ 5 x 10 4 per coltura convenzionale, 10 ~ 3 per cultura micro-scala) sono state impugnate con E. coli (pHrodo bioparticelle) ad una molteplicità di infezione (MOI) di 20 (cioè 20 bioparticelle per ogni cella della cultura); controllo negativo (mock-sfidato) culture ricevuto solo mezzi freschi. Dopo ulteriore incubazione a 37 ° C per 1 o 4 ore, le cellule sono state lavate e lisate utilizzando reagenti dal Modulo Lysis diretta Prelude. Lisato RNA è stato amplificato e convertito in cDNA utilizzando Ovation PicoSL WTA, i più grandi (≥ 200 nt) prodotti cDNA purificato utilizzando Agencourt RNAClean XP, e questi prodotti utilizzati come modello nel TaqMan qPCR test per misurare i livelli di trascrizione di MIP-1β (CCL4), RANTES (CCL5), COX-2 (PTGS2), e TNFa (TNF), nonché GAPDH (per la normalizzazione dei livelli di cDNA tra lisati). Ogni saggio qPCR è stata effettuata in triplice copia, ed i risultati in media. Each esperimento è stato replicato indipendentemente tre volte. Barre indicano aumento medio volte a livelli di trascrizione nelle culture tradizionali (blu) o colture di micro-scala (rosso) sfidati con i batteri, rispetto al controllo negativo (mock-contestato) culture; barre di errore indicano la deviazione standard di tutti i tre esperimenti.
| Requisito | Esperimento convenzionale | Esperimento Micro-Scale |
| Cellule | 3.000.000 | 60.000 |
| Crescita media | 2,4 ml | 0,7 ml |
| Bioparticelle | 200 mcg | 4 microgrammi |
| Wash & Lisi Reagenti | 300 microlitri ciascuno | 60 microlitri ciascuno |
Tabella 1. Requisiti per la convenzionale rispetto Micro-Scale cellulare stimolazione Experiments. numeri vengono estratti dal esperimento rappresentativo descritto nella presente relazione (Figura 2), in cui i macrofagi murini (P388D.1 linea cellulare) sono state coltivate in sei convenzionale (micropiastra da 96 pozzetti) contro micro-scala (camera di perfusione) culture , sfidato con E. coli (pHrodo bioparticelle) ad una MOI di 20, e lisate per l'analisi qPCR.
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Discussion
Abbiamo sviluppato una piattaforma automatizzata semplice e versatile per la coltura cellulare micro-scala e di esperimenti di stimolazione. La piattaforma consente di lavorare con piccoli volumi di coltura e le popolazioni di cellule (1-20 ml e 100 - 2.000 cellule, per camera); dimensioni cultura potrebbe essere ulteriormente ridotto mediante l'utilizzo di microcapillari di diametro inferiore. Lavorare in queste scale riduce il costo degli studi di routine e rende realizzabili gli studi che richiedono l'uso di reagenti preziosi e / o cellule. Esperimenti eseguiti piattaforma mostrano anche una minore variabilità, presumibilmente a causa della precisione e riproducibilità con cui le cellule ei fluidi sono gestite dalla piattaforma automatizzata.
L'attuale configurazione della piattaforma attira le cellule e supporti da off-board serbatoi (microprovette o micropozzetti piastre) per la semina, equilibrio, e l'espansione delle popolazioni cellulari nelle camere di perfusione. Questo è un modo semplice per affrontare lo squilibrio trarequisiti medi di crescita (ad esempio 700 ml consumati in esperimento rappresentativo descritto sopra) e la capacità del dispositivo di DMF a bordo serbatoi (24 ml ciascuna). Tuttavia, questa configurazione richiede interventi manuali metà esperimento, per passare tra due serbatoi (Passo 1.6) e collegare le camere di perfusione al mozzo DMF (Passaggio 3.1). Future configurazioni potrebbero includere grande capacità (ad esempio, 1 ml) a bordo serbatoi, che consentirebbe il routing di tutti i materiali attraverso l'hub DMF, eliminando così la necessità di intervento manuale metà esperimento.
I nostri esperimenti necessari solo (<24 ore) cultura a breve termine di cellule sulla piattaforma. Abbiamo verificato che la vitalità cellulare sulla piattaforma è paragonabile a quello in colture convenzionali per almeno 24 ore (dati non mostrati). Tuttavia, non abbiamo ancora cercato di mantenere le culture sulla piattaforma per lunghi periodi di tempo. Evaporazione non è una preoccupazione importante perché della piattaformacamere di perfusione e la crescita bacini medi sono sistemi parzialmente chiuse e le spine liquido di copertura, le cellule possono essere facilmente reintegrati tramite scambio medie. D'altro canto, per mantenere il pH in colture a lungo termine può essere necessario per alloggiare i serbatoi mezzo di coltura in un 5 - 10% CO 2 nell'atmosfera o passare a un mezzo di crescita che non include un tampone pH CO 2 basato-bicarbonato . Ulteriormente, coltura a lungo termine di cellule in divisione avrebbe attivamente espandere popolazioni al punto di confluenza (cioè la copertura di tutte le superfici disponibili all'interno della camera di perfusione), che richiederebbe passaging delle cellule (rilascio, lavare, diluire, e ri-seed) . Altri hanno compiuto questo in regimi microfluidica 3,5,6,9,17 e nella sua configurazione attuale la piattaforma dovrebbe essere in grado di svolgere tutte le manipolazioni necessarie. In sintesi, possiamo anticipare che con modeste modifiche (soprattutto per i protocolli, piuttosto che hardware) la nostra piattaforma dovrebbe essere capable di supportare colture cellulari di mammifero lungo termine. Questa sembra una direzione futura particolarmente promettente perché i metodi convenzionali sono in termini di tempo e di manodopera; aggiungendo una funzionalità cultura a lungo termine per il repertorio della nostra piattaforma automatizzata sarebbe ulteriormente permettere ai suoi utenti di re-indirizzare il loro lavoro in modo più produttivo.
Anche se abbiamo testato solo alcuni tipi di cellule differenti così lontani (ad esempio la linea cellulare di macrofagi murini RAW264.7; midollo osseo murino macrofagi derivati (BMDM)), la piattaforma dovrebbe essere in grado di ospitare qualsiasi tipo di cellula aderente. In alcuni casi, può essere necessario modificare il rivestimento camera di perfusione da fibronectina ad un altro componente della matrice extracellulare (o miscela di componenti), o per cambiare il mezzo di crescita, ma queste modificazioni sono fatti facilmente. Lavora con tipi di cellule non-aderenti potrebbe essere più impegnativo, ma le strategie di tethering cellulari hanno avuto successo in contesti simili 32-34. Si should inoltre, essere possibile creare colture miste formate da più tipi cellulari, anzi, la precisione con cui la piattaforma gestisce cellule e fluidi dovrebbe garantire che la costruzione di colture miste è altamente riproducibile.
Relativamente agli stimoli, praticamente qualsiasi sostanza che può essere trasportato in un liquido acquoso spina deve essere compatibile con la nostra piattaforma 5,13,16,35. Nel caso di grandi o densi particelle che possono depositarsi nel tempo, può essere necessario per risospendere periodicamente all'interno dei serbatoi, in passato, abbiamo affrontato questo problema mediante l'uso di fluido di trasporto ad alta densità 36 o un semplice agitazione sistema (dati non mostrati), soluzioni che dovrebbero essere facili da implementare sulla nostra piattaforma.
Finora, la nostra caratterizzazione di cellule coltivate e stimolate sulla piattaforma si è concentrata principalmente su analisi RT-PCR quantitativa delle risposte pro-infiammatori caratteristici. Come passo successivo, un'analisi completa di tegli trascrittoma di popolazione cellulare (tramite DNA microarrays o Generation Sequencing (SGS) (cioè RNA-Seq 37,38)), è alla portata, con modesta modifica della fase di preparazione di cDNA, la nostra piattaforma di e protocolli dovrebbero essere pienamente in grado di supportare globale studi profilatura trascrizionale. Analogamente, l'analisi delle risposte popolazioni cellulari a livello proteico (tramite ELISA, immunoprecipitazione, spettrometria di massa, o microarray di proteine) richiede solo la modifica delle fasi di preparazione lisato. La piattaforma supporta anche l'analisi di imaging basata su risposte delle cellule. Cellule possono essere esposte all'interno della camera di perfusione (ad esempio, Figura 3), uso di piatti (anziché arrotondato) microcapillari per il modulo di camera di perfusione faciliterebbe questo tipo di analisi. Inoltre, le cellule possono essere esposte sul mozzo DMF 14,15, prima della semina delle camere di perfusione e / o dopo il rilascio da loro. Usciti cellule possono anche essere esposte fuori dila piattaforma. Finora abbiamo usato la microscopia ottica e di fluorescenza a celle di immagine a tutte queste fasi, al fine di analizzare la loro morfologia, vitalità, tasso di proliferazione, e interazioni fisiche con stimoli (ad esempio bioparticelle) e l'altro (dati non riportati). Microscopia dovrebbe inoltre consentire l'analisi del contenuto metabolita (valutata attraverso l'uso di coloranti fluorescenti), attività trascrizionale (valutata attraverso l'uso di costrutti reporter), e livelli di proteina / localizzazione (valutata attraverso l'uso di costrutti reporter, proteine fluorescenti costrutti di fusione, e / o immunocitochimica ). Usciti cellule potrebbero essere analizzati con citometria a flusso pure. Molte di queste analisi può essere effettuata esclusivamente sulla piattaforma nella sua attuale configurazione, altri richiederebbero analisi off-piattaforma o l'integrazione dei moduli specializzati microfluidica-based (ad esempio vedi riferimenti 36,39-41) nella piattaforma tramite collegamento alla DMF hub. Nel loro insieme, sembra probabile tcappello nostra piattaforma si rivelerà preziosa nel consentire analisi multi-dimensionale di piccole popolazioni di cellule, che altrimenti possono essere ottenuti soltanto attraverso l'uso di sistemi robotici molto complessi e costosi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Ronald F. Renzi e Michael S. Bartsch per i loro contributi alla progettazione e sviluppo di dispositivi di DMF e l'hub DMF. Questa ricerca è stata interamente sostenuta dal Laboratorio di Regia Programma di ricerca e sviluppo presso i Sandia National Laboratories. Sandia è un laboratorio multi-programma gestito e gestito da Sandia Corporation, una consociata interamente controllata di Lockheed Martin Corporation, per il Dipartimento della National Nuclear Security Administration di Energia degli Stati Uniti sotto contratto DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
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