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Bioengineering

माइक्रो पैमाने पर सेल उत्तेजना प्रयोगों के लिए एक बहुमुखी स्वचालित प्लेटफार्म

Published: August 6, 2013 doi: 10.3791/50597
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 4, 2
1Department of Systems Biology, Sandia National Laboratories, 2Department of Biotechnology and Bioengineering, Sandia National Laboratories, 3Canon U.S. Life Sciences, 4Department of Advanced Systems Engineering and Deployment, Sandia National Laboratories

Summary

हम सूक्ष्म पैमाने पर सेल उत्तेजना प्रयोगों के लिए एक स्वचालित सेल संस्कृति और पूछताछ के प्लेटफार्म विकसित किया है. मंच की खेती और कोशिकाओं की छोटी आबादी उत्तेजक, और आणविक विश्लेषण के लिए lysates उबरने में सरल, बहुमुखी, और सटीक नियंत्रण प्रदान करता है. मंच अच्छी तरह से कीमती कोशिकाओं और / या अभिकर्मकों उपयोग कि पढ़ाई के लिए अनुकूल है.

Introduction

(इन विट्रो विश्लेषण में) संस्कृति में बनाए रखा कोशिकाओं का अध्ययन जटिल जैविक प्रणालियों और मानव स्वास्थ्य गवर्निंग मौलिक सिद्धांतों और आणविक तंत्र में अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान की है. संस्कृति, उत्तेजना, और पेट्री डिश और microtiter प्लेट का उपयोग जो विश्लेषण के लिए कोशिकाओं, के संग्रह के लिए पारंपरिक तरीकों मिली लीटर पैमाने संस्कृति मात्रा में कोशिकाओं (≥ 10 5) (≥ 0.1 मिलीलीटर) की बड़ी आबादी के अध्ययन के लिए डिजाइन किए गए थे. हालांकि, वहाँ की कोशिकाओं के केवल सीमित मात्रा में उपलब्ध हैं, जिनमें कई मामलों (जैसे प्राथमिक कोशिकाओं) कर रहे हैं, या कोशिकाओं की छोटी आबादी (जैसे जनसंख्या भर में सेल करने वाली सेल परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए) वांछनीय हैं, या आवश्यक अभिकर्मकों प्राप्त करना कठिन है या बेहद महंगा (जैसे शुद्ध सेल secreted कारकों). इस तरह के मुद्दों को सफलतापूर्वक संस्कृति आकार नीचे स्केलिंग द्वारा संबोधित किया जा सकता है, जो सभी की खपत को कम करने के अतिरिक्त लाभ हैअभिकर्मकों इन विट्रो विश्लेषण 1,2 में के लिए आवश्यक है. दुर्भाग्य से, परंपरागत उपकरणों और तरीकों सूक्ष्म पैमाने संस्कृतियों और 3-11 बहुत जटिल और सबसे प्रयोगशालाओं द्वारा नियमित प्रयोग के लिए विशेष कर रहे हैं वर्तमान में उपलब्ध microfluidics आधारित स्वचालित प्रणाली के सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने में गड़बड़ी का समर्थन नहीं करते.

सूक्ष्म पैमाने संस्करणों में (1 - 20 μl) - इस रिपोर्ट में, हम स्वचालित संस्कृति, उत्तेजना, और कोशिकाओं की छोटी आबादी (2,000 कोशिकाओं 100) की वसूली के लिए एक सरल और बहुमुखी प्रौद्योगिकी मंच के विधानसभा और उपयोग का वर्णन. fibronectin लेपित microcapillaries ("सेल छिड़काव कक्षों" मॉड्यूल) सूक्ष्म पैमाने संस्कृतियों की स्थापना, रखरखाव, और उत्तेजना के लिए साइट के रूप में कार्य करता है का एक सेट है, और एक डिजिटल microfluidics (DMF: मंच वास्तुकला (चित्रा 1) के डिजाइन में मॉड्यूलर है "स्थानांतरण" microcapillaries ("केंद्रीय हब" मॉड्यूल) 14,15 मार्गों कोशिकाओं के साथ outfitted) 12,13 डिवाइसऔर करने के लिए और छिड़काव कक्षों से अभिकर्मकों. DMF उपयोगकर्ता को व्यक्तिगत रूप से एक साथ कई बूंदों को संबोधित करने और डिवाइस हार्डवेयर बदलने के बिना जोड़तोड़ (यानी पुन: कॉन्फ़िगर नमूना प्रसंस्करण गाड़ियों) बदलने के लिए या फिर से ऑर्डर करने के लिए सक्षम बनाता है. अपनी जबरदस्त लचीलापन सेल संस्कृति 16,17, एंजाइम assays के 18,19, immunoassays 20,21, डीएनए विश्लेषण 22,23, प्रोटीन प्रसंस्करण, 24,25 सहित आवेदन की एक विस्तृत श्रृंखला में एक प्रमुख प्रौद्योगिकी के रूप में अपने हाल के उद्भव में स्पष्ट है और नैदानिक ​​नमूना प्रसंस्करण. 26,27 हमारे केंद्रीय हब DMF के उपकरणों के लिए निहित लचीलेपन का लाभ लेता है, और आगे विशेष परिधीय में जोड़तोड़ की एक सबसेट (जैसे सेल संस्कृति) से बाहर ले जाने का अवसर प्रदान करता है जो microcapillary इंटरफेस, के अलावा के माध्यम से यह बढ़ाता है बल्कि DMF डिवाइस पर ही से मॉड्यूल. इस तरह से प्रसंस्करण गाड़ियों की compartmentalization भी पीएलए के डिजाइन सरलtform वास्तुकला (सभी प्रसंस्करण कदम बाहर ले जा सकता है कि एक DMF उपकरण का निर्माण करने की जरूरत नहीं) और नए कार्य के रूप में इसके विकास की सुविधा (केवल आवश्यक के रूप में नए परिधीय मॉड्यूल को एकीकृत) के लिए आवश्यक हैं. केंद्रीय हब के भीतर कोशिकाओं और अभिकर्मकों के परिवहन DMF डिवाइस 13,28 भीतर इलेक्ट्रोड की अनुक्रमिक सक्रियण द्वारा उत्पन्न बलों electrowetting से प्रेरित है, से, परिवहन के लिए, और छिड़काव कक्षों के भीतर एक उच्च परिशुद्धता सिरिंज से उत्पन्न दबाव में परिवर्तन द्वारा संचालित है पंप. इन द्रव आंदोलनों के सभी एक सरल इलेक्ट्रॉनिक इंटरफेस के माध्यम से नियंत्रित और पूर्व निर्धारित स्क्रिप्ट के उपयोग के माध्यम से स्वचालित रहे हैं.

एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, हम बैक्टीरिया के साथ चुनौती (चित्रा 2) पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं में हासिल transcriptional प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए मंच के उपयोग के प्रदर्शन. मंच पर इन प्रयोगों से बाहर ले जाने के लिए हमें कोशिकाओं की कम संख्या (experimen प्रति ~ 1000 के साथ काम करने के लिए सक्षमताल हालत), प्रयोग करने के लिए प्रयोग परिवर्तनशीलता, संरक्षण अभिकर्मकों, और श्रम हाथों पर फिर से प्रत्यक्ष कम से कम. यह प्रदान करता है कि लाभ, साथ ही इसकी पहुंच और बहुमुखी प्रतिभा को देखते हुए, इस मंच प्रयोगशालाओं और अनुप्रयोगों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल पाते हैं और केवल सीमित मात्रा में उपलब्ध हैं कि कोशिकाओं और उत्तेजनाओं के विश्लेषण की सुविधा में विशेष रूप से उपयोगी साबित करना चाहिए.

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Protocol

यह सामान्य प्रोटोकॉल के अध्ययन की एक विस्तृत विविधता के लिए मंच के आवेदन का समर्थन करने के लिए बनाया गया है, इस रिपोर्ट में वर्णित प्रतिनिधि अध्ययन के विशिष्ट पहलुओं कोष्ठक में बाहर अलग हो रहे हैं चित्रा 2 प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है एक प्रतिनिधि अध्ययन दिखाता है.. प्रोटोकॉल में, सभी "हिदायत" आदेशों पूर्व निर्धारित स्क्रिप्ट के उपयोग के माध्यम से स्वचालित रहे हैं कि ध्यान दें. चरण 2 चरण 1 (कदम 1.7 और 1.8 के दौरान उदाहरण के लिए) के साथ समानांतर में किया जा सकता है वह भी ध्यान दें, और उस चरण 2.1 अक्सर नजरअंदाज कर रहा है (नमूनों / लेपित DMF डिवाइस प्लेट धोया और फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि कदम 5.2 देखें) .

1. सेल छिड़काव चेम्बर्स इकट्ठा और आबाद

  1. कोट निष्फल (autoclaved) microcapillaries (इनकार सिलिका 15 सेमी लंबा, 679 माइक्रोन आयुध डिपो, 534 माइक्रोन आईडी) की भीतरी सतहों एक बाँझ fibronectin समाधान (50 माइक्रोग्राम / एमएल के 30 μl) आकर्षित करने के लिए सिरिंज पंप आज्ञा से फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ, प्रत्येक मेंmicrocapillary,, (37 2 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस) incubating समाधान वापस लेने के लिए सिरिंज पंप निर्देश, और microcapillaries शुष्क (6 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आर टी)) दे.
  2. CapTite फिटिंग (6 छिड़काव कक्षों, 8 बंदरगाह सिरिंज पंप) का उपयोग कर, पॉलीकार्बोनेट ट्यूबिंग (500 माइक्रोन आयुध डिपो, 100 माइक्रोन आईडी) और मल्टी पोर्ट सिरिंज पंप टयूबिंग के लिए प्रत्येक fibronectin लेपित microcapillary (छिड़काव चैम्बर) कनेक्ट.
  3. टेप का प्रयोग, वांछित तापमान को निर्धारित एक गर्मी ब्लॉक (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए प्रत्येक छिड़काव चैम्बर के शरीर सुरक्षित.
  4. एक जलाशय में छिड़काव कक्षों का खुला समाप्त होता है (अच्छी तरह microcentifuge ट्यूब या microtiter प्लेट) ताजा मध्यम विकास में निलंबित युक्त कोशिकाओं (P388D.1 murine मैक्रोफेज) (RPMI 1640, 10% FBS, 500 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, 500 ग्राम विसर्जित / वांछित एकाग्रता (10 6 कोशिकाओं / एमएल) में मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन).
  5. पर्याप्त एअर इंडिया द्वारा पीछा प्रत्येक छिड़काव चैम्बर में कोशिकाओं (10 μl, 10 4 कोशिकाओं) आकर्षित करने के लिए सिरिंज पंप हिदायतआर गर्मी ब्लॉक करने के लिए सुरक्षित अनुभाग को तरल प्लग (~ 4.5 सेमी) ले जाने के लिए.
  6. कोशिकाओं छिड़काव कक्षों के fibronectin लेपित भीतरी सतहों (- 2 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 1) का पालन करने की अनुमति दें. इस बीच, कोशिकाओं जलाशय से ताजा मध्यम विकास युक्त एक नए जलाशय के लिए छिड़काव कक्षों के खुले अंत हस्तांतरण.
  7. पालन ​​अवधि के बाद, बर्बाद ताजा मध्यम (10 μl) को वापस लेने, और पालन से अधिक नए तरल प्लग (ताजा मध्यम) की स्थिति के लिए पर्याप्त हवा के साथ पालन करने के लिए तरल प्लग (वातानुकूलित मीडिया और स्वाधीन कोशिकाओं) भेजने के लिए सिरिंज पंप हिदायत कोशिकाओं.
  8. सेल आबादी (- ~ 1000 कोशिकाओं / कक्ष के सूक्ष्म पैमाने संस्कृति उत्पन्न आबादी का 24 घंटे 16) पर्याप्त equilibrated और विस्तारित कर रहे हैं जब तक नियमित अंतराल (हर 2 घंटे) में मध्यम एक्सचेंजों (यानी दोहराने कदम 1.7) से बाहर ले जाने के लिए जारी.

2. DMF डिवाइस बनाना और हब वास्तुकला इकट्ठा

    14,29 वर्णित पैटर्न Teflon वायुसेना के एनएम. ऊपर के रूप में, कोटिंग द्वारा Teflon वायुसेना के साथ एक unpatterned इतो ग्लास सब्सट्रेट DMF डिवाइस के शीर्ष प्लेट फार्म.
  1. , इस रिक्ति, प्रवर्तन इलेक्ट्रोड आकार (2.5 मिमी 2) के साथ संयुक्त छोटी बूंद मात्रा (2.5 μl परिभाषित करता है, धातु संपीड़न फ्रेम का उपयोग करना, प्लेटों के बीच एक 400 मीटर दूरी बनाए रखने कि recesses के साथ एक बहुलक डाली 14,30 में DMF प्लेटों को ठीक इलेक्ट्रोड प्रति). DMF विधानसभा सरल साधन 24 से पूरा किया जा सकता है ध्यान दें.
  2. सम्मिलित Teflon लेपित स्थानांतरण microcapillaries (360 माइक्रोन आयुध डिपो, 100 माइक्रोन आईडी, 3.5-4.0 सेमी लंबे) DMF प्लेटों के बीच अंतरिक्ष में, अपने आत्मीय प्रवर्तन इलेक्ट्रोड के किनारे करने के लिए विस्तार करने के लिए प्रत्येक स्थिति.
  3. विपरीत एन के लिएप्रत्येक हस्तांतरण microcapillary प्रत्यय एक CapTite फिटिंग की घ.
  4. इतो इलेक्ट्रोड वोल्टेज की आपूर्ति के लिए बिजली कनेक्टर्स व्यस्त हैं. इलेक्ट्रोड सक्रियण दृश्यों पूर्व निर्धारित स्क्रिप्ट चला रहा है एक कंप्यूटर नियंत्रित इलेक्ट्रॉनिक अंतरफलक के उपयोग के माध्यम से स्वचालित रहे हैं.
  5. वैकल्पिक: बूंदों की ट्रैकिंग की सुविधा के लिए एक प्रभारी युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा (dcr-HC96 (सोनी, जापान)) के साथ सुसज्जित एक माइक्रोस्कोप की translational मंच (SZ-6145TR (ओलिंप, जापान)) पर इकट्ठे DMF हब ले जाएँ . 31

3. DMF के हब के लिए छिड़काव मंडलों कनेक्ट और सेल आबादी उत्तेजित

  1. मध्यम जलाशय से छिड़काव कक्षों का खुला समाप्त होता है (चरण 1.6 देखें) निकालें और DMF हब के हस्तांतरण microcapillaries (2.4 कदम देखें) के सिरों से चिपका CapTite फिटिंग में उन्हें डालने.
  2. बर्बाद करने के लिए छिड़काव कक्षों में तरल प्लग (वातानुकूलित मीडिया) भेजने के लिए सिरिंज पंप आज्ञा.
  3. इंस्टएक पर बोर्ड जलाशय से (ई. कोलाई 0.1% Pluronic F127 w / वी के साथ ताजा मध्यम में 100 माइक्रोग्राम / एमएल bioparticles) प्रेरणा आकर्षित और प्रत्येक हस्तांतरण microcapillary को उचित आकार (10 μl) की एक छोटी बूंद देने के लिए DMF हब ruct . पर बोर्ड जलाशयों बेलनाकार आकार डिब्बों (1.5 x 1.5 सेमी) के शामिल है और टयूबिंग के माध्यम से DMF हब से जुड़े हैं.
  4. प्रोत्साहन हस्तांतरण microcapillaries में प्लग आकर्षित, और छिड़काव कक्षों में सेल आबादी के ऊपर प्लग की स्थिति के लिए पर्याप्त हवा के साथ पालन करने के लिए सिरिंज पंप आज्ञा.
  5. उत्तेजना के साथ कोशिकाओं (- 4 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 1) सेते हैं. वैकल्पिक: नियमित अंतराल पर ताजा प्रोत्साहन (यानी दोहराने कदम 3.2-3.4) के लिए एक्सचेंज.

4. उत्तेजना बर्खास्त और विश्लेषण के लिए सेल lysates पुनर्प्राप्त

  1. वैकल्पिक: एक के बाद उत्तेजना अवधि की आवश्यकता है, (यानी दोहराने कदम 3.2 ताजा माध्यम के लिए प्रोत्साहन युक्त तरल प्लग आदान - 3.4,) प्रोत्साहन के लिए ताजा मध्यम प्रतिस्थापन, और सेते हैं और जरूरत के रूप में आदान प्रदान जारी है.
  2. विनिमय धोने बफर (प्रस्तावना प्रत्यक्ष Lysis मॉड्यूल बफर बी) (यानी दोहराने कदम 3.2-3.4, प्रोत्साहन के लिए धोने बफर प्रतिस्थापन) के लिए छिड़काव कक्षों में तरल प्लग, और के रूप में (5 मिनट) की जरूरत सेते हैं.
  3. विनिमय lysis समाधान के लिए तरल प्लग (बफर धोने) (प्रस्तावना प्रत्यक्ष Lysis मॉड्यूल बफर 0.1% Pluronic F127 w / वी) के साथ (यानी दोहराने कदम 3.2-3.4, प्रोत्साहन के लिए सेल समाधान प्रतिस्थापन), और सेते रूप में की जरूरत (5 मिनट) .
  4. DMF के हब के लिए तरल प्लग (सेल lysates) भेजने के लिए सिरिंज पंप आज्ञा.
  5. DMF हब जुदा, DMF डिवाइस (इस छोटी बूंद मिश्रण में परिणाम के रूप में, बग़ल में थाली झुकाव नहीं देखभाल का उपयोग) के शीर्ष प्लेट हटाने, और बंद मंच के विश्लेषण के लिए एक Pipetman या सिरिंज का उपयोग lysates (जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा एकत्र qPCR के माध्यम से).

5. के लिए स्वच्छ प्लेटफार्म हार्डवेयरपुनः उपयोग

  1. आरटी पर 10 मिनट के लिए 10% ब्लीच में स्थानांतरण microcapillaries और CapTite फिटिंग (पानी में वी / वी) विसर्जित कर दिया, नाइट्रोजन गैस का उपयोग विआयनीकृत पानी, और सूखे के साथ अच्छी तरह कुल्ला.
  2. आरटी पर 10 मिनट के लिए 10% ब्लीच में DMF डिवाइस प्लेटें विसर्जित कर दिया, isopropanol के साथ अच्छी तरह कुल्ला विआयनीकृत पानी के द्वारा पीछा किया, और सूखे का उपयोग कर नाइट्रोजन गैस 10 मिनट के लिए 160 डिग्री सेल्सियस पर पाक द्वारा पीछा किया.
  3. सिरिंज पंप के पॉलीकार्बोनेट ट्यूबिंग, और DMF डिवाइस के बहुलक डाली और सम्पीडन फ्रेम, सफाई के बिना फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है. छिड़काव चैम्बर microcapillaries प्रत्येक प्रयोग के बाद खारिज कर रहे हैं.

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Representative Results

स्वचालित मंच के एक प्रदर्शन के रूप में, हम यह जीवाणु के साथ चुनौती दी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की छोटी आबादी सूक्ष्म पैमाने संस्कृतियों में बड़े हो रहे थे, जिसमें एक अध्ययन से बाहर ले जाने के लिए प्रयोग किया जाता है, और (2 चित्रा समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के बंद मंच के विश्लेषण के लिए lysed ).

छह सेल छिड़काव कक्षों में से प्रत्येक मध्यम विकास के 10 μl में resuspended 10 4 प्रतिरक्षा कोशिकाओं (P388D.1 murine मैक्रोफेज) के साथ वरीयता प्राप्त किया गया था. एक पालन अवधि (37 ° 2 घंटे के लिए सी) और एक मध्यम विनिमय के बाद, ~ 500 कोशिकाओं के रूप में दोहराने microscale संस्कृतियों का विश्लेषण (कोशिकाओं chelator उपचार के माध्यम से जारी किया और गिना के माध्यम से मापा प्रत्येक कक्ष (चित्रा 3) के आंतरिक सतहों से जुड़ी बने hemacytometer और प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से). 2 घंटे के अंतराल पर मध्यम एक्सचेंजों के साथ 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे ऊष्मायन, कक्ष ~ प्रति 1,000 कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) (के रूप में मापा वें लिए सेल आबादी का विस्तारजैसा कि ऊपर वर्णित दोहराने microscale संस्कृतियों,) के किसी न किसी विश्लेषण. छह छिड़काव कक्षों में से चार में, सेल आबादी ई. के साथ चुनौती दी थी कोलाई बैक्टीरिया (pHrodo bioparticles), मध्यम विकास में resuspended, और 20 के संक्रमण की बहुलता (MOI) (यानी आबादी में प्रत्येक कोशिका औसत पर, 20 bioparticles के साथ चुनौती दी गई थी) को जन्म दिया. शेष दो कक्षों में, सेल आबादी एक नकली चुनौती (केवल यानी मध्यम विकास) प्राप्त किया. 1 घंटा (दो बैक्टीरिया को चुनौती दी संस्कृतियों) या 4 घंटे (दो बैक्टीरिया को चुनौती दी है, और दो, संस्कृतियों नकली चुनौती दी है) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं धोया और lysed, और lysates DMF हब से बरामद किए गए. Chemokines एमआईपी 1β (CCl4) और RANTES (CCL5), inducible cyclooxygenase कॉक्स -2 (पीटीजीएस 2), और साइटोकाइन TNFα (TNF: परम्परागत बेंच पैमाने तरीकों lysates से सीडीएनए तैयार करने के लिए, और सूजन मध्यस्थों के लिए प्रतिलेख के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया ).

चित्रा 4 तीन स्वतंत्र रूप से दोहराया प्रयोगों से परिणाम का सार. हम प्रतिरक्षा कोशिकाओं (नीले सलाखों) हो गई है और पारंपरिक संस्कृतियों में चुनौती दी कोशिकाओं में हासिल उन लोगों के लिए अनिवार्य रूप से समान थे कि समर्थक भड़काऊ transcriptional प्रतिक्रियाओं मुहिम शुरू हो गई है और सूक्ष्म पैमाने संस्कृतियों (लाल बार) में चुनौती दी है कि पाया. इसके अलावा, पर मंच (सूक्ष्म पैमाने पर) प्रयोगों कम परिवर्तनशीलता (जैसा कि छोटे त्रुटि सलाखों से संकेत) से पता चला है और कोशिकाओं और अभिकर्मकों की छोटी मात्रा (1 टेबल) का सेवन किया.

चित्रा 1
चित्रा 1. माइक्रो स्केल सेल उत्तेजना प्रयोगों के लिए स्वचालित प्लेटफार्म की तस्वीर.

चित्रा 2
चित्रा 2. माइक्रो स्केल संस्कृतियों में जीवाणु के साथ चुनौती दी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के transcriptional रूपरेखा: एक प्रतिनिधि प्लेटफार्म सक्रिय प्रयोग का अवलोकन.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रतिरक्षा कोशिकाओं के फोटो Murine मैक्रोफेज (P388D.1 सेल लाइन) 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में वृद्धि मध्यम में resuspended थे. एक माइक्रो पैमाने पर छिड़काव चैंबर में सुसंस्कृत, और 10 μl (10 4 कोशिकाओं) बीज एक fibronectin के लिए इस्तेमाल किया (छिड़काव चैम्बर) microcapillary में लिपटे. उज्ज्वल क्षेत्र तस्वीरें एक सीसीडी कैमरा (QImaging) के साथ सुसज्जित एक MVX10 माइक्रोस्कोप (ओलिंप) का उपयोग कर लिया गया. जनसंख्या के आकार को मापने के लिए, दोहराने सूक्ष्म पैमाने संस्कृतियों से कोशिकाओं, सेल खाल का उपयोग कर छिड़काव चैम्बर सतहों से जारी trypan नीले रंग का उपयोग कर दाग, और एक hemacytometer और प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग गिना रहे थे. ए बी (37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के साथ मध्यम एक्सचेंजों हर 2 घंटे), जनसंख्या ~ 1000 कोशिकाओं को विस्तार किया था.

चित्रा 4
4 चित्रा. प्रतिरक्षा कोशिकाओं के transcriptional प्रोफाइल माइक्रो पैमाने पर छिड़काव मंडलों बनाम पारंपरिक वेसल्स में सुसंस्कृत और प्रेरित. Murine मैक्रोफेज (P388D.1 सेल लाइन) 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में वृद्धि मध्यम में resuspended थे. पारंपरिक संस्कृतियों के लिए, 50 μl (5 एक्स 10 4 कोशिकाओं) एक 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट के एक कुएं में मध्यम विकास का बीज 150 μl के लिए इस्तेमाल किया गया, सूक्ष्म पैमाने संस्कृतियों, 10 μl (10 4 कोशिकाओं) के लिए बीज का उपयोग किया गया एक fibronectin लेपित microcapilलैरी (छिड़काव चैम्बर). 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं (सूक्ष्म पैमाने संस्कृति प्रति ~ 5 एक्स 10 4 पारंपरिक संस्कृति के अनुसार, ~ 10 3) ई. के साथ चुनौती दी थी 20 के संक्रमण की बहुलता (MOI) (कि, संस्कृति में प्रत्येक कक्ष के लिए 20 bioparticles है) पर कोलाई बैक्टीरिया (pHrodo bioparticles); नकारात्मक नियंत्रण (नकली चुनौती दी) संस्कृतियों केवल ताजा मीडिया प्राप्त किया. 37 पर आगे ऊष्मायन के बाद ° 1 या 4 घंटे के लिए सी, कोशिकाओं धोया और प्रस्तावना प्रत्यक्ष Lysis मॉड्यूल से अभिकर्मकों का उपयोग lysed थे. Lysate शाही सेना, प्रवर्धित और उपयोग कर सीडीएनए तालियाँ PicoSL डब्ल्यूटीए, Agencourt RNAClean XP का उपयोग कर शुद्ध बड़ा (≥ 200 NT) सीडीएनए उत्पादों, और एमआईपी 1β (CCl4) के लिए प्रतिलेख के स्तर को मापने के लिए TaqMan qPCR assays में टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल इन उत्पादों के लिए परिवर्तित कर दिया गया RANTES (CCL5), कॉक्स -2 (पीटीजीएस 2), और TNFα (TNF), और साथ ही GAPDH (lysates के बीच सीडीएनए के स्तर को सामान्य बनाने के लिए). प्रत्येक qPCR परख तीन प्रतियों में किया जाता है, और परिणाम औसत था. Eaचर्चा प्रयोग स्वतंत्र रूप से तीन बार दोहराया गया था. बार्स पारंपरिक संस्कृतियों में प्रतिलेख के स्तर में औसत गुना वृद्धि (नीला) के रूप में या नकारात्मक नियंत्रण (नकली चुनौती दी) संस्कृतियों की तुलना में बैक्टीरिया के साथ चुनौती दी सूक्ष्म पैमाने संस्कृतियों (लाल), संकेत मिलता है, त्रुटि सलाखों तीन प्रयोगों भर में मानक विचलन का संकेत मिलता है.

आवश्यकता परम्परागत प्रयोग माइक्रो स्केल प्रयोग
प्रकोष्ठों 3000000 60,000
मध्यम विकास 2.4 मिलीलीटर 0.7 मिलीलीटर
Bioparticles 200 माइक्रोग्राम 4 ग्राम
धो और Lysis अभिकर्मकों 300 μl प्रत्येक 60 μl प्रत्येक

तालिका 1. परम्परागत बनाम माइक्रो स्केल सेल उत्तेजना प्रयोग के लिए आवश्यकताएँएस. नंबर प्रतिनिधि murine मैक्रोफेज (P388D.1 सेल लाइन) छह पारंपरिक (96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट) में बड़े हो रहे थे जिसमें इस रिपोर्ट में वर्णित प्रयोग (चित्रा 2), बनाम सूक्ष्म पैमाने (छिड़काव चैम्बर) संस्कृतियों से तैयार कर रहे हैं , ई. के साथ चुनौती दी एक MOI के 20 में से कम कोलाई बैक्टीरिया (pHrodo bioparticles), और qPCR विश्लेषण के लिए lysed.

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Discussion

हम सूक्ष्म पैमाने पर सेल संस्कृति और उत्तेजना प्रयोगों के लिए एक सरल और बहुमुखी स्वचालित प्लेटफार्म विकसित किया है. संस्कृति आकार के आगे छोटे व्यास की microcapillaries के उपयोग के माध्यम से कम किया जा सकता है, मंच हमें छोटे संस्कृति मात्रा और सेल आबादी (- - 20 μl और 100 2,000 कोशिकाओं, चैम्बर प्रति 1) के साथ काम करने के लिए सक्षम बनाता है. इन पैमानों पर कार्य करना दिनचर्या पढ़ाई की लागत कम कर देता है और कीमती अभिकर्मकों और / या कोशिकाओं के उपयोग की आवश्यकता है कि संभव पढ़ाई करता है. मंच से मार डाला प्रयोगों को भी कोशिकाओं और तरल पदार्थ स्वचालित मंच द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसके साथ सटीक और reproducibility के लिए संभवतः कारण कम परिवर्तनशीलता दिखा.

मंच के मौजूदा विन्यास बोने, संतुलन, और छिड़काव कक्षों में सेल आबादी के विस्तार के लिए बंद बोर्ड जलाशयों (microcentrifuge ट्यूबों या microtiter प्लेट कुओं) से कोशिकाओं और मीडिया खींचता है. इस बीच बेमेल का पता करने के लिए एक सरल तरीका हैमध्यम विकास आवश्यकताओं (उदाहरण के लिए ऊपर वर्णित प्रतिनिधि प्रयोग में खपत 700 μl) और DMF डिवाइस की क्षमता जलाशयों (24 μl प्रत्येक) पर बोर्ड है. हालांकि, इस विन्यास दो जलाशयों (चरण 1.6) के बीच स्विच और DMF हब (3.1 चरण) के लिए छिड़काव कक्षों कनेक्ट करने के लिए, मध्य प्रयोग मैनुअल हस्तक्षेप आवश्यक. भविष्य विन्यास मध्य प्रयोग मैनुअल हस्तक्षेप की आवश्यकता जिससे नष्ट करने, DMF के केंद्र के माध्यम से सभी सामग्री का मार्ग सक्षम होगा, पर बोर्ड जलाशयों (जैसे 1 मिलीलीटर) बड़ी क्षमता शामिल हो सकते हैं.

हमारे प्रयोगों मंच पर कोशिकाओं की अल्पकालिक (<24 घंटे) संस्कृति ही जरूरी है. हम मंच पर सेल व्यवहार्यता कम से कम 24 घंटे (नहीं दिखाया डेटा) के लिए पारंपरिक संस्कृतियों में बराबर है कि सत्यापित किया है. हालांकि, हम अभी तक समय की लंबी अवधि के लिए मंच पर संस्कृतियों को बनाए रखने की कोशिश नहीं की है. वाष्पीकरण एक प्रमुख चिंता का विषय नहीं है क्योंकि मंचछिड़काव संगठनों और मध्यम विकास जलाशयों आंशिक रूप से बंद कर दिया प्रणालियों रहे हैं और कोशिकाओं को कवर तरल प्लग आसानी से मध्यम विनिमय के माध्यम से मंगाया जाता है. दूसरी ओर, दीर्घकालिक संस्कृतियों में पीएच बनाए रखने के लिए यह एक 5 में वृद्धि मध्यम जलाशयों घर के लिए आवश्यक हो सकता है - एक सीओ 2 के बाइकार्बोनेट आधारित पीएच बफर शामिल नहीं है कि 10% सीओ 2 के वातावरण या एक मध्यम विकास के लिए स्विच . इसके अतिरिक्त, सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं के दीर्घकालिक संस्कृति confluency के मुद्दे पर आबादी का विस्तार होगा (छिड़काव कक्ष के भीतर सभी उपलब्ध सतहों यानी कवरेज), (रिहाई, धोने, पतला, और फिर बीज) कोशिकाओं की passaging की जरूरत होगी जो . दूसरों microfluidic व्यवस्थाओं 3,5,6,9,17 में यह सिद्ध कर दिया है और इसके वर्तमान विन्यास में मंच आवश्यक जोड़तोड़ के सभी बाहर ले जाने के लिए सक्षम होना चाहिए. संक्षेप में, हम मामूली संशोधन (मुख्य रूप से बल्कि हार्डवेयर से प्रोटोकॉल के लिए) के साथ हमारे मंच ग होना चाहिए कि आशालंबी अवधि के स्तनधारी सेल संस्कृति का समर्थन करने का apable. पारंपरिक तरीकों समय लेने वाली और श्रम प्रधान हैं क्योंकि यह एक विशेष रूप से आशाजनक भविष्य की दिशा प्रतीत होता है, हमारी स्वचालित मंच के प्रदर्शनों की सूची के लिए एक दीर्घकालिक संस्कृति क्षमता जोड़ने के आगे अपने उपयोगकर्ताओं को अधिक उत्पादक अपने श्रम को पुनः निर्देशित करने के लिए सक्षम होगा.

हम इस प्रकार अब तक केवल कुछ ही विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं (जैसे murine बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन RAW264.7; murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDM)) का परीक्षण किया है, मंच वस्तुतः किसी भी पक्षपाती सेल प्रकार समायोजित करने में सक्षम होना चाहिए. कुछ मामलों में, यह फ़ाइब्रोनेक्टिन से एक और बाह्य मैट्रिक्स घटक (या घटकों का मिश्रण) के लिए छिड़काव चैम्बर कोटिंग बदलने के लिए, या मध्यम विकास बदलने के लिए आवश्यक हो सकता है, लेकिन इन संशोधनों को आसानी से बना रहे हैं. गैर पक्षपाती प्रकार की कोशिकाओं के साथ काम और अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है, लेकिन सेल tethering रणनीतियों समान संदर्भों 32-34 में सफल रहे हैं. यह थानेदारuld भी अनेक प्रकार की कोशिकाओं के शामिल मिश्रित संस्कृतियों बनाने के लिए संभव हो सकता है, वास्तव में, मंच कोशिकाओं और तरल पदार्थ संभालती है जो परिशुद्धता के साथ मिश्रित संस्कृतियों की कि निर्माण अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है यह सुनिश्चित करना चाहिए.

उत्तेजनाओं के संबंध में, एक जलीय तरल प्लग के भीतर ले जाया जा सकता है कि वास्तव में किसी भी पदार्थ हमारे मंच 5,13,16,35 साथ संगत होना चाहिए. समय के साथ बाहर समझौता कर सकते हैं, जो बड़े या घने कणों के मामले में, यह समय - समय जलाशयों के भीतर उन्हें resuspend करने के लिए आवश्यक हो सकता है, अतीत में, हम उच्च घनत्व वाहक द्रव 36 के उपयोग के माध्यम से इस मुद्दे को संबोधित या एक साधारण आंदोलन है प्रणाली (नहीं दिखाया डेटा), हमारे मंच पर आसानी से लागू किया जाना चाहिए कि समाधान.

इस प्रकार अब तक, मंच पर सभ्य और उत्तेजित कोशिकाओं के हमारे लक्षण वर्णन मुख्यतः बानगी समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के QRT-पीसीआर विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया है. टी के एक अगला कदम है, व्यापक विश्लेषण के रूप मेंवह सेल आबादी के transcriptome (डीएनए या पीढ़ी के अनुक्रमण (एसजीएस) (यानी आरएनए Seq 37,38) के माध्यम से), अच्छी तरह से पहुंच के भीतर है, सीडीएनए तैयारी कदम की मामूली संशोधन के साथ, हमारे मंच और प्रोटोकॉल वैश्विक समर्थन की पूरी तरह से सक्षम होना चाहिए ट्रांसक्रिप्शनल रूपरेखा पढ़ाई. इसी तरह, प्रोटीन के स्तर पर सेल आबादी प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण (एलिसा, immunoprecipitation, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, या प्रोटीन के माध्यम से) lysate तैयारी चरणों का केवल संशोधन की आवश्यकता चाहिए. मंच भी सेल प्रतिक्रिया की इमेजिंग आधारित विश्लेषण का समर्थन करता है. प्रकोष्ठों छिड़काव चैम्बर (जैसे चित्रा 3) के भीतर imaged किया जा सकता है, छिड़काव चैम्बर मॉड्यूल के लिए (गोल के बजाय) फ्लैट सामने microcapillaries के उपयोग के विश्लेषण के इस प्रकार की सुविधा होगी. इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं से पहले छिड़काव कक्षों और / या उनमें से रिहाई के बाद से बोने के लिए, DMF हब 14,15 पर imaged किया जा सकता है. विमोचन कोशिकाओं को भी बंद imaged किया जा सकता हैमंच. इस प्रकार अब तक, हम उत्तेजनाओं (जैसे bioparticles) और एक दूसरे को (डेटा) नहीं दिखाया. साथ उनकी आकारिकी, व्यवहार्यता, प्रसार दर, और शारीरिक संबंधों का विश्लेषण करने के क्रम में इन चरणों के सभी पर छवि कोशिकाओं को प्रकाश और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया है माइक्रोस्कोपी भी (फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग के माध्यम से मूल्यांकन) मेटाबोलाइट सामग्री के विश्लेषण के लिए सक्षम होना चाहिए, transcriptional गतिविधि (संवाददाता निर्माणों के उपयोग के माध्यम से मूल्यांकन), और प्रोटीन का स्तर / स्थानीयकरण (संवाददाता निर्माणों, फ्लोरोसेंट प्रोटीन संलयन निर्माणों, और / या immunocytochemistry के उपयोग के माध्यम से मूल्यांकन ). विमोचन कोशिकाओं प्रवाह cytometry के रूप में अच्छी तरह से उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है. इन विश्लेषण से कई अपने मौजूदा विन्यास में मंच पर पूरी तरह से बाहर किया जा सकता है, दूसरों DMF के लिए कनेक्शन के माध्यम से मंच में (उदाहरण के संदर्भ 36,39-41 देखें) विशेष microfluidics आधारित मॉड्यूल के बंद के प्लेटफार्म विश्लेषण या एकीकरण की आवश्यकता होगी हब. साथ में ले ली, यह संभावना टी लगता हैटोपी हमारे मंच अन्यथा केवल बहुत जटिल और महंगा रोबोट प्रणाली के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जो कोशिकाओं के छोटे आबादी की बहु - आयामी विश्लेषण को सक्षम करने में महत्वपूर्ण साबित होगा.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों DMF उपकरणों और DMF हब का डिजाइन और विकास में उनके योगदान के लिए रोनाल्ड एफ Renzi और माइकल एस BARTSCH धन्यवाद. इस शोध पूरी तरह से Sandia राष्ट्रीय प्रयोगशालाओं में निर्देशित अनुसंधान प्रयोगशाला और विकास कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था. Sandia के अनुबंध de-AC04-94AL85000 तहत ऊर्जा के राष्ट्रीय परमाणु सुरक्षा प्रशासन के अमेरिकी विभाग के लिए Sandia निगम, लॉकहीड मार्टिन निगम की एक पूर्ण स्वामित्व वाली सहायक कंपनी, द्वारा प्रबंधित और संचालित एक बहु कार्यक्रम प्रयोगशाला है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Prelude Direct Lysis Module NuGEN 1400-24
Trypan Blue (0.4% w/v) GIBCO 15250-061
Cell Stripper Cellgro 25-056-C1
Ovation PicoSL WTA NuGEN 3310-048
Agencourt RNAClean XP Beckman Coulter Genomics A63987
pHrodo BioParticles Invitrogen P35361
CCL4 TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm00443111_m1
CCL5 TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm01302428_m1
PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm00478374_m1
TNF TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm00443258_m1
GAPDH TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm99999915_g1
Pluronic F127 Sigma Chemical 2594628
Fluorinert FC-40 Sigma Chemical 51142-49-5
Parylene C dimer Specialty Coating Systems 28804-46-8
Teflon-AF DuPont AF1600
Polyimide tape ULINE S-11928
Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates Delta Technologies CB-40IN-1107
DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries Polymicro Technologies TSU100375
Perfusion chamber microcapillaries Polymicro Technologies TSP530700
Tubing and microcapillary fittings Sandia National Laboratories
Polycarbonate tubing Paradigm Optics CTPC100-500-5
8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes Hamilton Company 54848-01
Parylene-C vapor deposition instrument Specialty Coating Systems PDS 2010 Labcoter 2
High-voltage function generator Trek 615A-1 615-3
MVX10 microscope Olympus Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)
QIClick digital CCD camera QImaging QIClick-F-CLR-12 Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)

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References

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