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Biology

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법 Published: September 20, 2013 doi: 10.3791/50610
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Laboratory of Molecular Biology of the Cell, Ecole Normale Supérieure de Lyon, 2INSERM U744, Institut Pasteur de Lille, Université Lille-Nord de France, 3Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of Apoptosis and Cancer, The Rockefeller University

Summary

토마토 / GFP-FLP / FRT 방법은 초파리 생활에 모자이크 광 수용체 세포를 시각화하는 것을 포함한다. 그것은 일 또는 몇 주 동안 망막에있는 각각의 광 수용체 세포의 운명을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 망막 변성 및 신경 퇴행성 질환 또는 광 수용체 세포 개발 연구에 이상적입니다.

Abstract

초파리의 눈이 널리 개발 및 신경 변성의 연구를위한 모델로 사용됩니다. 강력한 유사 분열 재조합 기술로, 클론 분석을 기반으로 우아한 유전 화면은 눈의 개발 및 유충 단계에서 광 수용체 (PR)의 분화에 관련된 신호 전달 경로의 식별을 이끌고있다. 우리는 여기에서 성인 초파리 살아있는 눈 급속한 클론 분석에 이용 될 수 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법을 설명한다. 형광 광 수용체 세포는 flipase 매개 재조합에 의해 생성 된 모자이크 클론과 망막에 각막 중화 기술을 몇 군데 있습니다. 이 방법은 망막 조직 학적 절편의 고전 위에 여러 주요 장점을 갖는다 : 그것은 고 처리량 스크리닝을 위해 사용될 수 있고, PR의 생존과 기능을 조절하는 인자를 확인하기위한 효과적인 방법을 입증했다. 그것은 동일한 리빙 ANIM에 PR 변성 운동 분석을 위해 사용될 수있다알 몇 주 이상, 성인 비행의 PR 생존 또는 기능에 대한 특정 유전자에 대한 요구 사항을 설명하기 위해. 이 방법은 또한 평면 세포 극성의 설립이 영향을하는 것과 같은 발달 돌연변이에 세포 자치 문제를 해결하는 데 유용합니다.

Introduction

초파리 망막은 극성의 명확하게 정의 된 축 (그림 1B)에 따라 정밀하게 구성되어 약 800 ommatidial 단위 (그림 1A),로 구성되어 있습니다. 여덟 광 수용체 세포 (푸에르 토리코)와 원뿔 세포, 색소 세포 및 세포 1,2 강모 등 12 개 부속 세포, 각 단위는 20 세포가 포함되어 있습니다. PR의 두 개의 클래스들은 표현 로돕신의 분류 (RH)에 기초하여 구별된다. 여섯 외측의 PR (R1-6)을 표현하는 사포닌 Rh1 및 사다리꼴 패턴 (도 1C)에 배치된다. 사다리꼴의 중심에서 두 내부의 PR (R7/R8)는 로돕신의 네 가지 유형 (RH3, RH4, RH5 또는 RH6)를 표현하고, R7은 R8 3 위에 자리 잡고 있도록 구성되어 있습니다.

2,500 개 이상의 유전자가 눈 deve을 포함하여 프로세스의 와이드 패널의 연구를위한 매우 강력한 모델을 입증했다 초파리의 눈 (4)의 형태 형성에 관여하는lopment, PR 모집, 차별화, 평면 세포 극성, 형태 형성, 생존, 세포 사멸 및 시각 전달 5-9.

초파리의 눈에 노력 연구진은 몇 년에 걸쳐, 망막 이미징 및 체계적인 유전 화면을 수행하기위한 기술을 개발했습니다. 이미지에 가장 쉬운 방법은 성인의 망막은 고정 된 동물 (그림 1A)에서 각막 보는 것입니다. 각막의 구조는 주사 전자 현미경에 의해 정확하게 시각 수 및 URCFG 컨소시엄에 의해 대규모의 유전자 스크린에 사용되었다 ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. 이것은 종종 개발이나 세포 생존 능력의 초기 단계를 제어하는​​ 유전자의 돌연변이에 의해 유발 등 눈 거칠기 또는 광택 등의 각막 구조의 글로벌 형태 학적 변화를, 시각화를위한 매우 효과적인 방법입니다. 그러나, 각막의 해외 시각화 SU 아니다PR rhabdomere의 형태 형성 또는 성인 PR 생존과 기능을 조절하는 요인을 식별 할 수 fficient. 이러한 분석은 망막 11-13의 접선 반 얇은 수지 부분의 위상차 현미경에 따라 PR의 무결성에 대한보다 철저한 조사가 필요합니다. 이 기술은 돌연변이 PRs를 적색 안료 14,15 자신의 부족에 의해 식별 될 수있는 모자이크를 분석에 적합하다.

모자이크 돌연변이 클론은 또한 형광 현미경 (16, 17)에 녹색 형광 단백질 (GFP) 신호의 결여에 기초하여, 번데기 또는 성인 망막의 전체 마운트 해부에서 시각화 될 수있다. 이러한 두 가지 기술은 매우 유용하지만, 모두 노동과 시간이 많이 소요되며, 따라서 대규모 스크리닝에 적합하지 않다. 우리와 다른 PR 급속한 분석을 용이하게하기 위해, 형광 단백질 (18, 19)의 제조의 PR의 이미징을위한 각막 중화 기술의 사용을 개발했다. 이 기술, 돌연변이와클론 모자이크 성인 초파리 클론에서 레드 (w +) 색소의 형광도에 기초하여 식별 될 수있다. 그러나,이 방법은 세포의 자율성을 해결하기 위해 필요한 단일 셀의 해상도가 19를 발행하지 않는다. 우리는 유사 분열 재조합 (20)와 각막의 중화에 의한 형광 단백질의 영상을 결합 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법을 개발하여이 문제를 극복했다. 이 방법은 단일 셀 해상도에서 높은 처리량, 모자이크 클론의 돌연변이 PRs를 신속하고 정확한 식별, (수 http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). 그것은 초파리 생활에 주에 걸쳐 개인의 PR을 다음과 같은 사항에 대해, 운동 분석에서 사용하기에 적합합니다. 우리는 모자이크 눈의 간단한 운동 분석에서의 사용을 위해 여기에 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법 및 팁을 설명합니다.

Protocol

1. 토마토 / GFP-FLP / FRT 라인과 교차

돌연변이 클론을 들고 파리의 생성은 FRT 운반 돌연변이 라인과 해당 토마토 / GFP-FLP / FRT 라인 비행 사이에 하나의 십자가가 필요합니다.

이 작품은 FRT-재조합 돌연변이의 BruinFly 컬렉션 (이용 http://www.bruinfly.ucla.edu을 ). 네 토마토 / GFP-FLP / FRT 라인 flipase의 소스 (EY-FLP) 및 모든 외부의 PR (사포닌 Rh1 - 인 Gal4의 UAS에서 GFP의 발현과 결합 된 각각의 제 2의 팔과 3 염색체에 FRT 사포닌 Rh1-tdtomatoninaC을 들고 사용할 수 있습니다 -GFP) 20 :

- 2L 암 : 라인 # 43345, P {스피 [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {스피 [+ t7.2] = EY-FLP.N} 2, w [*] P {w [+ 엠씨] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2L P {스피 [+ t7.2] = neoFRT} 40A, P {w [+ 엠씨] = UAS - GFP-ninaC} 3

- 2R 팔 : 라인 # 43346, P {스피 [+ t7.2] =의 RH1-GAL4} [*] w 1, P {스피 [+ t7.2] = EY-FLP.N} 2, P {, 공예 [+의 t7.2] = neoFRT} 42D P{w [+ 엠씨] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2R, P {w [+ 엠씨] = UAS - GFP-ninaC} 3

- 3L 암 : 라인 # 43347, P {스피 [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {스피 [+ t7.2] = EY-FLP.N} 2, w [*] P {w [+ 엠씨] = UAS - GFP-ninaC} 2, P {w [+ 엠씨] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3L P {스피 [+ t7.2는] = neoFRT} 80B/TM6B, 결핵 [1]

- 3R 팔 : 라인 # 43348, P {스피 [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {스피 [+ t7.2] = EY-FLP.N} 2, w [*] P {w [+ 엠씨] = UAS - GFP-ninaC} 2, P {, 공예의 [+ t7.2] = neoFRT} 82B P는 {w [+ 엠씨] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B, 결핵 [1]

이 네 개의 선은 블루밍턴 초파리 주식 센터에서 사용할 수 있습니다. 그들은 유사 분열 클론 (21)의 생성을위한 개발 눈 FLP의 원인을 제공했다. 야생형 염색체 FRT 서열을 보유하고 RH1-tdTomato ninaC는 야생형 및 이형 아우터 PRs를위한 마커로서, 적색 형광 단백질을 코딩 tdTomato 작도. 이 구문에서, ninaC의 P174 이소 형의 마지막 41 아미노산 (불활 이용 활성화도 C) 유전자는 AP이었다에서 프레임 tdTomato 시퀀스의 C-말단에 보류. P174 ninaC 이소 형의 C-말단 꼬리 rhabdomeral 단백질 22의 현지화 및 허가 각막 중화 기술을 사용하여 적색 형광의 PR의 더 나은 삶을 시각화에 대한 책임이 있습니다. RH1 프로모터는 최소 234 BP (-152 +82) RH1 프로모터이다. 녹색 형광 마커 GFP 인해 RH1 - 인 Gal4 (3킬로바이트 프로모터)와 UAS - GFP ninaC 생성의 존재로, 모든 외부의 PR에 의해 표현된다. RH1 - 인 Gal4, EY-FLP : FRT 염색체 (FRT-x)와 토마토 / GFP-FLP / FRT 라인에 돌연변이 X를 들고 비행 주식 사이의 십자가는 다음과 유전자형 (2L에 돌연변이의 예)와 자손을 산출 ; FRT40A, RH1-tdTomato ninaC / FRT40A-X, UAS - GFP ninaC. 이 파리에서 동형 접합 돌연변이 세포를 개발하는 아이 디스크에서 유사 분열 재조합에 의해 생성 및 동형 접합 돌연변이의 PR의 복제 (그림 2A)를 생성하기 위해 분할된다. 호모주변 야생 형과 이형 세포가 tdTomato 및 GFP (그림 2B와 B ")을 모두 표현하는 반면, 그들은 단지 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하기 때문에 zygous 돌연변이 세포를 식별 할 수 있습니다.

2. 광수의 시각화를위한 초파리 준비

각막 중화 기술에 의한 PR 시각화를위한, 아가 판에 파리를 고정시킨다.

  1. 4 ° C 증류수로 가득 세척 병을 준비하고 얼음에 놓습니다.
  2. 전자 레인지에서 가열하여 물에 정기적으로 아가로 오스 (물 100 ㎖에 1.2 ~ 1.5 % 아가로 오스)을 녹입니다. 55 ° C에서 물을 용기에 플라스크를 배치하고, 아가로 오스 용액이 온도까지 냉각 할 수있다. 사용할 때까지 55 ° C에서 아가로 오스를 유지합니다.
  3. 최소 1 분 동안 CO 2와 함께 파리를 마취.
  4. 페트리 접시 (35 × 10 mm의 1.37 X 0.39)에 (55 ° C에서) 따뜻한 아가로 오스 솔루션을 붓고 즉시 주를 배치ately 아가로 오스에 초파리를 마취. 초보자를위한, 페트리 접시 당 10 파리로 시작하는 것은 합리적이다. 큰 페트리 접시 (60 X 15mm에서 2.362 X 0.59)도 사용될 수있다.
  5. 해부 현미경, 집게로 옆으로 초파리의 방향을 아가로 오스에 1 개의 날개를 밀어 몸의 날개와 반 아가 로스 (그림 3A-3A "")에 포함되도록. 아가로 오스의 표면에 다른 쪽 날개 스틱. 참고 : 파리 아가 로스에 깊이 충분히 포함되지 않은 경우, 비행 PR의 이미징 동안 머리를 자유롭게 움직일 수있을 것이고,이 뿌연 이미지가 발생합니다. 눈의 방향도 방해가 될 것이다. 이 때문에 아가로 오스의 농도 또는 온도 하나에, 아가로 오스에 초파리를 뛰어하기 어려울 수 있습니다. 그것은 더 집중 아가 로스의 파리를 포함하는 것이 더 쉽습니다 만, 아가로 오스가 너무 집중되어있는 경우, 즉시 싱크 할 수 있습니다. 아가로 오스가 너무 멋지다 경우, 디 수 있습니다파리를 포함하는 fficult하지만, 너무 높은 온도는 각막에 손상을 줄 수 있습니다.
  6. 얼음에 페트리 접시를 넣고 아가로 오스가 응고 할 수 있습니다.
  7. 겸자로, 한쪽 눈은 액침 대물 노출되도록 헤드 (도 3a '및 3A "를") 동양. 일반적으로 눈 (흑점으로 가시화) pseudopupil는 눈의 중간에있을 때 잘 해부 현미경 배향되는 것으로 간주 될 수있다. 눈의 최적 배향의 PR이 집중되는 ommatidial 필드의 폭을 최대화한다. 배향 공정의 목적은 일반적으로 눈의 중심에 집중의 PR의 넓은 필드와 눈 영역을 찾는 것이다. 이 단계는 또한 다리를 제거하거나 눈을 덮고의 시각화를 방지 aristae 유용합니다.
  8. 얼음처럼 차가운 물 비행을 커버하고 시각화 할 때까지 얼음에 페트리 접시를 둡니다. 얼음처럼 차가운 물이 마취 파리를 유지합니다.

3. 시각화현미경으로 광 수용체

각막을 통해의 PR의 시각화를 들어,이 프로토콜은 긴 작동 거리 (W N-Achroplan 40X/0.75)와 물 목적을 갖춘 직립 현미경을 사용합니다.

  1. 현미경의 무대에서 유리 슬라이드에 얼음처럼 차가운 물로 덮여 페트리 접시를 놓습니다 (3 BC 피규어). 페트리 접시는 수 마이크로 미터 나사에 대한 부드럽게 이동하고, 유리 슬라이드에 접착 할 수있다.
  2. 페트리 접시 (그림 3B'-3C ')의 물에 침지 목표를 플 런지. (예를 들어, GFP 필터로 시작) 여기 빔 하에서 플라이의 머리를 위치. 빔이 눈에 수렴 할 때까지 아래 단계로 이동합니다. 눈 오른쪽 레벨 일 때, 여기 광을 반사하는 경향이있다.
  3. 형광의 접안 렌즈를 통해 봐. 눈은 시야의 중심에 위치 할 때, 아래에 집중형광 광 수용체를 시각화하는 각막.

주 1 : 접안 렌즈를 통해보고 할 때, 예를 들면, 플라이, 특히 복부의 선단부와 헤드의 본체 부분을 구별 할 불안 할 수있다. 그러한 경우에는, 당신은 초파리의 위치를 변경하는 단계에서 직접 찾아야한다.

주 2 : 클래식 형광 또는 공 초점 현미경을 사용할 수있다. 공 초점 현미경은 고전적인 현미경보다 배경과 집중의 PR의 넓은 필드와 이미지를 제공합니다. 예를 셋업은 40 배의 물을 목적으로 LSM510 공 초점 현미경 (혈구)입니다. 더 나은 결과는 일반적으로 목적을 위해 권장되는 것보다 더 넓은 공 초점 현미경의 작은 구멍을 열어 얻을 수있다. 예를 들어, 오히려 작은 구멍의 구경을위한 기본 98 이상, 204의 값을 사용한다.

주 3 : 눈의 w + 색소 침착의 높은 수준은 배경 형광을 줄일 수 있습니다. 4. 광 수용체 세포의 시간 과정의 시각화

일정 기간 동안 같은 눈의 개별 PR의 운명을 따를 때주의가 필요합니다.

  1. 초파리의 생존을 최대화하기 위해, 45 ° C에 아가로 오스의 온도를 줄입니다. 아가로 오스는 상기 온도에서 매우 빠르게 고체화. 오직 한 초파리는 파리가 관찰 중에 혼합되지 않도록, 페트리 접시 당 사용되어야한다.
  2. 체계적으로 같은 눈의보기를 위해, 같은면에 파리를 놓습니다. 이것은 하나의 날개하여 바이알에서 마취 된 비행 복용 및 아가 로스에 초파리를 배치함으로써 달성 될 수있다. 항상 쉽게하기 전에 이미 본 PR 클론을 찾을 수 있도록, 같은 방법으로 가능한 경우에 눈의 방향.
  3. 공 초점 현미경으로 그 형태에 기초하여 클론을 확인한다. 시야는 종종 그 복제 옆에 위치하고 있습니다. 스와케이스 CH, 눈은 눈의 극성 (도 4)에 기초하여, 그 복제본에 시야의 중심을, 물 아래 방향을 전환한다.

5. 시각화 후 파리 복구

  1. 페트리 접시에서 물을 제거합니다.
  2. 부드럽게 집게로 아가로 오스 중 초파리를 잡아 당깁니다.
  3. 조직에 초파리를 건조.
  4. 그것은 음식에 집착하지 않는 것을 보장, 유리 병에 초파리를 반환합니다. 파리가 25 ℃에서 라운드 서 허용

Representative Results

토마토 / GFP-FLP / FRT 방법 초파리 망막에서의 PR의 발달과 생존에 돌연변이 나 이소성 발현의 효과를 연구하기 위해 사용될 수있다. 그것은 최근 20 있듯이, 검사 목적에 이상적 빠르다. 돌연변이의 PR의 존재는 다음 같은 눈 야생형이 PSR 돌연변이의 PR과 관련된 결함을 검출하고 셀 자치 문제를 해결하기 쉽게 만든다.

우리의 분석에서 관찰 발달 결함이 PR 모집, 형태 형성 및 평면 세포 극성 (PCP) 설립 (그림 5) 등 다양한 과정을, 영향을 미쳤다. 궐석 세븐 특히 R7 내부 PR 중 하나, PR 모집 필요합니다. 내부 PR의 손실과 일부 외부의 PR (그림 5A)의 궐석 결과에 세븐의 손실. 거친 머리 (GRH)는 PCP의 설립에 관여 일부 ommatidia, 개안은 반전이다GRH 돌연변이 클론 (그림 5B)에 erted. 이 방법은 가능한 유전자가 PCP의 올바른 획득에 요구되는 PRs를 식별을 용이 모자이크 ommatidia, 개안있는 돌연변이 PRs를 식별 할 수있다. 우리는 GRH가 R3 전구체 (20)의 PCP의 정확한 인수가 필요합니다 나타났습니다. 사실, 우리는 거꾸로 ommatidia, 개안에, R3 전구체에서 비정상적으로 발생한 R4는 항상 돌연변이이었다 것을 관찰했다. 부스러기 (CRBS는) rhabdomere 형태 형성 23에 필요한 정점 막 단백질이다. 불규칙한, 크거나 작은 푸에르 토리코 (그림 5C)의 CRBS 11A22 돌연변이 결과 CRBS의 손실.

이 방법은 성인이 중 하나의 PR의 운명 (그림 6)에 따라 사용할 수 있습니다. 동형 접합 돌연변이의 PR의 그룹이 볼 수와 동일한 그룹의 동일한 눈에서 발견 될 수 있기 때문에, 신경 퇴행 연구를위한 최적같은 일 또는 몇 주 동안의 기간 동안 비행. 각 클론이 눈이 형광 현미경 아래에 위치 할 때 인식 할 수있는 독특한 모양을 가지고 있기 때문에, 푸에르 토리코가 생존하고 죽을 운명하는 결정하는 것이 가능하다. 망막은 편광으로서, 그 모양에 기초하여, 다시 동일한 클론을 찾기 위해 망막을 배향 할 수있다. 우리는 fatp k10307 돌연변이는 성인의 진보적 인 PR 변성 (그림 6, 24)를 유도하는 것을 보여주기 위해이 방법을 사용했다. 이러한 시각화 방법은 또한 세포 자율성을 분석하는데 사용될 수있다. fatp k10307 모자이크 망막에서 PR 손실은 야생형의 PR은 영향을받지되고, 돌연변이의 PR을 fatp로 제한했다. PR 생존을위한 fatp의 요구에 따라서 세포 자율적이다. 우리는 또한 RH1 - 인 Gal4 드라이버와 UAS-fatp 구조 (그림 7)와 야생형 fatp을 reexpressing하여 fatp 돌연변이 PR을 구출 할 수 있었다.이러한 구조의 실험을 행할 가능성이 수지 - 내장 망막의 조직 학적 단면도 클론 분석에 근거 위에 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법의 장점 중 하나이다. 사실, 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법에 클론 검출 P의 사용에 의해 영향을받지 않는다 (UAS, w +) 유전자 구조, (+ W) 미니 흰색 유전자와 관련된 붉은 색소는 붉은 색소로 눈을 커버하는 반면 , 조직 학적 섹션에 모자이크 클론을 마스킹.

그림 1
그림 1. 초파리 눈의 조직. (A) 실체 현미경으로 찍은 초파리 눈의 사진. 초파리의 눈은 약 800 ommatidia, 개안로 구성되어있다. 눈의 중간에 64 ommatidia, 개안의 필드의 (B) 개략도. 각 개안의 여섯 외부 광 수용체 뉴런 (푸에르 토리코),녹색으로 표시, 눈의 가장 가까운 극을 가리키는 박힌 사다리꼴로 구성됩니다. 그들은 결과적으로 적도라고 두 부분의 경계에 따라 미러 이미지를 복부와 눈의 등 부분에 반대 방향으로 가리키고 있습니다. 개안의 (C) 개략도. 각 개안 여덟의 PR이 포함되어 있습니다. 녹색으로 표시 R6 PRs를 행 R1은 외측의 PR이다. 그들은 감광성 분자 rhodopsin1 (사포닌 Rh1)를 표현하고 포유류의 막대 세포의 동일합니다. 내부의 PR, R7 및 R8은 (R7은 R8의 꼭대기에 앉아있다) 회색으로 표시됩니다. 이너 PRs를 로돕신은 3, 4, 5 또는 6을 표현하고 포유류 원추 세포의 동등하다. 단순화를 위해, 단지 rhabdomere, PR의 빛에 민감한 부분은, 각 PR에 대해 표시됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2. 생성 및 토마토 / GFP-FLP / FRT의 방법으로 초파리의 눈을 모자이크 PR 클론을 시각화. 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법에 모자이크 클론의 세대 (A) 개략도. 모자이크 클론으로 인해 눈의 개발 및 FRT 시퀀스 동안 (눈이 발기인의 통제하에) flipase의 표현으로, 유사 분열 재조합에 의해 생성됩니다. FRT 순서 및 세포 분열, 동형 접합 돌연변이, 동형 접합 야생 형과 이형 세포의 재조합 이형 세포에서 생성 할 수 있습니다 후. 이 세포는 성인의 눈에서의 PR의 모자이크 클론을 형성하기 위해 다시 나눕니다. 돌연변이 세포의 식별은 야생형과 이형 세포를 라벨에 야생형 염색체로 적색 형광 단백질 tdTomato을 표현하는 구문을 삽입하여 용이하게된다. t 모자이크 PR 클론 (B-B ') 시각화그는 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법. 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법은 유사 분열 재조합, 각막 중화 공 초점 현미경을 결합합니다. 모두의 PR은 각막의 중화 및 공 초점 현미경 (B)를 사용하여의 PR의 시각화를 용이하게 녹색 형광 단백질 GFP를 표현한다. PRs를 단일 세포 수준에서 시각화 될 수있다. 돌연변이 모자이크 클론 유사 분열 재조합에 의해 생성되고, 적색 형광 단백질 tdTomato (B ')의 부재에 의해 확인 될 수있다. 야생 형과 이형의 PR은 (B '') 노란색 반면 결과적으로, 병합 된 이미지에, 동형 접합의 PR은 녹색으로 표시됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. visualizat의 초파리를 설정각막 중화 이온. 아가로 오스 가득 접시에 고정 초파리의 (A-A '' '') 사진. 패널에서 '' '', 파리를 포함하는 아가로 오스의 조각 프로필 사진을 절단하고있다. 초파리는 아가로 오스 내 오른쪽 날개, 아가로 오스에 반 포함 된 왼쪽 날개는 아가로 오스 표면 (A, '', '' '')에 붙어. 초파리는 아가로 오스에 포함되는 경우, 머리가 자주 저조한 눈 (A, A ')의 시각화를 위해 배치됩니다. 머리는 따라서 눈의 중간 (A '', '' ') 위쪽을 가리키는되도록 집게로 reorientated해야합니다. (B-B') 초파리를 보여주는 회로도는 아가로 오스 플레이트와의 위치에 고정 현미경의 목적에 따라 초파리의 무대에서 초파리의 설정. (C-C ') 사진그 목적에 따라 현미경. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 4
그림 4. 시간 코스 분석을위한 눈의 방향입니다. 그림은 개략도로 표현 각막 중화 볼 두 개의 서로 다른 방향과 ommatidia, 개안의 해당 분야에서 초파리 머리의 사진을 보여줍니다. 첫 번째 관찰 중 (A), 눈이 배치 등 (노란색) 이형 또는 야생형의 PR의 복제는 적도 (빨간색 선)의 수준에서, 필드의 중간에서 볼 것을. (B) 두 번째 관찰하는 동안, 눈은 정확히 자주하지 않습니다 같은 방향입니다. 따라서, PRs를 동일한 그룹에 다시 발견 될 수 있지만, 볼 수없는(왼쪽) 동일한 필드. 눈은 다시 볼 수 있도록 같은 필드에 대한 방향을 전환해야합니다. 적도의 위치가 가이드로서 사용될 수있다. 이 예에서는, 관찰 된 필드가 너무 복부이고 안구 따라서 제 관측과 다시 관찰 필드의 중간에 적도를 배치 배쪽으로 켜져 있어야한다는 것을 알고있다.

그림 5
그림 5. 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법에 의해 검출 PR 개발 결함의 예. 내부의 PR의 손실을 보여주는 모자이크시나 [BG02648] 돌연변이의 PR (A) 시각화. 돌연변이 ommatidia, 개안에, 외부의 PR 인해 내부 PR R7의 부재로 모여있다. 실제로,시나는 내부 PR 모집에 필요한 것으로 알려져있다. 모자이크 GRH의 (B) 시각화 [S2140] 극성 결함을 나타내는 돌연변이의 PR. 모자이크 돌연변이 ommatidia, 개안, SURR원으로 ounded, dorso - 복부 반전을 나타내는 야생형 ommatidia, 개안에서 반대 방향으로 가리키고있다. 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법에 대한 자세한 연구는 GRH가 개안 극성 (20)의 정확한 수집을 위해 R3 전구체에 필요한 것을 보여 주었다. 모자이크 CRB [j1B5] 돌연변이의 PR (C) 시각화, 변형 동형 접합 돌연변이의 PR을 표시합니다. CRB는 rhabdomere 형태 형성에 필요한 것으로 알려져있다.

그림 6
그림 6. 모자이크 fatp의 시간 코스 분석 [k10307] 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법과 돌연변이의 PR은 14 일 동안. 모자이크 fatp는 [k10307] 돌연변이 망막이 1 일 (A, A ')에 관찰, 4 일 ( B, B '), 8 일 (C, C') 및 부화 후 14 일이되는 날 (D, D '). 모자이크의 PR의 같은 그룹은 foun이 될 수 있습니다각 시점에서 D, 관찰 필드 (백색 사각형, A, B, C, D). 이질 접합체 야생형의 PR이 노란색으로 표시되는 반면의 PR (A ', B', C ', D')의이 분야에서 동형 접합 돌연변이의 PR은 녹색으로 표시되어 있습니다. 4 일 (B ') 이후에서 동형 접합 돌연변이의 PR은 fatp가 [k10307] 돌연변이이의 PR의 진보적 인 퇴보를 유도하는 것을 나타내는, 사라 시작합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 7
그림 7. 모자이크 제어의 미니 화이트 운반 fatp 발현 구성. 모자이크의 PR 15 일 된 파리의 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법으로 시각화된다. (A) 시각화와 fatp의 구조는 [k10307] 돌연변이의 PR 푸에르 토리코. (B) V돌연변이의 PR의 손실 모자이크. (C) 시각화를 보여주는 모자이크 fatp 돌연변이의 PR의 isualization fatp 외부 PR (RH1> fatp)에 파리 reexpressing fatp에있는 돌연변이의 PR. 돌연변이의 PR은 구출됩니다. 미니 흰색 유전자 RH1의 관련 적목 색소의 존재> fatp 조건은 토마토 또는 GFP의 형광 또는 클론 탐지를 변경하지 않습니다.

Discussion

초파리의 눈은 넓게 개발, 증식과 생존을 조절하는 신호 전달 경로를 해독하는 데 사용되었습니다. 1990 년대 초반에, 유전 화면의 다수는 PR 25-27 개발의 초기 단계에서 필요한 경로를 식별하기 위해 수행 하였다. 유전 스크린의 효율을 가능 모자이크 클론 (21)에서 기능 상실 돌연변이를 검사 할 수있게 유사 분열 재조합 기술에 의해 크게 증가 하였다. 따라서 배아 치명적인 돌연변이의 역할을 체계적으로 달리 이형했다 파리의 눈에 동형 접합 돌연변이 클론에서 테스트 할 수 있습니다. 대부분의 모자이크 검사는 초기 PR 모집, 분화, 축삭 돌기 또는 개발 유충이나 번데기 10,25-31에서 발생하는 형태 형성에 초점을 맞추고있다. 지금까지 단 하나의 모자이크 화면이 electroretin를 통해 시각적 반응을 모니터링하여, 성인 PR의 기능을 조절하는 메커니즘을 조사하고 있습니다ogram (32) 녹음. 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법과 돌연변이 동물을 생활 시간 코스 분석을 수행의 가능성과 함께, 우리는 성인 PR 생존을 조절하는 요인을 식별하기위한 새로운 방법을 설계 20,24으로 기능했다.

토마토 / GFP-FLP / FRT 방법은 수지 임베디드 눈의 고전적인 조직 학적 절편에 비해 몇 가지 중요한 이점이있다. 첫째,이 방법은 훨씬 더 빨리, 더 저렴하고 조직 학적 방법보다 쉽게 수행 할이, 적절한 물 담금 목적으로 장착 된 형광 현미경 (시약 및 장비의 표 참조) 사용할 수 있도록 제공된다. 둘째, 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법은 미니 흰색 유전자를 운반하는, 예컨대 (+ w UAS) P의 표현으로서, 유전자 발현과 함께 사용될 수있다. 토마토 / GFP-FLP / FRT 계, P에서의 w + 클론은 검출을 위해 사용되는 조직 학적 단면도, 달리 (UAS, + w) 클론 D를 방해하지 않는다토마토 형광 단백질을 기반으로 금 속 탐. P를 사용하여 (UAS-fatp는 + W) 형질 전환 초파리, 우리는 fatp 돌연변이의 PR의 구조 (그림 7)를 시각화 할 수 있었다. 셋째, 토마토 / GFP-FLP / FRT에 근거하여 손실의 PR의 유전자형의 모호성임을 클론 분석 등의 모든 종류의 키 함정. 실제로, PR 때문에 특정 유전자 기능의 부족 또는 때문에 특히 돌연변이 클론의 국경에서 셀이 아닌 자율적 인 효과의 존재 여부 불분명 할 수있다. 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법은 가능한 몇 주간의 기간 동안 같은 동물의 야생형과 돌연변이의 PR를 수행함으로써 변성을 위해이 문제를 가져옵니다. 우리는 운동에 의해 개인의 PR의 운명 다른 fatp 돌연변이 체에 대한 분석 (그림 6)에 따라 할 수 있었다. 동일한 클론 때문에 주변 야생형 클론의 정확한 형상을 서로 다른 시간에 주어진 동물에서 인식 할 수있다. 우리는 명확한 보여줄 수 있었다모든 누락의 PR은 푸에르 토리코에있는 fatp 돌연변이의 역할은 세포 자치임을 나타내는 fatp에 돌연변이 있다고 LY. 따라서, 운동 분석에서의 PR의 손실을 모니터링함으로써, 성인 발병 변성 모델에서의 PR의 유전자형을 결정하는 것이 가능하다. 마지막으로, 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법은 PCP (20)의 설립을 조절 인자의 식별을위한 매우 강력한 입증했다. 섹션에 대한 필요없이 극성 표현형에 대한 모자이크 ommatidia, 개안 다수 처치의 가능성은 PCP의 설립 PR 요구의 신속한 결정을 용이하게한다. 그럼에도 불구하고, PR 무결성의 정밀한 분석은 위상차 또는 전자 microscopies 다음에 기존의 단면을 필요로한다.

결론적으로, 토마토 / GFP-FLP / FRT의 방법은 힘으로 PR 발달 과정과 성인 PR의 기능을 조절하는 요소를 식별하는 효율적인 모자이크 검사에 대한 새로운 가능성을 열어연간 응답과 생존.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

프랑스 UMS3444 생명 과학, 리옹의 PLATIM 및 Droso - 도구 시설. BM의 연구는 매그에서 교부금에 의해 지원되었다 CNRS (ATIP)에서 라 공들인 Médicale을 넣어 ANR-12-BSV1 - 0019-01. PD는 망막 프랑스 협회와 리옹 고등 사범 학교 (프랑스)에 의해 지원되었다. CL은 (는) 라 리그 국립 contre 르 암 협회에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent
Agarose Euromedex D5-E Regular agarose is used to immobilize the flies
Petri dish BD Falcon 353001 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch
Cold-ice water To maintain the flies anesthetized
  Equipment
Dissecting microscope Dutcher SMZ645  
Water Bath Julabo 9550102 To keep the agarose solution at warm temperature
40X Water objective Zeiss 420967-9900-000 Water dipping objective for the confocal microscope

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발달 생물학 제 79 눈 광 수용체 세포 유전자 발달 신경 세포 시각화 변성 개발 라이브 영상, 광수 각막 중화 유사 분열 재조합
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Dourlen, P., Levet, C., Mejat, A., Gambis, A., Mollereau, B. The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells. J. Vis. Exp. (79), e50610, doi:10.3791/50610 (2013).

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