Summary
Tomat / GFP-FLP / FRT metode indebærer at visualisere mosaik fotoreceptorceller i levende Drosophila. Det kan bruges til at følge de enkelte fotoreceptor celleskæbner i nethinden dage eller uger. Denne metode er ideel til undersøgelser af retinal degeneration og neurodegenerative sygdomme eller fotoreceptorer celle udvikling.
Abstract
Drosophila-øje er almindeligt anvendt som en model til undersøgelser af udvikling og neuronal degeneration. Med den kraftfulde mitotisk rekombination teknik, har elegante genetiske skærme baseret på klonal analyse førte til identifikation af signalveje, der er involveret i udvikling øje og fotoreceptorer (PR) differentiering larvestadier. Vi beskriver her tomat / GFP-FLP / FRT metode, som kan anvendes til hurtig klonal analyse i øjet af levende voksne Drosophila. Fluorescerende fotoreceptorceller afbildes med hornhinden neutralisering teknik på nethinder med mosaik kloner dannet ved flipase-medieret rekombination. Denne metode har flere vigtige fordele i forhold til klassiske histologiske sektionering af nethinden: det kan anvendes til high-throughput screening, og har vist sig at være en effektiv metode til at identificere de faktorer, der regulerer PR overlevelse og funktion. Det kan bruges til kinetiske analyser af PR degeneration i den samme levende Animal over flere uger, for at demonstrere kravet om specifikke gener for PR overlevelse eller funktion i den voksne flue. Denne metode er også nyttigt for at tage celle autonomi spørgsmål udviklingsmæssige mutanter, såsom dem, hvor etableringen af plane celle polaritet påvirkes.
Introduction
Drosophila-nethinden er sammensat af omkring 800 ommatidial enheder (figur 1A), som er præcist tilrettelagt, med en klart defineret akse polaritet (figur 1B). Hver enhed indeholder 20 celler: otte fotoreceptorceller (PRS) og 12 tilbehør celler, herunder kegle celler, pigment celler og stritter celler 1,2. To klasser af PR skelnes på grundlag af den type rhodopsin (RH) de udtrykker. De seks ydre PRs (R1-6) udtrykker RH1 og er anbragt i et trapezformet mønster (figur 1C). I centrum af den trapez, de to indre PRS (R7/R8) udtrykker fire mulige typer af rhodopsin (RH3, RH4, RH5 eller RH6) og er organiseret således, at R7 ligger på toppen af R8 3..
Mere end 2.500 gener er involveret i morfogenese af Drosophila øje 4, som har været en meget kraftig model til undersøgelser af et bredt panel af processer, herunder øje develing, PR rekruttering, differentiering plane cellepolaritet morfogenese, overlevelse, apoptose og visuel transduktion 5-9.
Forskere arbejder på Drosophila øje har gennem mange år udviklet teknikker til billedbehandling nethinden og udfører systematisk genetiske skærme. Den nemmeste måde at billedet voksne nethinden er at se på hornhinden i et immobiliseret dyr (figur 1A). Strukturen af hornhinden kan visualiseres præcist ved scanning elektronmikroskopi og blev anvendt i en storstilet genetisk skærmen af URCFG konsortium ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Dette er en meget effektiv metode til at visualisere globale morfologiske ændringer i hornhindens struktur, såsom øjet ujævnhed eller glans, ofte induceret af mutationer i gener, der kontrollerer de tidlige stadier af udvikling eller cellelevedygtighed. Imidlertid er den globale visualisering af hornhinden ikke sufficient at identificere de faktorer, der regulerer PR rhabdomere morfogenese eller voksen PR levedygtighed og funktion. Sådanne analyser kræver en mere grundig undersøgelse af PR integritet baseret på fase-kontrast mikroskopi af tangentielle semi-tynde harpiks dele af nethinden 11-13. Denne teknik er egnet til mosaik analyser, hvor mutant PRs kan identificeres ved deres mangel på røde pigment 14,15.
Mosaic mutantklonerne kan også visualiseres i hel-mount dissektioner af puppe eller voksen retina på baggrund af deres mangel på grønt fluorescerende protein (GFP) signal på fluorescensmikroskopi 16,17. Disse to teknikker er meget nyttige, men begge er arbejds-og tidskrævende og er derfor ikke egnet til produktion i stor skala screening. Vi og andre har udviklet brugen af hornhinden neutralisations teknikker til billeddannelse af PRS producerer fluorescerende proteiner 18,19, for at lette hurtig PR analyser. Med denne teknik, mutantkan identificeres kloner på basis af autofluorescens af den røde (w +) pigment i mosaik voksne Drosophila kloner. Denne metode ikke giver dog encellede opløsning kræves for at løse celle autonomi spørgsmål 19. Vi overvandt dette problem ved at udvikle Tomat / GFP-FLP / FRT metode, som kombinerer billeddannelse af fluorescerende proteiner ved hornhinden neutralisering med mitotisk rekombination 20. Denne metode giver den højt gennemløb, hurtig og præcis identifikation af mutant PRs i mosaik kloner på encellede opløsning ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). Den er velegnet til brug i kinetiske analyser, for at følge de enkelte PRs over en periode på uger i levende Drosophila. Vi beskriver her tomat / GFP-FLP / FRT-metoden og tips til brug i enkle, kinetiske analyser af mosaik øjne.
Protocol
1.. Passage med tomat / GFP-FLP / FRT Lines
Den generation af fluer bærer det muterede klon kræver en enkelt krydsning mellem en FRT-bærende mutant linje og den tilsvarende Tomat / GFP-FLP / FRT fluelinen.
Dette arbejde udnyttede BruinFly samling af FRT-rekombinerede mutationer ( http://www.bruinfly.ucla.edu ). Fire Tomat / GFP-FLP / FRT linjer kan bruges, transporterer FRT RH1-tdtomatoninaC på hinandens arme 2. og 3. kromosomer kombineret med kilde flipase (ey-FLP) og ekspression af GFP i alle udvendige PRS (RH1-Gal4 UAS -GFP) 20:
- 2L arm: linje # 43345, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*], P {w [+ mC] = NinaE-tdTomato-ninaC} 2L P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 40A, P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 3
- 2R arm: linje # 43346, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*], P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 42D P{W [+ mC] = NinaE-tdTomato-ninaC} 2R, P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 3
- 3L arm: linje # 43347, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*], P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 2, P {w [+ mC] = NinaE-tdTomato-ninaC} 3L P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 80B/TM6B, Tb [1]
- 3R arm: linje # 43348, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*], P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 2, P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 82B P {w [+ mC] = NinaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B, Tb [1]
Disse fire linjer er tilgængelige på Bloomington Drosophila bestanden center. De fremlagde en kilde FLP i udviklingslandene øje til generering af mitotiske kloner 21. Vildtype-kromosom, der bærer en FRT-sekvens og en RH1-tdTomato ninaC konstruktion, der koder den røde fluorescerende protein tdTomato, som en markør for vildtype og heterozygote ydre PRS. I denne konstruktion, de sidste 41 aminosyrer af p174 isoform af ninaC (hverken inaktivering eller aktivering C)-genet blev godkendtspenderet i ramme til den C-terminale ende af tdTomato sekvens. Den C-terminale hale af p174 ninaC isoformen er ansvarlig for rhabdomeral lokalisering af proteinet 22 og tillader bedre levende visualisering af røde fluorescerende PRs hjælp hornhinden neutralisering teknik. Den RH1 promotor er den minimale 234 bp (-152 +82) RH1 promotor. Den grønne fluorescerende markør GFP udtrykkes af alle de ydre PRs, på grund af tilstedeværelsen af RH1-Gal4 (3kb promotor) og UAS-GFP ninaC konstruktioner. Krydsninger mellem en flue bestand bærer en mutation x på FRT kromosomet (FRT-x) og tomat / GFP-FLP / FRT linjer giver et afkom med følgende genotype (eksempel på mutation på 2L): RH1-Gal4, ey-FLP ; FRT40A, RH1-tdTomato ninaC / FRT40A-x, UAS-GFP ninaC. I disse fluer, er homozygote mutante celler frembragt ved mitotisk rekombination i udviklingslandene øjet disken og dele til at generere en klon af homozygote mutante PRs (figur 2A). Homozygous mutantceller kan identificeres, fordi de kun udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP), mens det omgivende vildtype og heterozygote celler udtrykker både tdTomato og GFP (fig. 2B og B ").
2. Forberedelse Drosophila for Fotoreceptor Visualisering
Til PR visualisering af hornhinden neutralisering teknik immobilisere fluer på agaroseplader.
- Forbered en vask flaske fyldt med 4 ° C destilleret vand og placere den på is.
- Opløs regelmæssig agarose i vand (1,2-1,5% agarose i 100 ml vand) ved opvarmning i en mikrobølgeovn. Kolben anbringes i et vandbad ved 55 ° C og lade agaroseopløsningen at afkøle til denne temperatur. Hold agarose ved 55 ° C indtil anvendelse.
- Bedøver fluer med CO 2 i mindst 1 min.
- Hæld den varme agaroseopløsning (ved 55 ° C) i en petriskål (35 x 10 mm, 1,37 x 0,39 tommer) og placere straksbart den bedøvede Drosophila på agarose. For begyndere, startende med 10 fluer per petriskål er rimelig. Bigger petriskål (60 x 15 mm, 2,362 x 0,59 cm), kan også anvendes.
- Under et dissektionsmikroskop, orientere Drosophila på sin side med en pincet, skubbe den ene vinge til agarose, således at kanten og halvdelen af kroppen er indlejret i agarose (figur 3A-3A ""). Sæt den anden fløj på overfladen af agarosen. Bemærk: Hvis fluerne ikke er indlejret dybt nok i agarose, vil fluen være fri til at flytte sit hoved under billeddannelse af PR, og dette vil resultere i slørede billeder. Orienteringen af øjet vil også blive forstyrret. Det kan være vanskeligt at kaste Drosophila i agarose, enten på grund af koncentrationen af agarose eller dens temperatur. Det er lettere at integrere fluer i mere koncentreret agarose, men hvis agarose er for koncentreret, kan flyve synke. Hvis agarose er for kold, kan det være difficult at indlejre flyve, men en for høj temperatur kan beskadige hornhinden.
- Sæt petriskål på is og tillade agarose at størkne.
- Med en pincet, orientere hovedet, således at det ene øje er udsat for immersionsobjektivet (figur 3A 'og 3A ""). Generelt kan et øje anses for at være godt orienteret under dissektionsmikroskop når pseudopupil (visualiseres som en sort plet) er i midten af øjet. En optimal orientering af øjet maksimerer bredde ommatidial område, hvor PR'er er fokuseret. Formålet med orientering trin er at finde den region af øjet med det bredeste område fokuseret PRs, som regel i midten af øjet. Dette trin er også nyttigt til at fjerne nogen ben eller aristae dækker øjet og forhindrer dets visualisering.
- Dæk flyve med iskoldt vand og lad petriskålen på is indtil visualisering. Iskoldt vand holder fluerne bedøvede.
3. VisualiseringFotoreceptorer under lup
Til visualisering af PRS gennem hornhinden, denne protokol bruger en opretstående mikroskop udstyret med et objektiv vand med en lang arbejdsdag afstand (W N-Achroplan 40X/0.75).
- Placer petriskålen dækket med is-koldt vand på en glasplade på scenen af mikroskopet (figur 3 f.Kr.). Petriskålen kan limes på objektglasset, hvilket gør det muligt at flytte det om jævnt med mikrometer skruer.
- Dyk immersionsobjektivet i vandet af petriskålen (figur 3B'-3C). Placer hovedet af fluen under exciteringsstrålen (start med GFP-filter, for eksempel). Flyt scenen op og ned, indtil strålen konvergerer på øjet. Når øjet er på det rette niveau, det har en tendens til at afspejle excitationslys.
- Kig gennem okularet for fluorescens. Når øjet er placeret i midten af synsfeltet, fokus underhornhinden for at visualisere de fluorescerende fotoreceptorer.
Note 1: Når man ser gennem okularet, kan det være urolig at skelne kropsdele af fluen, især den distale del af maven og hovedet, for eksempel. I sådanne tilfælde bør du kigge direkte på scenen for at flytte Drosophila.
Note 2: Klassisk fluorescens eller konfokal mikroskopi kan anvendes. Konfokal mikroskopi giver billeder med mindre baggrund og et bredere felt af fokuserede PRS end klassisk mikroskopi. Et eksempel set-up er en LSM510 konfokal mikroskop (Zeiss) med en 40X vand målsætning. Bedre resultater kan opnås ved at åbne hul i konfokalt mikroskop bredere end normalt anbefales til mål. For eksempel bruger en værdi på 204, snarere end standard 98 til åbningen i hul.
Note 3: Højere niveauer af w + pigmentering i øjet reducere baggrundsfluorescens. 4.. Time-kursus Visualisering af fotoreceptorceller
Der kræves omhu ved at følge skæbnen for en individuel PR i samme øje over en tidsperiode.
- Reducer temperaturen af agarose til 45 ° C, for at maksimere Drosophila overlevelse. Agarosen størkner meget hurtigt ved denne temperatur. Kun én Drosophila bør anvendes per petriskål at sikre, at fluer ikke bliver blandet op under bemærkninger.
- Systematisk placere fluerne på samme side, til visning af det samme øje. Dette kan opnås ved at tage den bedøvede fly fra hætteglasset med en fløj og placere Drosophila på agarose. Altid orientere øje på samme måde, hvis det er muligt, hvilket gør det nemt at finde PR-kloner, der er blevet set før.
- Identificere klonerne på grundlag af deres form under konfokal mikroskop. Synsfeltet er ofte placeret ved siden af klon af interesse. I sulm tilfælde bør øjet omlægges under vand, for at centrere synsfeltet på klonen af interesse, baseret på polariteten af øjet (figur 4).
5.. Gendannelse Fluer efter Visualisering
- Fjerne vandet fra petriskålen.
- Træk forsigtigt Drosophila ud af agarose med en pincet.
- Tør Drosophila på en væv.
- Retur Drosophila til et hætteglas, der sikrer, at det ikke hænger fast i maden. Tilladt fluen til at komme rundt ved 25 ° C.
Representative Results
Tomat / GFP-FLP / FRT metode kan bruges til at undersøge effekten af en mutation eller ektopisk udtryk på udvikling og overlevelse af PRS i Drosophila nethinden. Det er hurtig, hvilket gør den ideel til screening, som for nylig vist 20. Tilstedeværelsen af mutant PRS siden vildtype-PRS i samme øje gør det nemt at opdage fejl forbundet med mutant PRS, og at behandle celle autonomi spørgsmål.
De udviklingsmæssige defekter observeret i vores analyse påvirket af forskellige processer, herunder PR-rekruttering, morfogenese og plane celle polaritet (PCP) virksomhed (figur 5). Seven in absentia er nødvendig for PR rekruttering, især for R7 en af den indre PR. Tabet af Seven in absentia resulterer i tab af den indre PR og nogle ydre PRS (figur 5A). Kornet hoved (grh) er involveret i PCP etablering og nogle ommatidia er inverted i GRH mutantklonerne (figur 5B). Denne metode gør det muligt at identificere de mutant PRs i mosaik ommatidia lette identifikationen af PRS, hvor genet er nødvendig for den korrekte overtagelse af PCP. Vi har vist, at grh er nødvendig for den korrekte overtagelse af PCP i R3 forstadier 20. Faktisk observerede vi, at i den omvendte ommatidia, R4, som stammer unormalt fra R3 forstadiet var altid mutanten. Krummer (Crbs) er en apikal membranprotein kræves for rhabdomere morfogenese 23. Tabet af Crbs i Crbs 11A22 mutant resultater i uregelmæssige, større eller mindre PRS (figur 5C).
Denne metode kan også bruges til at følge skæbnen for enkelt PRs i voksenalderen (figur 6). Den er ideel til neurodegeneration undersøgelser, fordi en gruppe af homozygote mutante PRs kan ses og samme gruppe kan findes i samme øjesamme flyver over en periode af dage eller uger. Det er derfor muligt at afgøre, hvilke PRS overleve og som er dømt til at dø, fordi hver klon har en unik form, der kan genkendes, når øjet er placeret under fluorescens mikroskop. Nethinden er polariseret, er det muligt at orientere nethinden at finde den samme klon igen på grundlag af sin form. Vi brugte denne metode til at vise, at fatp k10307 mutation inducerer progressiv PR degeneration i voksenalderen (figur 6, 24). Denne visualisering fremgangsmåde kan også anvendes til at analysere celle autonomi. I fatp k10307 mosaik nethinden blev PR tab begrænset til fatp mutant PRS vildtype PRS være upåvirket. Kravet om fatp for PR levedygtighed er derfor celleautonom. Vi var også i stand til at redde den fatp mutant PR ved reexpressing vildtype fatp med en RH1-Gal4 driver og en UAS-fatp konstruktion (figur 7). DenMuligheden for at gennemføre sådanne rednings forsøg er en af fordelene ved den tomat / GFP-FLP / FRT metode frem klonal analyse baseret på histologiske sektioner af harpiks-embedded nethinden. Faktisk er klonal påvisning med tomat / GFP-FLP / FRT metoden ikke påvirkes af brugen af P (UAS, w +) transgene konstruktioner, mens den røde pigmentering er forbundet med mini-hvide gen (w +) dækker øjet med røde pigment maskering mosaik kloner i histologiske snit.
Figur 1. Organisationen af Drosophila øjet. (A) Fotografi af en Drosophila øjet taget med et stereomikroskop. Drosophila-øje består af cirka 800 ommatidia. (B) Skematisk diagram af et felt af 64 ommatidia i midten af øjet. De seks ydre photoreceptor neuroner (PRS) af hver ommatidium,vist med grønt, er organiseret i en stereotyp trapez, der peger på de nærmeste poler øjet. De peger derfor i modsatte retninger i den ventrale og dorsale del af øjet og er spejlbillede i henhold til grænsen mellem de to dele, som kaldes ækvator. (C) Skematisk diagram af en ommatidium. Hver ommatidium indeholder otte PRS. PRS R1 til R6, vist med grønt, er de ydre PRS. De udtrykker den lysfølsomme molekyle rhodopsin1 (RH1), og er hvad der svarer til pattedyrs stang celler. De indre PRS R7 og R8, er vist i gråt (R7 sidder på toppen af R8). De indre PRs udtrykker rhodopsin 3, 4, 5 eller 6, og er hvad der svarer til pattedyrs kegle celler. For overskuelighedens skyld, er det kun rhabdomere, den lysfølsomme del af PR, vises for hver PR. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Opsætning af Drosophila for visualization af hornhinden neutralisation. (A-A'''') Fotografier af et Drosophila immobiliseret på en plade fyldt med agarose. I panel A'''', er et stykke af agarose indeholdende fluen blevet skåret til at tage en profil fotografi. Drosophila er halvt indlejret i agarose, med højrefløjen i agarose og venstre sidder fast på agarose overflade (A, A'', A''''). Når Drosophila er indlejret i agarose, er dens hoved ofte dårligt positioneret til visualisering af øjet (A, A '). Hovedet skal derfor dirigeret med en pincet, således at midten af øjet peger opad (A'', A'' '). (B-B') Skematisk diagram, der viser en Drosophila immobiliseret på en agarose-plade og positioneringen af Drosophila under målet af mikroskopet. (C-C ') Fotografier af indstillingen af Drosophila på scenen afmikroskop under sit mål. Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Orientering i øjet for tid-kursus analyse. Figuren viser fotografier af en Drosophila hoved i to forskellige orienteringer og de tilsvarende områder af ommatidia ses af hornhinden neutralisering, repræsenteret som skematiske diagrammer. (A) I første observation, er øjet placeres sådan, at en klon af heterozygot eller vildtype-PRS (i gult) ses i midten af feltet, på niveau med ækvator (rød linje). (B) I den anden observation, øjet er ofte ikke i præcis den samme orientering. Således kan den samme gruppe af PRS findes igen, men det er ikke muligt at senøjagtig samme felt (til venstre). Øjet skal omlægges til samme område, der skal ses igen. Positionen for ækvator kan anvendes som en vejledning. I dette eksempel ved vi, at den observerede området er for ventral og at øjet skal derfor vendes ventralt at placere ækvator i midten af det observerede felt igen, som i den første observation.
Figur 5. Eksempler på PR udvikling defekter opdaget af tomat / GFP-FLP / FRT-metoden. (A) Visualisering af mosaik Sina [BG02648] mutant PRS, der viser tab af indre PRS. I mutanten ommatidia er ydre PRs grupperet sammen på grund af fraværet af den indre PR R7. Faktisk er sina kendt for at være påkrævet for den indre PR rekruttering. (B) Visualisering af mosaik grh [s2140] mutant PRs viser polaritet defekter. Den mosaik mutant ommatidia, SURRounded af en cirkel, der peger i den modsatte retning fra vildtype ommatidia, hvilket indikerer en dorso-ventral inversion. En detaljeret undersøgelse med tomat / GFP-FLP / FRT-metoden viste, at grh var påkrævet i R3 forløber for den korrekte overtagelse af ommatidium polaritet 20.. (C) Visualisering af mosaik CRB [j1B5] mutant PRS viser deforme homozygote mutant PRS. CRB er kendt for at være nødvendig for rhabdomere morfogenese.
Figur 6. Time-kursus analyse af mosaik fatp [k10307] mutant PRs med tomat / GFP-FLP / FRT-metoden, over 14 dage. En mosaik fatp [k10307] mutant nethinden er observeret på dag 1 (A, A '), dag 4 ( B, B '), dag 8 (C, C') og dag 14 (D, D '), efter udrugning. Den samme gruppe af mosaik PRS kan være grundvolded på hvert tidspunkt i det observerede felt (hvid firkant, A, B, C, D). I dette felt af PRS (A ', B', C ', D'), er homozygote mutant PRs mærket med grønt, mens heterozygote og homozygote vildtype PRS er mærket med gult. Fra dag 4 (B) og fremefter, de homozygote mutant PRs begynde at forsvinde, hvilket indikerer at fatp [k10307] mutation inducerer en progressiv degeneration af disse PRS. Klik her for at se større figur .
Figur 7. Redning af fatp [k10307] mutant PRS med en mini-hvid-bærende fatp udtrykker konstruere. Mosaikken PRs visualiseres med tomat / GFP-FLP / FRT-metoden i 15 dage gamle fluer. (A) Visualisering af mosaik kontrol PRS. (B) Visualization af mosaik fatp mutant PRS viser tabet af mutant PRS. (C) Visualisering af mosaik fatp mutant PRs i en flue reexpressing fatp i det ydre PR (RH1> fatp). De mutante PRs reddes. Tilstedeværelsen af en mini-hvide gen og den tilhørende røde øjne pigmentering i RH1> fatp betingelser ændrer ikke Tomat eller GFP-fluorescens eller klonal påvisning.
Discussion
Drosophila øje har været meget anvendt til at dechifrere de signalveje, der regulerer udvikling, spredning og overlevelse. I begyndelsen af 1990'erne blev en lang række genetiske skærme udføres for at identificere de veje, der kræves i de indledende faser af PR-udvikling 25-27. Effektiviteten af genetiske skærme blev øget kraftigt af den mitotiske rekombinationsteknik, hvilket gør det muligt at teste tab af funktion mutationer i mosaik kloner 21. Derfor kan den rolle af embryonale letale mutationer systematisk testes i homozygote mutante kloner i øjnene af fluer, der ellers var heterozygote. De fleste mosaik screeninger har fokuseret på den tidlige PR rekruttering, differentiering axonale projektion eller morfogenese forekommer i larver eller pupper 10,25-31 udvikling. Til dato har kun én mosaik skærm undersøgt de mekanismer, der regulerer voksen PR-funktion, ved at overvåge den visuelle respons via electroretinOGRAM recordings 32.. Med tomat / GFP-FLP / FRT-metoden og muligheden for at udføre tidsforløbsanalyse i levende muterede dyr, har vi designet en ny metode til at identificere de faktorer, der regulerer voksen PR levedygtighed og funktion 20,24.
Tomat / GFP-FLP / FRT metode har flere store fordele i forhold til den klassiske histologiske sektionering af harpiks-embedded øjne. Først denne metode er meget hurtigere, billigere og lettere at udføre end den histologiske metode, forudsat at et fluorescensmikroskop udstyret med en passende vand dypning mål er til rådighed (se tabel af reagenser og udstyr). For det andet kan Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden anvendes i forbindelse med transgen udtryk som udtryk for P (UAS, w +), bærer en mini-hvid transgen. I modsætning til histologiske snit, hvor w + anvendes til klonal påvisning, i tomat / GFP-FLP / FRT-system, P (UAS, w +) ikke interfererer med klonal detection baseret på Tomat fluorescerende protein. Brug P (UAS-fatp, w +) transgene fluer, var vi i stand til at visualisere redning af fatp mutant PRS (figur 7). For det tredje, en vigtig faldgrube af alle typer af klonal analyse, herunder at baseret på tomat / GFP-FLP / FRT, er tvetydigheden i genotype af tabte PRS. Faktisk kan det være uklart, om et PR er fraværende på grund af manglen på et bestemt gen funktion eller på grund af en celle non-autonom effekt, især ved grænsen til mutanten klon. Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden får omkring dette problem for degeneration ved at gøre det muligt at følge vildtype og mutant PRs i samme dyr over perioder på flere uger. Vi var i stand til at følge den skæbne enkelte PRS kinetiske analyser på forskellige fatp mutant fluer (figur 6). Det samme klon kan genkendes i et givet dyr på forskellige tidspunkter på grund af den præcise form af de omgivende vildtype-kloner. Vi var i stand til at vise entydigly at alle de manglende PRs var mutant for fatp, hvilket indikerer, at den rolle fatp mutanter i PRS celle-autonome. Således ved at overvåge tabet af PRS i en kinetisk analyse, er det muligt at bestemme genotypen PRS i modeller af voksen-debut degeneration. Endelig har tomat / GFP-FLP / FRT-metoden vist sig meget stærk til identifikation af faktorer, der regulerer oprettelsen af PCP 20.. Muligheden for at udføre et stort antal mosaik ommatidia til polaritet fænotype uden behovet for dele, muliggør hurtig bestemmelse af PR kravet om indførelse af PCP. Ikke desto mindre ville finere analyse af PR integritet kræver traditionel sektionering efterfulgt af fase-kontrast eller elektroniske microscopies.
Afslutningsvis Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden åbner op for nye muligheder for effektiv mosaik screening for at identificere faktorer, der regulerer PR udviklingsprocesser og voksen PR funktioner, såsom VISual respons og levedygtighed.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
PLATIM og Droso-Tools faciliteterne i UMS3444 Biosciences, Lyon, Frankrig. BM forskning blev støttet af tilskud fra Fondation pour la Recherche Médicale fra CNRS (ATIP) og ANR-12-BSV1-0019-01. PD blev støttet af Retina Frankrig foreningen og Ecole Normale Supérieure i Lyon (Frankrig). CL blev støttet af La Ligue Nationale contre le Cancer Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
| Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
| Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
| Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
| 40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |
References
- Hardie, R. C. Sensory physiology 5. Ottoson, D. 5, 1-79 (1985).
- Wolff, T., Ready, D. F. Cell death in normal and rough eye mutants of Drosophila. Development. 113, 825-839 (1991).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Halder, G., Callaerts, P., Gehring, W. J. Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila. Science. 267, 1788-1792 (1995).
- Mollereau, B., Domingos, P. M. Photoreceptor differentiation in Drosophila: from immature neurons to functional photoreceptors. Dev Dyn. 232, 585-592 (2005).
- Mollereau, B. Cell death: what can we learn from flies? Editorial for the special review issue on Drosophila apoptosis. Apoptosis. 14, 929-934 (2009).
- Charlton-Perkins, M., Brown, N. L., Cook, T. A. The lens in focus: a comparison of lens development in Drosophila and vertebrates. Mol Genet Genomics. 286, 189-213 (2011).
- Jenny, A. Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye. Curr Top Dev Biol. 93, 189-227 (2010).
- Montell, C.
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59 (2005).
- Tomlinson, A., Ready, D. F.
- Mendes, C. S., et al. ER stress protects from retinal degeneration. Embo J. 28, 1296-1307 (2009).
- Jenny, A. Preparation of adult Drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis. J Vis Exp. , (2011).
- Mollereau, B., et al. Two-step process for photoreceptor formation in Drosophila. Nature. 412, 911-913 (2001).
- Domingos, P. M., et al. Spalt transcription factors are required for R3/R4 specification and establishment of planar cell polarity in the Drosophila eye. Development. 131, 5695-5702 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c-d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO Rep. 7, 933-939 (2006).
- Domingos, P. M., et al. Regulation of R7 and R8 differentiation by the spalt genes. Dev Biol. 273, 121-133 (2004).
- Mollereau, B., et al. A green fluorescent protein enhancer trap screen in Drosophila photoreceptor cells. Mech Dev. 93, 151-160 (2000).
- Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128, 815-826 (2001).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-134 (2011).
- Golic, K. G. Site-specific recombination between homologous chromosomes in Drosophila. Science. 252, 958-961 (1991).
- Porter, J. A., Hicks, J. L., Williams, D. S., Montell, C. Differential localizations of and requirements for the two Drosophila ninaC kinase/myosins in photoreceptor cells. J Cell Biol. 116, 683-693 (1992).
- Johnson, K., Grawe, F., Grzeschik, N., Knust, E. Drosophila crumbs is required to inhibit light-induced photoreceptor degeneration. Curr Biol. 12, 1675-1680 (2002).
- Dourlen, P., et al. Drosophila fatty acid transport protein regulates rhodopsin-1 metabolism and is required for photoreceptor neuron survival. PLoS Genet. 8, e1002833 (2012).
- Mlodzik, M., Hiromi, Y., Weber, U., Goodman, C. S., Rubin, G. M. The Drosophila seven-up gene, a member of the steroid receptor gene superfamily, controls photoreceptor cell fates. Cell. 60, 211-224 (1990).
- Gaul, U., Chang, H., Choi, T., Karim, F., Rubin, G. M. Identification of ras targets using a genetic approach. Ciba Found Symp. 176, 85-92 (1993).
- Wassarman, D. A., Therrien, M., Rubin, G. M. The Ras signaling pathway in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 5, 44-50 (1995).
- Janody, F., et al. A mosaic genetic screen reveals distinct roles for trithorax and polycomb group genes in Drosophila eye development. Genetics. 166, 187-200 (2004).
- Legent, K., Steinhauer, J., Richard, M., Treisman, J. E. A screen for X-linked mutations affecting Drosophila photoreceptor differentiation identifies Casein kinase 1alpha as an essential negative regulator of wingless signaling. Genetics. 190, 601-616 (2012).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Berger, J., et al. Systematic identification of genes that regulate neuronal wiring in the Drosophila visual system. PLoS Genet. 4, e1000085 (2008).
- Bayat, V., et al. Mutations in the mitochondrial methionyl-tRNA synthetase cause a neurodegenerative phenotype in flies and a recessive ataxia (ARSAL) in humans. PLoS Biol. 10, e1001288 (2012).
