Summary
Den Tomat / GFP-FLP / FRT metod innebär att visualisera mosaik fotoreceptorceller i levande Drosophila. Den kan användas för att följa individuella fotoreceptorcellöden i näthinnan i dagar eller veckor. Den här metoden är idealisk för studier av retinal degeneration och neurodegenerativa sjukdomar eller fotoreceptorcellutveckling.
Abstract
Den Drosophila ögat används allmänt som en modell för studier av utveckling och neuronal degenerering. Med den kraftfulla mitotiska rekombination, har eleganta genetiska skärmar baserade på klonal analys ledde till identifieringen av signalvägar som är involverade i ögonutveckling och fotoreceptor (PR) differentiering på larvstadier. Vi beskriver här den Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden, som kan användas för snabb klonal analys i ögat av levande vuxna Drosophila. Fluorescerande ljusmätare celler avbildas med hornhinnan neutralisering tekniken, på näthinnor med mosaik kloner genereras av flipase medierad rekombination. Denna metod har flera stora fördelar jämfört med klassiska histologiska sektionering av näthinnan: den kan användas för high-throughput screening, och har visat sig vara en effektiv metod för att identifiera de faktorer som reglerar PR överlevnad och funktion. Den kan användas för kinetiska analyser av PR degeneration i samma levande animal under flera veckor, för att visa att kravet på specifika gener för PR överlevnad eller funktion i den vuxna flugan. Denna metod är också användbar för att ta itu med cellautonomifrågor i utvecklings mutanter, exempelvis sådana där etableringen av plana cell polaritet påverkas.
Introduction
The Drosophila näthinnan består av cirka 800 ommatidial enheter (Figur 1A), som just organiserad, med en klart definierad axel polaritet (Figur 1B). Varje enhet innehåller 20 celler: åtta fotoreceptorceller (PRS) och 12 tillbehörs celler, inklusive kon celler, pigmentceller och borst celler 1,2. Två klasser av PR särskiljs på grundval av den typ av rhodopsin (Rh) de uttrycker. De sex yttre PRs (R1-6) uttrycker RH1 och är anordnade i en trapetsoid mönster (Figur 1C). I centrum av trapetsen, de två inre PRs (R7/R8) uttrycker fyra möjliga typer av rhodopsin (RH3, RH4, RH5 eller RH6) och är organiserade så att R7 ligger på toppen av R8 3.
Mer än 2.500 gener är involverade i morfogenes av Drosophila ögat 4, vilket har visat sig vara en mycket kraftfull modell för studier av en bred panel av processer, bland annat ögon utveckling, PR rekrytering, differentiering, planar cell polaritet, morfogenes, överlevnad, apoptos och visuella transduktion 5-9.
Forskare som arbetar på Drosophila ögat har, under många år, utvecklade tekniker för avbildning av näthinnan och genomför systematiska genetiska skärmar. Det enklaste sättet att bilden den vuxna näthinnan är att titta på hornhinnan i en immobiliserad djur (Figur 1A). Strukturen av hornhinnan kan visualiseras exakt genom svepelektronmikroskopi och användes i en storskalig genetisk skärmen av URCFG konsortium ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Detta är en mycket effektiv metod för att visualisera globala morfologiska förändringar i hornhinnans struktur, såsom ögon ojämnheter eller glans, ofta framkallade av mutationer i gener som kontrollerar tidiga steg i utvecklingen eller cellernas livskraft. Emellertid är inte su globala visualisering av hornhinnanfficient att identifiera de faktorer som reglerar PR rhabdomere morfogenes eller en vuxen PR livskraft och funktion. Sådana analyser kräver en mer grundlig utredning av PR integritet, baserat på faskontrastmikroskopi tangentiella semi-tunna sektioner av näthinnan 11-13 harts. Denna teknik är lämplig för mosaik analyser, där muterade PRs kan identifieras genom deras brist på rött pigment 14,15.
Mosaik mutanta kloner kan också visualiseras i hela montering dissektioner av pupal eller vuxen näthinnan, på grundval av deras avsaknad av grönt fluorescerande protein signal (GFP) på fluorescensmikroskopi 16,17. Dessa två tekniker är mycket användbara, men båda är arbets-och tidskrävande och är därför inte lämplig för storskalig screening. Vi och andra har utvecklat användningen av hornhinnan Neutralisering för avbildning av PRs producerar fluorescerande proteiner 18,19, för att underlätta snabb PR analyser. Med denna teknik, mutantkloner kan identifieras på basis av autofluorescens av den röda (w +) pigment i mosaik vuxna Drosophila kloner. Men denna metod inte ger den encelliga upplösning som krävs för att ta itu med cell autonomi frågor 19. Vi löste problemet genom att utveckla Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden, som kombinerar avbildning av fluorescerande proteiner genom hornhinnan neutralisering med mitotiska rekombination 20. Denna metod gör det möjligt att med hög genomströmning, snabb och exakt identifiering av muterade PRs i mosaik kloner, vid encelliga upplösning ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). Den är lämplig för användning i kinetiska analyser, för att följa enskilda PRs under en period av veckor i levande Drosophila. Vi beskriver här den Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden och tips för dess användning i enkla, kinetiska analyser av mosaik ögon.
Protocol
1. Crossing med tomat / GFP-FLP / FRT Lines
Den generation av flugor som bär den muterade klonen kräver en enda korsning mellan en FRT-bärande mutant linje och motsvarande Tomat / GFP-FLP / FRT flyga linjen.
Detta arbete utnyttjade BruinFly samlingen av FRT-rekombinerade mutationer ( http://www.bruinfly.ucla.edu ). Fyra Tomat / GFP-FLP / FRT linjer kan användas, bär FRT RH1-tdtomatoninaC på varje armarna på 2: a och 3: e kromosomer i kombination med källa flipase (EY-FLP) och uttryck av GFP i alla yttre PRs (RH1-Gal4 UAS -GFP) 20:
- 2L arm: linje # 43345, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*], P {w [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2L P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 40A, P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 3
- 2R arm: linje # 43346, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*], P {rf [+ t7.2] = neoFRT} 42D P{W [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2R, P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 3
- 3L arm: linje # 43347, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*], P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 2, P {w [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3L P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 80B/TM6B, Tb [1]
- 3R arm: linje # 43348, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*], P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 2, P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 82B P {w [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B, Tb [1]
Dessa fyra linjer finns på Bloomington Drosophila aktiecentrum. De gav en källa till FLP i utvecklings öga för generering av mitotiska kloner 21. Vildtyp-kromosom uppbär en FRT-sekvens och en RH1-tdTomato ninaC konstruktion kodande den röda fluorescerande protein tdTomato, som en markör för vildtyp och heterozygota yttre PRs. I denna konstruktion, de sista 41 aminosyrorna av P174 isoform av ninaC (varken inaktivering eller aktivering av C-gen) var apsuspenderad i läsramen till C-terminalen av tdTomato sekvensen. Den C-terminala svansen av P174 ninaC isoformen är ansvarig för rhabdomeral lokalisering av proteinet 22 och medger bättre levande visualisering av fluorescerande röda PRs använder hornhinnans neutralisering teknik. Den RH1 promotorn är den minimala 234 bp (-152 +82) RH1 promotor. Det gröna fluorescerande markör GFP uttrycks av alla de yttre PRs, på grund av närvaron av den RH1-Gal4 (3kb-promotor) och UAS-GFP ninaC konstrukt. Korsningar mellan en fluga lager bär en mutation x på FRT-kromosomen (FRT-x) och Tomat / GFP-FLP / FRT linjer ger en avkomma med följande genotyp (exempel på mutation på 2L): RH1-Gal4, ey-FLP ; FRT40A, RH1-tdTomato ninaC / FRT40A-x; UAS-GFP ninaC. I dessa flugor är homozygota mutanta celler genereras genom mitotisk rekombination i framkallnings öga skiva och dela sig för att skapa en klon av homozygota mutanta PRs (Figur 2A). Homozygous mutantceller kan identifieras eftersom de uttrycker endast den gröna fluorescerande protein (GFP), medan det omgivande vildtyp och heterozygota celler uttrycker både tdTomato och GFP (fig. 2B och B ").
2. Förberedelser Drosophila för Fotoreceptor Visualisering
För PR-visualisering av hornhinnan neutralisering tekniken, immobilisera flugor på agarosplattor.
- Förbered en tvättflaska fylld med 4 ° C destillerat vatten och placera den på is.
- Lös vanlig agaros i vatten (1,2 till 1,5% agaros i 100 ml vatten) genom upphettning i en mikrovågsugn. Placera kolven i ett vattenbad vid 55 ° C och låt agaroslösningen att kylas till denna temperatur. Håll agarosen vid 55 ° C fram till användning.
- Söva flugor med CO2 under minst 1 min.
- Häll den varma agaroslösningen (vid 55 ° C) i en petriskål (35 x 10 mm, 1,37 x 0,39 cm) och placera omedelbartbart den bedövades Drosophila på agaros. För nybörjare, börjar med 10 flugor per petriskål är rimligt. Bigger petriskål (60 x 15 mm, 2.362 x 0.59 in) kan också användas.
- Under ett dissektionsmikroskop, orientera Drosophila på dess sida med pincett, tryck en vinge i agarosen, så att kanterna och halvan av kroppen är inbäddade i agaros (figurerna 3A-3A ""). Stick den andra vingen på ytan av agarosen. Obs: Om flugorna inte är inbäddade djupt nog i agaros, kommer flugan att vara fri att röra sitt huvud under avbildning av PR, och detta kommer att resultera i suddiga bilder. Orienteringen av ögat kommer också att störas. Det kan vara svårt att försätta Drosophila i agarosen, på grund av antingen den koncentration av agaros eller dess temperatur. Det är lättare att bädda flugor i mer koncentrerad agaros, men om agarosen är alltför koncentrerad, kan farten sjunka. Om agaros är för kallt, kan det vara difficult att bädda in i farten, men en alltför hög temperatur kan skada hornhinnan.
- Placera petriskål på is och tillåta agarosen att stelna.
- Med pincett, orientera huvudet så att ett öga är exponerat för immersionsobjektiv (figur 3A 'och 3A ""). I allmänhet kan ett öga anses vara väl orienterad under dissektionsmikroskop när pseudopupil (visualiseras som en svart fläck) är i mitten av ögat. En optimal orientering av ögat maximerar bredden av ommatidial fält där PRs är fokuserade. Syftet med orientering steg är att finna det område av ögat med det bredaste området för fokuserade PRs, vanligtvis i mitten av ögat. Detta steg är också användbart för avlägsnande av eventuella ben eller aristae täcker ögat och hindrar dess visualisering.
- Täck farten med iskallt vatten och lämna petriskål på is tills visualisering. Iskallt vatten håller flugorna sövda.
3. VisualiseraFotoreceptorer i mikroskop
För visualisering av PRs genom hornhinnan, använder detta protokoll en upprätt mikroskop utrustat med en vatten objektiv med lång räckvidd (W N-Achroplan 40X/0.75).
- Placera petriskål täckt med iskallt vatten på en glasplatta på scenen i mikroskop (Figur 3 f.Kr.). Petriskålen kan limmas till objektglaset, vilket gör det möjligt att flytta det om smidigt med mikrometerskruvarna.
- Störta immersionsobjektiv i vattnet petriskålens (figurerna 3B'-3C). Placera huvudet på flugan under excitationsstrålen (börja med GFP-filter, till exempel). Flytta bordet upp och ner tills strålen konvergerar på ögat. När ögat är på rätt nivå, tenderar det att reflektera exciteringsljuset.
- Titta genom okularet för fluorescens. När ögat är placerat i centrum av synfältet, fokuserar nedanförhornhinnan för att visualisera de fluorescerande fotoreceptorer.
Not 1: När man tittar genom okularet kan det vara orolig för att särskilja de kroppsdelar av farten, särskilt den distala delen av buken och huvudet, till exempel. I sådana fall bör du titta direkt på scenen för att placera om Drosophila.
Not 2: Klassisk fluorescens eller konfokalmikroskopi kan användas. Konfokalmikroskopi ger bilder med mindre bakgrund och ett bredare fokuserade PRs än klassisk mikroskopi. Ett exempel set-up är en LSM510 konfokalmikroskop (Zeiss) med en 40X vattenmålet. Bättre resultat kan erhållas genom att öppna hål i konfokalmikroskop bredare än vad som vanligtvis rekommenderas för målet. Använd exempelvis ett värde på 204, snarare än standard 98 för öppning hål.
Anmärkning 3: Högre nivåer av w + pigmentering i ögat minskar bakgrundsfluorescens. 4. Time-kurs Visualisering av ljusmätare celler
Försiktighet krävs när man följer ödet för en individ PR inom samma öga över en tidsperiod.
- Minska temperaturen hos agarosen till 45 ° C, för att maximera Drosophila överlevnad. Agarosen stelnar mycket snabbt vid denna temperatur. Endast en Drosophila bör användas per petriskål, så att flugorna inte förväxlas under observationer.
- Systematiskt placera flugor på samma sida, för visning av samma öga. Detta kan uppnås genom att ta sövd fly från sin flaska med en vinge och placera Drosophila på agaros. Orientera alltid ögat på samma sätt om det är möjligt, vilket gör det lätt att hitta PR-kloner som har visats tidigare.
- Identifiera kloner på basis av deras form under konfokalmikroskop. Synfältet är ofta belägna intill klon av intresse. I such fall bör ögat omorienteras under vatten, för att centrera synfält på klon av intresse, baserat på polariteten hos ögat (fig. 4).
5. Återställa Flugor efter Visualisering
- Avlägsna vattnet från petriskål.
- Dra försiktigt Drosophila ur agaros med pincett.
- Torka Drosophila på en vävnad.
- Returnera Drosophila till en flaska och se till att den inte fastnar i maten. Tillåten flugan att komma runt vid 25 ° C.
Representative Results
Den Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden kan användas för att studera effekten av en mutation eller för ektopisk uttryck på utveckling och överlevnad PRs i Drosophila näthinnan. Den är snabb, vilket gör den idealisk för screening, som nyligen visat 20. Förekomsten av muterade PRs intill vildtyp PRs i samma öga gör det enkelt att upptäcka defekter i samband med muterade PRs och att ta itu med cell autonomi frågan.
De utvecklingsdefekter som observerats i vår analys påverkas olika processer, bland annat PR rekrytering, morfogenes och planar cell polaritet (PCP) anläggning (Figur 5). Sju i sin frånvaro krävs för PR rekrytering, i synnerhet för R7 en av inner PR. Förlusten av Seven utevaroresulterar i förlust av det inre PR och vissa yttre PRs (figur 5A). Kornig huvudet (GRH) är involverad i PCP-anläggning, vissa ommatidia är inverted i GRH mutanta kloner (Figur 5B). Denna metod gör det möjligt att identifiera de muterade PRs i mosaik ommatidia, underlätta identifiering av PRS där genen krävs för rätt förvärvet av PCP. Vi har visat att grh krävs för korrekt förvärv av PCP i R3-prekursorer 20. Faktiskt konstaterade vi att i den inverterade ommatidia, R4, som härstammar onormalt från R3 prekursor, var alltid mutanten. Smulor (Crbs) är en apikala membranprotein som krävs för rhabdomere morfogenes 23. Förlusten av Crbs i Crbs 11A22 muterade resultat i oregelbundna, större eller mindre PRs (figur 5C).
Denna metod kan också användas för att följa ödet för enstaka PRs under vuxen ålder (Figur 6). Den är idealisk för neurodegeneration studier, eftersom en grupp av homozygota muterade PRs kan ses och samma grupp kan finnas i samma ögaSamma flyga över en period av dagar eller veckor. Det är därför möjligt att bestämma vilka PRs överleva och som är dömda att dö, eftersom varje klon har en unik form som kan kännas igen när ögat är placerat under fluorescensmikroskop. Eftersom näthinnan är polariserad, är det möjligt att orientera näthinnan att hitta samma klon igen, på grund av dess form. Vi använde den här metoden för att visa att fatp k10307 mutation framkallar progressiv PR degeneration i vuxen ålder (Figur 6, 24). Denna visualisering metod kan också användas för att analysera cell autonomi. I fatp k10307 mosaik näthinnan, var PR förlust begränsad till fatp muterade PRs, vildtyp PRs vara opåverkad. Kravet på fatp för PR livskraft är därför cell autonom. Vi kunde också rädda fatp mutant PR genom reexpressing vildtyp fatp med en RH1-Gal4 förare och en UAS-fatp konstruktionen (Figur 7). Denmöjlighet att genomföra sådana räddningsförsök är en av fördelarna med tomat / GFP-FLP / FRT-metoden över klonal analys baserad på histologiska sektioner av harts-inbäddade näthinnan. Faktum är klonal detektion med tomat / GFP-FLP / FRT-metoden inte påverkades av användningen av P (UAS, v +) transgena konstruktioner, medan röd pigmentering associerad med mini-vit-genen (w +) täcker ögat med rött pigment , maskering mosaik kloner i histologiska sektioner.
Figur 1. Organisation av Drosophila ögat. (A) Fotografi av en Drosophila ögat tagna med ett stereomikroskop. The Drosophila ögat är sammansatt av ungefär 800 ommatidia. (B) Schematisk bild av ett fält av 64 ommatidia i mitten av ögat. De sex yttre ljusmätare neuroner (PRS) i varje ommatidium,visas i grönt, är organiserade i en stereotyp trapets som pekar till närmaste polerna i ögat. De pekar alltså i motsatt riktning i den ventrala och dorsala delen av ögat och är spegelbild beroende på gränsen mellan de två delarna, som kallas ekvatorn. (C) Schematisk bild av en ommatidium. Varje ommatidium innehåller åtta PRs. PRs R1 till R6, som visas i grönt, är de yttre PRs. De uttrycker det ljuskänsliga molekylen rhodopsin1 (RH1) och är motsvarigheten till däggdjursstavceller. De inre PRs, R7 och R8, visas i grått (R7 sitter på toppen av R8). De inre PRs uttrycka rhodopsin 3, 4, 5 eller 6 och är motsvarigheten till däggdjurs kon celler. För enkelhets skull endast rhabdomere, den ljuskänsliga delen av PR, visas för varje PR. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Ställa in Drosophila för visualization av hornhinnan neutralisering. (A-A'''') Fotografier av en Drosophila immobiliserade på en platta fylld med agaros. I panel A'''', har en bit av agaros som innehåller flugan skurits för att ta en profil fotografi. Den Drosophila är halv inbäddad i agaros, med högra flygeln i agaros och vänsterflygeln fastnat på agaros ytan (A, A'', A''''). När Drosophila är inbäddad i agaros, är dess huvud ofta dåligt placerade för visualisering av ögat (A, A '). Huvudet måste därför läggas om med pincett så att den mellersta delen av ögat är vänd uppåt (A'', A'' '). (B-B') Schematiskt diagram som visar en Drosophila immobiliserad på en agaros-plattan och placeringen av den Drosophila under målet för mikroskop (C-C) Fotografier av inställningen av Drosophila på stadium av.mikroskop under sitt mål. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Orientering i ögat för tidskursanalys. Figuren visar fotografier av en Drosophila huvudet i två olika inriktningar och motsvarande fält i ommatidia ses av hornhinnan neutralisering, företräddes av schematiska diagram. (A) under den första observationen, är ögat placeras så att en klon av heterozygot eller vildtyp PRs (i gult) ses i mitten av fältet, i höjd med ekvatorn (röd linje). (B) Under den andra observationen är ögat ofta inte exakt samma orientering. Sålunda kan hittas i samma grupp av PRs igen, men det är inte möjligt att visa denexakt samma fält (till vänster). Ögat måste omorienteras för samma fält att visas på nytt. Positionen för ekvatorn kan användas som en guide. I detta exempel, vi vet att det observerade området är för ventrala och att ögat måste därför vänt ventralt placera ekvatorn i mitten av den observerade fältet igen, som i den första observationen.
Figur 5. Exempel på utvecklingsdefekter PR upptäckts av Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden. (A) Visualisering av mosaik Sina [BG02648] muterade PRs, som visar förlust av inre PRs. I den mutanta ommatidia är ytter PRs grupperade tillsammans på grund av frånvaron av det inre PR R7. Faktum är Sina känt att krävas för inre PR rekrytering. (B) Visualisering av mosaik grh [s2140] muterade PRs visar polaritet defekter. Mosaiken mutant ommatidia, SURRounded av en cirkel, pekar i motsatt riktning från vildtyp ommatidia, vilket indikerar en dorso-ventral inversion. En detaljerad studie med tomat / GFP-FLP / FRT-metoden visade att grh krävdes i R3 föregångare för en korrekt förvärv av ommatidium polaritet 20. (C) Visualisering av mosaik Crb [j1B5] muterade PRs, visar deformerade homozygota muterade PRs. CRB är känd för att krävas för rhabdomere morfogenes.
Figur 6. Time-course analys av mosaik fatp [k10307] mutanta PRs med tomat / GFP-FLP / FRT-metoden, under 14 dagar. En mosaik fatp [k10307] mutant näthinnan observeras på dag 1 (A, A '), dag 4 ( B, B '), dag 8 (C, C') och dag 14 (D, D ') efter kläckningen. Samma grupp av mosaik PRs kan vara stiftelserd vid varje tidpunkt, i det observerade fältet (vit rektangel, A, B, C, D). I detta område av PRs (A ', B', C, D ') är homozygota mutanta PRs märkt med grön, medan heterozygota och homozygota vildtyp PRs är märkta i gult. Från dag 4 (B ') och framåt, de homozygota muterade PRs börjar försvinna, vilket indikerar att fatp [k10307] mutation framkallar en progressiv degeneration av dessa PRs. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 7. Räddnings av fatp [k10307] muterade PRs med en mini-vit-bärande fatp-uttryckande konstruktion. Mosaik PRs visualiseras med tomat / GFP-FLP / FRT-metoden i 15 dagar gamla flugor. (A) Visualisering av mosaik kontroll PRs. (B) Visualization av mosaik fatp muterade PRs, som visar förlust av muterade PRs. (C) Visualisering av mosaik fatp muterade PRs i en fluga reexpressing fatp i yttre PR (RH1> fatp). De mutanta PRs räddas. Närvaron av ett mini-vit-genen och den tillhörande röda ögon pigmentering i RH1> gör fatp förhållanden förändrar inte tomat eller GFP fluorescens eller klon upptäckt.
Discussion
Drosophila ögat har i stor utsträckning använts för att dechiffrera de signalvägar som reglerar utveckling, spridning och överlevnad. I början av 1990-talet ett stort antal genetiska skärmar gjorts för att identifiera de vägar som krävs under de inledande faserna av PR utveckling 25-27. Effektiviteten av genetiska skärmar har ökat kraftigt genom den mitotiska rekombination teknik, som gör det möjligt att testa förlust-av-funktion mutationer i mosaik kloner 21. Därför kunde testas roll embryonala letala mutationer systematiskt homozygota muterade kloner i ögonen av flugor som var annars heterozygot. De flesta mosaik filmvisningar har fokuserat på den tidiga PR rekrytering, differentiering, axonal projektion eller morfogenes inträffar i utvecklings larver eller puppor 10,25-31. Hittills har endast en mosaik skärm undersökt de mekanismer som reglerar vuxen PR-funktion, genom att övervaka visuell respons via electroretinogram inspelningar 32. Med Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden och möjligheten att utföra tidsförloppet analys i levande muterade djur, har vi utformat en ny metod för att identifiera de faktorer som reglerar vuxen PR livskraft och funktion 20,24.
Den Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden har flera stora fördelar jämfört med den klassiska histologiska sektionering av harts inbäddade ögon. För det första är denna metod mycket snabbare, billigare och enklare att utföra än den histologiska metod, förutsatt att en fluorescensmikroskop utrustat med en lämplig vatten doppa mål är tillgänglig (se tabell av reagenser och utrustning). För det andra kan Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden användas i samband med transgent uttryck, såsom uttrycket av P (UAS, v ^), som bär en mini-vit transgen. I motsats till histologiska sektioner, i vilka W + används för klonal detektion, i tomat / GFP-FLP / FRT-systemet, P (UAS, v +) inte interfererar med klonal detection baserade på tomat fluorescerande protein. Med hjälp av P (UAS-fatp, w +) transgena flugor, kunde vi visualisera att rädda fatp muterade PRs (Figur 7). För det tredje, en viktig fallgrop av alla typer av klonal analys, bland annat att utifrån Tomat / GFP-FLP / FRT är tvetydigheten i genotypen av förlorade PRs. I själva verket kan det vara oklart om en PR är frånvarande på grund av avsaknaden av en specifik genfunktion, eller på grund av en cell icke-autonom verkan, i synnerhet vid den kant av den mutanta klonen. Den Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden blir runt detta problem för degenerering genom att göra det möjligt att följa vildtyp och muterade PRs i samma djur under perioder om flera veckor. Vi kunde följa vad som händer med de enskilda PRs genom kinetiska analyser på olika fatp muterade flugor (Figur 6). Samma klon kan identifieras i ett givet djur vid olika tidpunkter, på grund av den exakta formen av de omgivande vildtyp kloner. Vi kunde visa entydigtly att alla de saknade PRs var mutanta för fatp, vilket indikerar att rollen för fatp mutanter i PRs är cellautonoma. Således genom att övervaka förlusten av PRs i en kinetisk analys, är det möjligt att bestämma genotypen av PRs i modeller av vuxen debuterande degeneration. Slutligen har Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden visade sig vara mycket kraftfullt för att identifiera faktorer som reglerar inrättandet av PCP 20. Möjligheten att ha dödat ett stort antal mosaik ommatidia för en polaritet fenotyp utan behov av sektioner, underlättar snabb bestämning av PR kravet på inrättande av PCP. Trots detta skulle finare analys av PR integritet kräver traditionella snitt följt av fas-kontrast eller elektroniska microscopies.
Sammanfattningsvis öppnar Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden nya möjligheter för effektiv mosaik screening för att identifiera faktorer som reglerar PR utvecklingsprocesser och vuxen PR-funktioner, till exempel visUAL svar och livskraft.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
PLATIM och Droso-Tools anläggningar i UMS3444 Biosciences, Lyon, Frankrike. BM: s forskning har finansierats med bidrag från Fondation pour la Recherche Médicale från CNRS (ATIP) och ANR-12-BSV1-0019-01. PD fick stöd av Retina Frankrike föreningen och Ecole Normale Supérieure i Lyon (Frankrike). CL stöddes av La Ligue Nationale contre le Cancer föreningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
| Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
| Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
| Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
| 40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |
References
- Hardie, R. C. Sensory physiology 5. Ottoson, D. 5, 1-79 (1985).
- Wolff, T., Ready, D. F. Cell death in normal and rough eye mutants of Drosophila. Development. 113, 825-839 (1991).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Halder, G., Callaerts, P., Gehring, W. J. Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila. Science. 267, 1788-1792 (1995).
- Mollereau, B., Domingos, P. M. Photoreceptor differentiation in Drosophila: from immature neurons to functional photoreceptors. Dev Dyn. 232, 585-592 (2005).
- Mollereau, B. Cell death: what can we learn from flies? Editorial for the special review issue on Drosophila apoptosis. Apoptosis. 14, 929-934 (2009).
- Charlton-Perkins, M., Brown, N. L., Cook, T. A. The lens in focus: a comparison of lens development in Drosophila and vertebrates. Mol Genet Genomics. 286, 189-213 (2011).
- Jenny, A. Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye. Curr Top Dev Biol. 93, 189-227 (2010).
- Montell, C.
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59 (2005).
- Tomlinson, A., Ready, D. F.
- Mendes, C. S., et al. ER stress protects from retinal degeneration. Embo J. 28, 1296-1307 (2009).
- Jenny, A. Preparation of adult Drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis. J Vis Exp. , (2011).
- Mollereau, B., et al. Two-step process for photoreceptor formation in Drosophila. Nature. 412, 911-913 (2001).
- Domingos, P. M., et al. Spalt transcription factors are required for R3/R4 specification and establishment of planar cell polarity in the Drosophila eye. Development. 131, 5695-5702 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c-d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO Rep. 7, 933-939 (2006).
- Domingos, P. M., et al. Regulation of R7 and R8 differentiation by the spalt genes. Dev Biol. 273, 121-133 (2004).
- Mollereau, B., et al. A green fluorescent protein enhancer trap screen in Drosophila photoreceptor cells. Mech Dev. 93, 151-160 (2000).
- Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128, 815-826 (2001).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-134 (2011).
- Golic, K. G. Site-specific recombination between homologous chromosomes in Drosophila. Science. 252, 958-961 (1991).
- Porter, J. A., Hicks, J. L., Williams, D. S., Montell, C. Differential localizations of and requirements for the two Drosophila ninaC kinase/myosins in photoreceptor cells. J Cell Biol. 116, 683-693 (1992).
- Johnson, K., Grawe, F., Grzeschik, N., Knust, E. Drosophila crumbs is required to inhibit light-induced photoreceptor degeneration. Curr Biol. 12, 1675-1680 (2002).
- Dourlen, P., et al. Drosophila fatty acid transport protein regulates rhodopsin-1 metabolism and is required for photoreceptor neuron survival. PLoS Genet. 8, e1002833 (2012).
- Mlodzik, M., Hiromi, Y., Weber, U., Goodman, C. S., Rubin, G. M. The Drosophila seven-up gene, a member of the steroid receptor gene superfamily, controls photoreceptor cell fates. Cell. 60, 211-224 (1990).
- Gaul, U., Chang, H., Choi, T., Karim, F., Rubin, G. M. Identification of ras targets using a genetic approach. Ciba Found Symp. 176, 85-92 (1993).
- Wassarman, D. A., Therrien, M., Rubin, G. M. The Ras signaling pathway in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 5, 44-50 (1995).
- Janody, F., et al. A mosaic genetic screen reveals distinct roles for trithorax and polycomb group genes in Drosophila eye development. Genetics. 166, 187-200 (2004).
- Legent, K., Steinhauer, J., Richard, M., Treisman, J. E. A screen for X-linked mutations affecting Drosophila photoreceptor differentiation identifies Casein kinase 1alpha as an essential negative regulator of wingless signaling. Genetics. 190, 601-616 (2012).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Berger, J., et al. Systematic identification of genes that regulate neuronal wiring in the Drosophila visual system. PLoS Genet. 4, e1000085 (2008).
- Bayat, V., et al. Mutations in the mitochondrial methionyl-tRNA synthetase cause a neurodegenerative phenotype in flies and a recessive ataxia (ARSAL) in humans. PLoS Biol. 10, e1001288 (2012).
