Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار Published: September 20, 2013 doi: 10.3791/50610
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Laboratory of Molecular Biology of the Cell, Ecole Normale Supérieure de Lyon, 2INSERM U744, Institut Pasteur de Lille, Université Lille-Nord de France, 3Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of Apoptosis and Cancer, The Rockefeller University

Summary

ينطوي على طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT تصور خلايا مستقبلة للضوء الفسيفساء في ذبابة الفاكهة الحية. ويمكن استخدامه لمتابعة مصائر فردية خلية مستقبلة للضوء في شبكية العين لعدة أيام أو أسابيع. هذه الطريقة مثالية للدراسات تنكس الشبكية وأمراض الاعصاب أو تطوير خلايا مستقبلة للضوء.

Abstract

ويستخدم على نطاق واسع العين ذبابة الفاكهة كنموذج لدراسات التنمية وتنكس الخلايا العصبية. مع تقنية قوية الإنقسامية إعادة التركيب، أدت شاشات الوراثية أنيقة على أساس تحليل نسيلي لتحديد مسارات الإشارات المشاركة في التنمية والعين مبصرة (PR) التمايز في مراحل اليرقات. نحن هنا وصف طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT، والتي يمكن استخدامها لتحليل نسيلي السريع في عين يعيشون الكبار ذبابة الفاكهة. يتم تصوير خلايا مستقبلة للضوء الفلورسنت مع تقنية تحييد القرنية، على شبكية العين مع استنساخ الفسيفساء التي تم إنشاؤها بواسطة بوساطة flipase إعادة التركيب. هذا الأسلوب له مزايا كبيرة عدة على باجتزاء النسيجي الكلاسيكية من شبكية العين: ويمكن استخدامه لفحص عالية الإنتاجية وأثبت وسيلة فعالة لتحديد العوامل التي تنظم بقاء العلاقات العامة وظيفة. ويمكن استخدامه لتحليل الحركية للانحطاط العلاقات العامة في نفس أنيم المعيشةالقاعدة خلال عدة أسابيع، للتدليل على شرط جينات معينة لبقاء العلاقات العامة أو وظيفة في الطيران الكبار. هذه الطريقة مفيدة أيضا لمعالجة قضايا الحكم الذاتي خلية في المسوخ التنموية، مثل تلك التي يتأثر إنشاء خلية قطبية مستو.

Introduction

وتتكون الشبكية من ذبابة الفاكهة حوالي 800 وحدة ommatidial (الشكل 1A)، والتي يتم تنظيمها على وجه التحديد، مع محور واضحة المعالم من القطبية (الشكل 1B). كل وحدة تحتوي على 20 الخلايا: ثمانية خلايا مستقبلة للضوء (PRS) و 12 خلايا الإكسسوارات، بما في ذلك الخلايا المخروطية، والخلايا الصبغية الشعر الخشن الخلايا 1،2. وتتميز فئتين من العلاقات العامة على أساس نوع رودوبسين (ره) التي تعبر عنها. المستفيدين الرئيسيين الستة الخارجي (R1-6) التعبير عن RH1 ومرتبة في نمط شبه منحرف (الشكل 1C). في وسط شبه منحرف، وهما المستفيدين الرئيسيين الداخلية (R7/R8) عن أربعة أنواع من الممكن رودوبسين (RH3، RH4، RH5 أو RH6) ويتم تنظيم مثل هذا R7 تقع على رأس R8 3.

ويشارك أكثر من 2،500 الجينات في التشكل من العين ذبابة الفاكهة 4، الذي أثبت نموذج قوية جدا للدراسات من لوحة واسعة من العمليات، بما في ذلك ديفي العينlopment والتوظيف والعلاقات العامة، والتمايز، والاستقطاب الخلية مستو، التشكل، البقاء على قيد الحياة، وموت الخلايا المبرمج تنبيغ البصرية 5-9.

الباحثون يعملون على العين ذبابة الفاكهة و، على مدى سنوات عديدة، وضعت تقنيات لتصوير الشبكية وتنفيذ شاشات جينية منتظمة. أسهل طريقة لصورة شبكية العين الكبار هو أن ننظر إلى القرنية في حيوان يجمد (الشكل 1A). هيكل القرنية يمكن تصور بدقة عن طريق المسح الضوئي المجهر الإلكتروني، وكان يستخدم في شاشة الوراثية على نطاق واسع من قبل كونسورتيوم URCFG ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. هذا هو نهج فعال جدا لتصور التغيرات العالمية المورفولوجية في بنية القرنية، مثل خشونة العين أو معان، وغالبا ما يسببها طفرات في الجينات المسيطرة خطوات مبكرة في التنمية أو بقاء الخلية. ومع ذلك، والتصور العالمي للقرنية ليس سوfficient لتحديد العوامل التي تنظم العلاقات العامة PR rhabdomere التشكل أو الكبار الجدوى وظيفة. مثل هذه التحليلات تتطلب إجراء تحقيق شامل أكثر من النزاهة العلاقات العامة، على أساس المجهر المرحلة على النقيض من أقسام الراتنج شبه رقيقة عرضية من شبكية العين 11-13. هذا الأسلوب هو مناسبة لتحليلات الفسيفساء، والتي يمكن تحديدها من قبل المستفيدين الرئيسيين متحولة افتقارها للصباغ أحمر 14،15.

ويمكن أيضا استنساخ الفسيفساء متحولة يمكن تصور في تشريح كامل جبل من العذراء أو الكبار شبكية العين، على أساس افتقارها للبروتين الفلورية الخضراء (GFP) إشارة على مضان المجهري 16،17. هذه التقنيات اثنين هي مفيدة جدا، ولكن كلاهما العمالة وتستغرق وقتا طويلا وبالتالي فهي ليست مناسبة لفحص واسعة النطاق. نحن وآخرون قد وضعت استخدام تقنيات القرنية تحييد للتصوير من المستفيدين الرئيسيين إنتاج البروتينات الفلورية 18،19، لتسهيل يحلل PR السريع. مع هذه التقنية، متحولةيمكن التعرف على الحيوانات المستنسخة على أساس من تألق ذاتي من الأحمر (ث +) الصباغ في فسيفساء الكبار استنساخ ذبابة الفاكهة. ولكن، هل هذا الأسلوب لا يوفر القرار وحيدة الخلية المطلوبة لمعالجة قضايا الحكم الذاتي الخلية 19. تغلبنا على هذه المشكلة من خلال تطوير أسلوب الطماطم / GFP-FLP / FRT، الذي يجمع بين التصوير من البروتينات الفلورية التي كتبها القرنية تحييد مع إعادة التركيب الإنقسامية 20. هذا الأسلوب يسمح للإنتاجية عالية، التعرف السريع والدقيق للالمستفيدين الرئيسيين متحولة في استنساخ الفسيفساء، في قرار وحيد الخلية ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). وهي مناسبة للاستخدام في التحليل الحركي، لمتابعة المستفيدين الرئيسيين الفردية على مدى فترة من أسابيع في ذبابة الفاكهة الحية. نحن هنا وصف طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT ونصائح لاستخدامها في، تحليلات بسيطة الحركية للعيون الفسيفساء.

Protocol

1. خطوط عبور مع الطماطم / GFP-FLP / FRT

جيل من الذباب يحمل استنساخ متحولة يتطلب عرضية واحدة بين خط متحولة تحمل FRT والمقابلة الطماطم / GFP-FLP / FRT خط الطيران.

استخدام هذا العمل جمع BruinFly من الطفرات FRT معاد ( http://www.bruinfly.ucla.edu ). أربعة خطوط الطماطم / GFP-FLP / FRT يمكن استخدامها، وتحمل FRT RH1-tdtomatoninaC على كل الأسلحة من 2 والكروموسومات 3 جنبا إلى جنب مع مصدر flipase (إرنست و يونغ، FLP) والتعبير عن GFP في جميع المستفيدين الرئيسيين الخارجي (RH1-GAL4 UAS -GFP) 20:

- 2L الذراع: خط # 43345، P {راي [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1، ف {راي [+ t7.2] = إرنست و يونغ-FLP.N} 2، ث [*]؛ P {ث [+ مولودية] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2L P {راي [+ t7.2] = neoFRT} 40A؛ P {ث [+ مولودية] = UAS GFP--ninaC} 3

- 2R الذراع: خط # 43346، P {راي [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1، ف {راي [+ t7.2] = إرنست و يونغ-FLP.N} 2، ث [*]؛ P {راي [+ t7.2] = neoFRT} 42D P{ث [+ مولودية] = ninaE-tdTomato-2R ninaC}؛ P {ث [+ مولودية] = UAS GFP--ninaC} 3

- 3L الذراع: خط # 43347، P {راي [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1، ف {راي [+ t7.2] = إرنست و يونغ-FLP.N} 2، ث [*]؛ P {ث [+ مولودية] = UAS GFP--ninaC} 2؛ P {ث [+ مولودية] = ninaE-tdTomato-ninaC} {3L P راي [+ t7.2] = neoFRT} 80B/TM6B والسل [1]

- 3R الذراع: خط # 43348، P {راي [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1، ف {راي [+ t7.2] = إرنست و يونغ-FLP.N} 2، ث [*]؛ P {ث [+ مولودية] = UAS GFP--ninaC} 2؛ P {راي [+ t7.2] = neoFRT} 82B P {ث [+ مولودية] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B والسل [1]

تتوفر هذه الأسطر الأربعة في مركز الأوراق المالية بلومينغتون ذبابة الفاكهة. أنها وفرت مصدرا للFLP في العين النامية لجيل من الحيوانات المستنسخة الإنقسامية 21. البرية من نوع كروموسوم يحمل تسلسل FRT وRH1-tdTomato ninaC بناء ترميز الحمراء الفلورسنت البروتين tdTomato، كعلامة لمن النوع البري والمستفيدين الرئيسيين الخارجي متخالف. في هذا البناء، ومشاركة 41 الأحماض الأمينية من الإسوي P174 من ninaC (لا تعطيل ولا تفعيل C) كان الجين ا ف بpended في الإطار إلى C-محطة من تسلسل tdTomato. الذيل-C محطة للالإسوي P174 ninaC هي المسؤولة عن توطين rhabdomeral من البروتين 22 و تصاريح التصور أفضل حية من المستفيدين الرئيسيين أحمر فلوري باستخدام تقنية القرنية التعادل. المروج RH1 هو الحد الأدنى من 234 سنة مضت (-152 +82) RH1 المروج. وأعرب علامة الفلورية الخضراء GFP من قبل جميع المستفيدين الرئيسيين الخارجي، وذلك بسبب وجود RH1-GAL4 (3KB المروج) وUAS GFP-ninaC يبني. الصلبان بين الأسهم ذبابة تحمل طفرة كروموسوم x على FRT (FRT-X) وخطوط الطماطم / GFP-FLP / FRT تعطي ذرية مع التركيب الوراثي التالية (على سبيل المثال من طفرة على 2L): RH1-GAL4، إرنست و يونغ، FLP ؛ FRT40A، RH1-tdTomato ninaC / FRT40A-X؛ UAS GFP-ninaC. في هذه الذباب، تتولد خلايا متحولة متماثلة اللواقح قبل إعادة التركيب الإنقسامية في القرص العين النامية وتقسيم لتوليد نسخة من المستفيدين الرئيسيين متحولة متماثلة اللواقح (الشكل 2A). لوطييمكن تحديد خلايا متحولة zygous لأنها تعبير عن بروتين فلوري فقط الأخضر (GFP)، في حين أن النوع البري المحيطة والخلايا متخالف التعبير عن كل من tdTomato وGFP (أرقام 2B وباء ").

2. ذبابة الفاكهة لإعداد التصور مبصرة

لتصور العلاقات العامة بواسطة تقنية تحييد القرنية، لشل حركة الذباب على لوحات الاغاروز.

  1. إعداد زجاجة غسل مملوءة بالماء المقطر 4 ° C ووضعه على الجليد.
  2. حل الاغاروز العادية في الماء (1.2-1.5٪ الاغاروز في 100 مل من الماء) عن طريق التسخين في الميكروويف. وضع القارورة في حمام مائي عند 55 درجة مئوية، والسماح للالاغاروز حل لتبرد إلى درجة الحرارة هذه. الحفاظ على الاغاروز في 55 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. تخدير الذباب مع CO 2 لمدة 1 دقيقة على الأقل.
  4. صب الحل الاغاروز الدافئة (في 55 ° C) في طبق بتري (35 × 10 مم، 1.37 س 0.39 في) ووضع immediately للتخدير ذبابة الفاكهة على الاغاروز. للمبتدئين، بدءا من 10 الذباب في طبق بتري هو معقول. ويمكن أيضا أن أكبر طبق بتري (60 × 15 مم، 2.362 س 0.59 في) يمكن استخدامها.
  5. تحت المجهر تشريح، توجيه ذبابة الفاكهة على جانبها مع ملقط، دفع جناح واحد في الاغاروز، مثل أن الجناح ونصف من الجسم هي جزء لا يتجزأ في الاغاروز (أرقام 3A-3A ""). عصا الجناح الآخر على سطح الاغاروز. ملاحظة: إذا لم يتم جزءا لا يتجزأ من الذباب عميقا بما فيه الكفاية في الاغاروز، سوف الطاير أن تكون حرة في التحرك رأسه أثناء التصوير من العلاقات العامة، وهذا سيؤدي في الصور غامض. كما سيتم بالانزعاج التوجه من العين. قد يكون من الصعب بإغراق ذبابة الفاكهة في الاغاروز، إما بسبب تركيز الاغاروز أو درجة حرارته. فمن الأسهل لتضمين الذباب في الاغاروز أكثر تركيزا، ولكن إذا يتركز الاغاروز جدا، قد تغرق الطاير. إذا كان الاغاروز هو بارد جدا، قد يكون ديfficult لتضمين الطاير، ولكن درجة الحرارة مرتفعة جدا قد يؤدي إلى تلف القرنية.
  6. وضع طبق بتري على الجليد والسماح للالاغاروز لترسيخ.
  7. مع ملقط، توجيه الرأس مثل التي يتعرض لها عين واحدة إلى الهدف الغمر (الشكل 3A 'و3A ""). عموما، يمكن اعتبار العين لتكون موجهة بشكل جيد تحت المجهر تشريح عندما pseudopupil (تصور على أنها بقعة سوداء) في منتصف العين. التوجه الأمثل للعين يزيد من العرض من حقل ommatidial التي تتركز المستفيدين الرئيسيين. الهدف من خطوة التوجه هو إيجاد منطقة العين مع أوسع مجال من المستفيدين الرئيسيين ركزت، وعادة في وسط العين. هذه الخطوة مفيد أيضا لإزالة أي الساقين أو aristae تغطي العين ومنع التصور لها.
  8. تغطية الطاير مع الماء المثلج وترك طبق بيتري على الجليد حتى التصور. الماء المثلج تحافظ على الذباب تخدير.

3. تصورمبصرات تحت المجهر

لتصور من المستفيدين الرئيسيين من خلال القرنية، يستخدم هذا البروتوكول المجهر تستقيم مجهزة الهدف المياه مع العمل الطويلة المسافة (W N-Achroplan 40X/0.75).

  1. وضع طبق بتري مغطاة الماء المثلج على شريحة زجاجية على المسرح المجهر (أرقام 3 قبل الميلاد). ويمكن لصقها على طبق بيتري إلى الشريحة الزجاجية، مما يجعل من الممكن لنقلها عن بسلاسة مع مسامير ميكرومتر.
  2. يغرق الهدف الغمر في الماء من طبق بتري (أرقام 3B'-3C '). وضع رئيس الطاير تحت شعاع الإثارة (تبدأ مع مرشح GFP، على سبيل المثال). نقل المرحلة صعودا وهبوطا حتى يتقارب شعاع على العين. عندما العين هو في المستوى الصحيح، فإنه يميل لتعكس ضوء الإثارة.
  3. ننظر من خلال العدسة لمضان. عندما يتم وضع العين في مركز مجال الرؤية، والتركيز تحتالقرنية لتصور المستقبلات الضوئية الفلورسنت.

ملاحظة 1: عند النظر من خلال العدسة، قد يكون غير مستقر لتمييز أجزاء الجسم من ذبابة، وخاصة الجزء الأعلى من البطن والرأس، على سبيل المثال. في مثل هذه الحالات، يجب أن ننظر مباشرة في مرحلة لإعادة ذبابة الفاكهة.

ملاحظة 2: الكلاسيكية أو مضان المجهري متحد البؤر يمكن استخدامها. المجهري متحد البؤر يعطي الصور مع الخلفية أقل وأوسع مجال المستفيدين الرئيسيين تركيزا من المجهري الكلاسيكية. مثال انشاء هو LSM510 متحد البؤر المجهر (زايس) مع الهدف 40X المياه. ويمكن الحصول على نتائج أفضل من خلال فتح الثقب المجهر متحد البؤر أوسع من عادة يستحب للموضوعية. على سبيل المثال، استخدم قيمة 204 بدلا من الافتراضي 98 لفتحة الثقب.

ملاحظة 3: مستويات أعلى من ث + تصبغ في العين لحد من مضان الخلفية. 4. الوقت بالطبع التصور من خلايا مستقبلة للضوء

مطلوب الحذر عند التالية مصير من PR الفردية داخل نفس العين على مدى فترة من الزمن.

  1. خفض درجة حرارة الاغاروز إلى 45 درجة مئوية، والبقاء على قيد الحياة لتعظيم ذبابة الفاكهة. الاغاروز يتصلب بسرعة كبيرة في درجة الحرارة هذه. ذبابة الفاكهة واحدة فقط ينبغي أن تستخدم في طبق بتري، لضمان أن الذباب لا اختلطت خلال الملاحظات.
  2. وضع منهجية الذباب على نفس الجانب، للعرض من نفس العين. ويمكن تحقيق هذا عن طريق اتخاذ ذبابة تخدير من قنينة من خلال جناح واحد ووضع ذبابة الفاكهة على الاغاروز. توجيه دائما العين بنفس الطريقة إن أمكن، مما يجعل من السهل العثور على استنساخ العلاقات العامة التي تم عرضها من قبل.
  3. التعرف على الحيوانات المستنسخة على أساس شكلها تحت المجهر متحد البؤر. وغالبا ما تقع في مجال الرؤية بجانب نسخة من الفائدة. في سوالفصل الحالات، ينبغي إعادة توجيه العين تحت الماء، إلى مركز مجال الرؤية على نسخة من الفائدة، على أساس قطبية العين (الشكل 4).

5. يتعافى بعد التصور الذباب

  1. إزالة المياه من طبق بيتري.
  2. بلطف سحب ذبابة الفاكهة من الاغاروز بالملقط.
  3. تجفيف ذبابة الفاكهة على الأنسجة.
  4. العودة ذبابة الفاكهة إلى قارورة، وضمان أن لا تتعثر في الطعام. يسمح الطاير أن تأتي الجولة في 25 درجة مئوية.

Representative Results

طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT يمكن استخدامها لدراسة تأثير طفرة أو التعبير خارج الرحم على التنمية والبقاء على قيد الحياة من المستفيدين الرئيسيين في شبكية العين ذبابة الفاكهة. هو سريع، مما يجعلها مثالية لأغراض الفحص، كما أظهرت مؤخرا 20. وجود المستفيدين الرئيسيين متحولة بجانب البرية من نوع المستفيدين الرئيسيين في نفس العين يجعل من السهل للكشف عن العيوب المرتبطة المستفيدين الرئيسيين ومتحولة لمعالجة قضية الحكم الذاتي الخلية.

العيوب التنموية لوحظ في تحليلنا تتأثر العمليات المختلفة، بما في ذلك التوظيف والعلاقات العامة، والتشكل قطبية الخلية مستو (PCP) إنشاء (الشكل 5). سبعة غيابيا مطلوب للتجنيد والعلاقات العامة، وخاصة بالنسبة R7 واحدة من العلاقات العامة الداخلية. وتشارك فقدان سبعة في نتائج غيابيا في فقدان العلاقات العامة الداخلية وبعض المستفيدين الرئيسيين الخارجي (الشكل 5A). رئيس محبب (GRH) في إنشاء PCP وبعض ommatidia هي الجردerted في GRH استنساخ متحولة (الشكل 5B). هذا الأسلوب يجعل من الممكن لتحديد المستفيدين الرئيسيين متحولة في ommatidia الفسيفساء، وتسهيل تحديد المستفيدين الرئيسيين التي تتطلب الجينات لاقتناء الصحيح من PCP. أظهرنا مطلوب أن GRH لاقتناء الصحيح من PCP في السلائف R3 20. في الواقع، لاحظنا أنه في ommatidia مقلوب، كان R4، والتي تنبع بشكل غير طبيعي من السلائف R3، ودائما متحولة. الفتات (Crbs) هو بروتين الغشاء القمي المطلوبة للالتشكل rhabdomere 23. فقدان Crbs في Crbs 11A22 النتائج متحولة في عدم انتظام، أكبر أو أصغر المستفيدين الرئيسيين (الشكل 5C).

ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لمتابعة مصير المستفيدين الرئيسيين واحدة خلال مرحلة البلوغ (الشكل 6). فهي مثالية للدراسات تنكس عصبي، لأن مجموعة من المستفيدين الرئيسيين متحولة متماثلة اللواقح يمكن الاطلاع ونفس المجموعة يمكن العثور عليها في نفس العين للنفس تطير على مدى أيام أو أسابيع. وبالتالي فإنه من الممكن تحديد المستفيدين الرئيسيين البقاء على قيد الحياة والذي محكوم للموت، لأن كل استنساخ له شكل فريد من نوعه ويمكن التعرف عندما يتم وضع العين تحت المجهر مضان. كما هو الاستقطاب شبكية العين، فمن الممكن لتوجيه شبكية العين للعثور على نفس استنساخ مرة أخرى، على أساس شكله. استخدمنا هذه الطريقة لإظهار أن fatp k10307 طفرة يدفع الضمور التدريجي للعلاقات العامة في مرحلة البلوغ (الشكل 6، 24). ويمكن أيضا أن هذا الأسلوب التصور أن تستخدم لتحليل الحكم الذاتي الخلية. في fatp k10307 الشبكية الفسيفساء، كان مقتصرا فقدان العلاقات العامة لfatp المستفيدين الرئيسيين متحولة، والمستفيدين الرئيسيين من نوع البرية كونها تتأثر. شرط fatp للبقاء العلاقات العامة هي الخلية بالتالي الحكم الذاتي. كنا أيضا قادرة على إنقاذ العلاقات العامة متحولة fatp بواسطة reexpressing البرية من نوع fatp مع سائق RH1-GAL4 وبناء UAS-fatp (الشكل 7). الإمكانية إجراء مثل هذه التجارب الانقاذ هي واحدة من مزايا طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT على تحليل نسيلي على أساس المقاطع النسيجية للجزءا لا يتجزأ من الراتنج شبكية العين. في الواقع، لا يتأثر الكشف النسيلي مع أسلوب الطماطم / GFP-FLP / FRT عن طريق استخدام P (UAS، ث +) يبني المعدلة وراثيا، في حين أن تصبغ أحمر المرتبطة الجينات صغيرة بيضاء (ث +) يغطي العين مع صباغ أحمر ، اخفاء استنساخ الفسيفساء في المقاطع النسيجية.

الشكل 1
الشكل 1. تنظيم العين ذبابة الفاكهة. (أ) صورة لذبابة الفاكهة العين التي اتخذت مع stereomicroscope. وتتكون العين ذبابة الفاكهة حوالي 800 ommatidia. (B) رسم تخطيطي لحقل من 64 ommatidia في منتصف العين. ستة الخلايا العصبية مستقبلة للضوء الخارجي (PRS) كل مقيلة،يبدى في اللون الأخضر، يتم تنظيمها في شبه منحرف النمطية يشير إلى أقرب أقطاب العين. يشيرون بالتالي في اتجاهين متعاكسين في بطني والجزء الظهري من العين وتكون صورة طبق الأصل وفقا للحدود بين شطري، وهو ما يسمى خط الاستواء. (C) رسم تخطيطي لمقيلة. كل مقيلة يحتوي على ثمانية المستفيدين الرئيسيين. المستفيدين الرئيسيين R1 إلى R6، كما هو موضح باللون الأخضر، هي المستفيدين الرئيسيين الخارجي. أنها تعبر عن جزيء rhodopsin1 حساس (RH1) وهي ما يعادل خلايا قضيب الثدييات. يتم عرض المستفيدين الرئيسيين الداخلية، R7 R8 و، في الرمادي (R7 يجلس على رأس R8). استراتيجية الحد من الفقر الداخلي تعبير عن رودوبسين 3، 4، 5 أو 6 وهي ما يعادل الخلايا المخروطية الثدييات. للبساطة، فقط rhabdomere، الجزء الحساسة للضوء من العلاقات العامة، ويظهر لكل العلاقات العامة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2. توليد وتصور استنساخ الفسيفساء العلاقات العامة في العين ذبابة الفاكهة مع أسلوب الطماطم / GFP-FLP / FRT. (أ) رسم تخطيطي لجيل من الحيوانات المستنسخة الفسيفساء في طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT. يتم إنشاء استنساخ الفسيفساء من قبل إعادة التركيب الإنقسامية، وذلك بسبب التعبير عن flipase (تحت سيطرة المروج بلا عيون) أثناء تطوير العين وتسلسل FRT. بعد إعادة التركيب من تسلسل FRT وانقسام الخلايا، متحولة متماثلة اللواقح، متماثلة اللواقح من النوع البري والخلايا متخالف يمكن أن تتولد من خلية متخالف. هذه انقسام الخلايا مرة أخرى لتشكيل استنساخ الفسيفساء من المستفيدين الرئيسيين في العين الكبار. ومما يسهل تحديد خلايا متحولة عن طريق إدراج بناء معربا عن أحمر فلوري البروتين tdTomato في الكروموسوم من نوع البرية، لتسمية من نوع البرية والخلايا متخالف. (B-B'') تصور استنساخ الفسيفساء مع PR رطريقة انه الطماطم / GFP-FLP / FRT. طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT يجمع بين إعادة التركيب الإنقسامية، القرنية تحييد ومتحد البؤر المجهري. جميع المستفيدين الرئيسيين تعبر عن الفلورية الخضراء GFP البروتين، والتي تسهل التصور من المستفيدين الرئيسيين باستخدام تحييد القرنية ومتحد البؤر المجهري (B). يمكن تصور المستفيدين الرئيسيين على مستوى خلية واحدة. يتم إنشاء استنساخ الفسيفساء متحولة عن طريق إعادة التركيب الإنقسامية ويمكن تحديدها من خلال غياب أحمر فلوري tdTomato البروتين (B '). بالتالي، على الصور المدمجة، تظهر المستفيدين الرئيسيين متماثل باللون الأخضر، في حين أن النوع البري ومتخالف المستفيدين الرئيسيين الأصفر (B''). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 3
الرقم 3. إعداد ذبابة الفاكهة لvisualizatايون من خلال القرنية التعادل. (A-A'''') صور من ذبابة الفاكهة يجمد على طبق من ذهب مملوءة الاغاروز. في لوحة A''''، وقد تم قطع قطعة من الاغاروز التي تحتوي على الطاير لالتقاط صورة الملف الشخصي. مضمن نصف ذبابة الفاكهة في الاغاروز، مع الجناح اليميني داخل الاغاروز والجناح الأيسر عالقة على سطح الاغاروز (A، A''،'''' A). عندما يتم تضمين ذبابة الفاكهة في الاغاروز، يتم وضع رأسه في كثير من الأحيان سيئة لتصور من العين (A، A '). ولذلك يجب reorientated الرأس مع ملقط بحيث منتصف العين ومشيرا صعودا (A''، A'' '). (B-B') رسم تخطيطي يظهر ذبابة الفاكهة يجمد على صفيحة الاغاروز وتحديد المواقع لل ذبابة الفاكهة في إطار الهدف من المجهر. (C-C ') صور للوضع ذبابة الفاكهة على مرحلة من مراحلالمجهر تحت هدفه. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 4
الشكل 4. التوجه من العين لتحليل الوقت بالطبع. ويوضح الشكل صورا لرئيس ذبابة الفاكهة في اثنين من التوجهات المختلفة والحقول المقابلة من ommatidia عرضها من قبل القرنية تحييد، ممثلة على النحو المخططات التخطيطي. (A) خلال الملاحظة الأولى، يتم وضع العين بحيث استنساخ من متخالف أو البرية من نوع المستفيدين الرئيسيين (باللون الأصفر) وينظر في منتصف الميدان، على مستوى خط الاستواء (خط أحمر). (B) خلال الملاحظة الثانية، والعين غالبا ما لا يكون في بالضبط نفس التوجه. وبالتالي، فإن نفس المجموعة من المستفيدين الرئيسيين يمكن العثور مرة أخرى، ولكن ليس من الممكن لعرضبالضبط نفس المجال (على اليسار). يجب توجيه العين للنفس المجال ليتم عرضه مرة أخرى. الموقف من خط الاستواء يمكن استخدامها كدليل. في هذا المثال، ونحن نعلم أن حقل الملحوظ هو بطني جدا ولذلك يجب أن تتحول العين البطني لوضع خط الاستواء في وسط الميدان لوحظ مرة أخرى، كما في الملاحظة الأولى.

الرقم 5
الرقم 5. أمثلة من العيوب التنمية PR الكشف عنها بواسطة طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT. (أ) التصور من الفسيفساء سينا [BG02648] المستفيدين الرئيسيين متحولة، والتي تبين فقدان المستفيدين الرئيسيين الداخلية. في ommatidia متحولة، تتجمع المستفيدين الرئيسيين الخارجي معا نظرا لغياب العلاقات العامة R7 الداخلية. في الواقع، ومن المعروف أن سينا المطلوبة لتوظيف العلاقات العامة الداخلية. (B) تصور GRH فسيفساء [s2140] المستفيدين الرئيسيين متحولة تظهر العيوب قطبية. الفسيفساء متحولة ommatidia، SURRounded من قبل الدائرة، وتشير في الاتجاه المعاكس من النوع البري ommatidia، مما يشير إلى انعكاس ظهراني البطني. وأظهرت دراسة مفصلة مع أسلوب الطماطم / GFP-FLP / FRT أن GRH كان مطلوبا في السلائف R3 لاقتناء الصحيح من مقيلة قطبية 20. (C) التصور من الفسيفساء CRB [j1B5] المستفيدين الرئيسيين متحولة، والتي تبين مشوه المستفيدين الرئيسيين متحولة متماثلة اللواقح. ومن المعروف أن CRB المطلوبة لrhabdomere التشكل.

الرقم 6
الرقم 6. تحليل الوقت أثناء fatp فسيفساء [k10307] المستفيدين الرئيسيين متحولة مع أسلوب الطماطم / GFP-FLP / FRT، على مدى 14 يوما. A fatp فسيفساء [k10307] لوحظ الشبكية متحولة في يوم 1 (A، A ')، يوم 4 ( B، B ')، يوم 8 (C، C') ويوم 14 (D، D ') بعد الفقس. يمكن نفس المجموعة من المستفيدين الرئيسيين الفسيفساء يكون founد في كل نقطة زمنية، في مجال الملاحظة (المستطيل الأبيض، A، B، C، D). في هذا المجال من المستفيدين الرئيسيين (A '، B'، C '، D')، وصفت المستفيدين الرئيسيين متحولة متماثل باللون الأخضر، في حين وصفت المستفيدين الرئيسيين من النوع البري متخالف ومتماثل باللون الأصفر. من يوم 4 (B ') فصاعدا، والمستفيدين الرئيسيين متحولة متماثلة اللواقح تبدأ بالزوال، مشيرا إلى أن fatp [k10307] يدفع طفرة انحطاط التدريجي لهذه المستفيدين الرئيسيين. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 7
الرقم 7. إنقاذ fatp [k10307] المستفيدين الرئيسيين متحولة مع تحمل صغيرة بيضاء، معربا عن بناء fatp. وتصور استراتيجية الحد من الفقر الفسيفساء مع أسلوب الطماطم / GFP-FLP / FRT في الذباب منذ 15 يوما. (A) التصور السيطرة الفسيفساء المستفيدين الرئيسيين. (B) Visualization من الفسيفساء fatp المستفيدين الرئيسيين متحولة، والتي تبين فقدان المستفيدين الرئيسيين متحولة. (C) التصور من الفسيفساء fatp المستفيدين الرئيسيين متحولة في ذبابة reexpressing fatp في مجال العلاقات العامة الخارجي (RH1> fatp). وأنقذت المستفيدين الرئيسيين متحولة. وجود الجينات صغيرة بيضاء وما يرتبط بها من تصبغ العين الحمراء في RH1> الظروف fatp لا يغير الطماطم أو مضان GFP أو الكشف النسيلي.

Discussion

وقد استخدم على نطاق واسع العين ذبابة الفاكهة فك مسارات إشارات تنظيم التنمية، وانتشار والبقاء على قيد الحياة. في 1990s في وقت مبكر، ونفذت عددا كبيرا من شاشات الوراثية إلى تحديد مسارات المطلوبة خلال المراحل الأولية لتطوير العلاقات العامة 25-27. تم زيادة كفاءة شاشات الوراثية إلى حد كبير بواسطة تقنية إعادة التركيب الإنقسامية، مما يجعل من الممكن لاختبار الخسارة من وظيفة الطفرات في استنساخ الفسيفساء 21. وبالتالي، يمكن اختبار دور الطفرات المميتة بشكل منهجي الجنينية في الحيوانات المستنسخة متحولة متماثلة اللواقح في أعين الذباب التي كانت متخالف خلاف ذلك. وقد ركزت معظم العروض الفسيفساء على توظيف العلاقات العامة في وقت مبكر، والتمايز، والإسقاط محور عصبي أو التشكل يحدث في اليرقات النامية أو الشرانق 10،25-31. حتى الآن، حققت الشاشة الفسيفساء واحد فقط آليات تنظيم وظيفة العلاقات العامة الكبار، من خلال رصد استجابة بصرية عبر electroretinogram تسجيلات 32. مع أسلوب الطماطم / GFP-FLP / FRT وإمكانية إجراء تحليل بالطبع الوقت في الحيوانات الحية متحولة، قمنا بتصميم طريقة جديدة لتحديد العوامل التي تنظم بقاء PR الكبار وتعمل 20،24.

طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT ديها العديد من المزايا الرئيسية خلال باجتزاء النسيجي الكلاسيكية للعيون جزءا لا يتجزأ من الراتنج. أولا، هذا الأسلوب هو أسرع بكثير وأرخص وأسهل لأداء من الطريقة النسيجية، شريطة أن المجهر مضان مجهزة الهدف غمس المياه المناسبة متاحة (انظر الجدول من الكواشف والمعدات). الثانية، وطريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع التحوير التعبير، مثل التعبير عن P (UAS، ث +)، والتي تحمل التحوير المصغرة الأبيض. وعلى النقيض من المقاطع النسيجية، والذي يستخدم للكشف عن + ث النسيلي، في النظام الطماطم / GFP-FLP / FRT، P (UAS، ث +) لا تتداخل مع د النسيليetection يعتمد على الطماطم بروتين فلوري. باستخدام P (UAS-fatp، ث +) الذباب المعدلة وراثيا، وكنا قادرين على تصور الانقاذ من المستفيدين الرئيسيين متحولة fatp (الشكل 7). الثالث، وهو شرك الرئيسية لجميع أنواع التحليل نسيلي، بما في ذلك على أساس الطماطم / GFP-FLP / FRT، هو غموض الوراثي من المستفيدين الرئيسيين المفقودة. في الواقع، قد يكون من غير الواضح ما إذا كانت العلاقات العامة غائبة بسبب عدم وجود وظيفة جين معين أو بسبب خلية تأثير غير المتمتعة بالحكم الذاتي، ولا سيما على الحدود من استنساخ متحولة. يحصل على طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT تغلب على هذه المشكلة عن انحطاط من قبل مما يجعل من الممكن لمتابعة من النوع البري ومتحولة المستفيدين الرئيسيين في نفس الحيوان على مدى فترات من عدة أسابيع. كنا قادرين على متابعة مصير المستفيدين الرئيسيين الفردية الحركية يحلل على مختلف fatp الذباب متحولة (الشكل 6). ويمكن التعرف على استنساخ نفسه في حيوان معين في أوقات مختلفة، وذلك بسبب الشكل الدقيق للاستنساخ المحيطة من النوع البري. كنا قادرين على إظهار لا لبس فيهالاي أن جميع المستفيدين الرئيسيين المفقودة كانت متحولة لfatp، مشيرا إلى أن دور المسوخ fatp في المستفيدين الرئيسيين هو خلية مستقلة. وبالتالي، من خلال رصد فقدان المستفيدين الرئيسيين في التحليل الحركي، فمن الممكن لتحديد النمط الجيني من المستفيدين الرئيسيين في نماذج من انحطاط أخلاقي الحدوث. أخيرا، أثبتت طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT قوية جدا لتحديد العوامل التي تنظم إنشاء PCP 20. إمكانية تسجيله عددا كبيرا من ommatidia فسيفساء النمط الظاهري لقطبية دون الحاجة إلى أقسام، يسهل تحديد السريع لمتطلبات العلاقات العامة لإنشاء PCP. ومع ذلك، فإن تحليل أكثر دقة للوحدة العلاقات العامة تتطلب باجتزاء التقليدية تليها المرحلة على النقيض أو microscopies الإلكترونية.

في الختام، يفتح طريقة الطماطم / GFP-FLP / FRT آفاقا جديدة لكفاءة الفحص فسيفساء لتحديد العوامل التي تنظم العمليات التنموية والعلاقات العامة وظائف العلاقات العامة الكبار، مثل فيمااستجابة السياقية وقدرتها على البقاء.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

PLATIM وDroso-أدوات مرافق UMS3444 العلوم البيولوجية، ليون، فرنسا. وأيد البحوث BM من خلال المنح المقدمة من مؤسسة بحوث ميديكال لا تصب من CNRS (ATIP) وANR-12-BSV1-0019-01. وأيد PD بواسطة الشبكية فرنسا الجمعيات ومدرسة المعلمين العليا في ليون (فرنسا). وأيد CL من قبل لوس انجليس الدوري الفرنسي الوطني للسرطان مناهضة لو الجمعيات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent
Agarose Euromedex D5-E Regular agarose is used to immobilize the flies
Petri dish BD Falcon 353001 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch
Cold-ice water To maintain the flies anesthetized
  Equipment
Dissecting microscope Dutcher SMZ645  
Water Bath Julabo 9550102 To keep the agarose solution at warm temperature
40X Water objective Zeiss 420967-9900-000 Water dipping objective for the confocal microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardie, R. C. Sensory physiology 5. Ottoson, D. 5, 1-79 (1985).
  2. Wolff, T., Ready, D. F. Cell death in normal and rough eye mutants of Drosophila. Development. 113, 825-839 (1991).
  3. Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
  4. Halder, G., Callaerts, P., Gehring, W. J. Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila. Science. 267, 1788-1792 (1995).
  5. Mollereau, B., Domingos, P. M. Photoreceptor differentiation in Drosophila: from immature neurons to functional photoreceptors. Dev Dyn. 232, 585-592 (2005).
  6. Mollereau, B. Cell death: what can we learn from flies? Editorial for the special review issue on Drosophila apoptosis. Apoptosis. 14, 929-934 (2009).
  7. Charlton-Perkins, M., Brown, N. L., Cook, T. A. The lens in focus: a comparison of lens development in Drosophila and vertebrates. Mol Genet Genomics. 286, 189-213 (2011).
  8. Jenny, A. Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye. Curr Top Dev Biol. 93, 189-227 (2010).
  9. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35, 356-363 (2012).
  10. Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59 (2005).
  11. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium. Dev Biol. 120, 366-376 (1987).
  12. Mendes, C. S., et al. ER stress protects from retinal degeneration. Embo J. 28, 1296-1307 (2009).
  13. Jenny, A. Preparation of adult Drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis. J Vis Exp. , (2011).
  14. Mollereau, B., et al. Two-step process for photoreceptor formation in Drosophila. Nature. 412, 911-913 (2001).
  15. Domingos, P. M., et al. Spalt transcription factors are required for R3/R4 specification and establishment of planar cell polarity in the Drosophila eye. Development. 131, 5695-5702 (2004).
  16. Mendes, C. S., et al. Cytochrome c-d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO Rep. 7, 933-939 (2006).
  17. Domingos, P. M., et al. Regulation of R7 and R8 differentiation by the spalt genes. Dev Biol. 273, 121-133 (2004).
  18. Mollereau, B., et al. A green fluorescent protein enhancer trap screen in Drosophila photoreceptor cells. Mech Dev. 93, 151-160 (2000).
  19. Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128, 815-826 (2001).
  20. Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-134 (2011).
  21. Golic, K. G. Site-specific recombination between homologous chromosomes in Drosophila. Science. 252, 958-961 (1991).
  22. Porter, J. A., Hicks, J. L., Williams, D. S., Montell, C. Differential localizations of and requirements for the two Drosophila ninaC kinase/myosins in photoreceptor cells. J Cell Biol. 116, 683-693 (1992).
  23. Johnson, K., Grawe, F., Grzeschik, N., Knust, E. Drosophila crumbs is required to inhibit light-induced photoreceptor degeneration. Curr Biol. 12, 1675-1680 (2002).
  24. Dourlen, P., et al. Drosophila fatty acid transport protein regulates rhodopsin-1 metabolism and is required for photoreceptor neuron survival. PLoS Genet. 8, e1002833 (2012).
  25. Mlodzik, M., Hiromi, Y., Weber, U., Goodman, C. S., Rubin, G. M. The Drosophila seven-up gene, a member of the steroid receptor gene superfamily, controls photoreceptor cell fates. Cell. 60, 211-224 (1990).
  26. Gaul, U., Chang, H., Choi, T., Karim, F., Rubin, G. M. Identification of ras targets using a genetic approach. Ciba Found Symp. 176, 85-92 (1993).
  27. Wassarman, D. A., Therrien, M., Rubin, G. M. The Ras signaling pathway in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 5, 44-50 (1995).
  28. Janody, F., et al. A mosaic genetic screen reveals distinct roles for trithorax and polycomb group genes in Drosophila eye development. Genetics. 166, 187-200 (2004).
  29. Legent, K., Steinhauer, J., Richard, M., Treisman, J. E. A screen for X-linked mutations affecting Drosophila photoreceptor differentiation identifies Casein kinase 1alpha as an essential negative regulator of wingless signaling. Genetics. 190, 601-616 (2012).
  30. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
  31. Berger, J., et al. Systematic identification of genes that regulate neuronal wiring in the Drosophila visual system. PLoS Genet. 4, e1000085 (2008).
  32. Bayat, V., et al. Mutations in the mitochondrial methionyl-tRNA synthetase cause a neurodegenerative phenotype in flies and a recessive ataxia (ARSAL) in humans. PLoS Biol. 10, e1001288 (2012).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 79، العين، خلايا مستقبلة للضوء، الجينات والتنموية، الخلايا العصبية، والتصور، انحطاط، والتنمية، والتصوير الحية،
والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dourlen, P., Levet, C., Mejat, A.,… More

Dourlen, P., Levet, C., Mejat, A., Gambis, A., Mollereau, B. The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells. J. Vis. Exp. (79), e50610, doi:10.3791/50610 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter