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Biology

मोजाइक सेक्स का लाइव इमेजिंग के लिए टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि Published: September 20, 2013 doi: 10.3791/50610
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Laboratory of Molecular Biology of the Cell, Ecole Normale Supérieure de Lyon, 2INSERM U744, Institut Pasteur de Lille, Université Lille-Nord de France, 3Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of Apoptosis and Cancer, The Rockefeller University

Summary

टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि ड्रोसोफिला में रहने वाले मोज़ेक फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं visualizing शामिल है. यह कई दिनों या हफ्तों के लिए रेटिना में व्यक्तिगत फोटोरिसेप्टर सेल भाग्य का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि रेटिना अध: पतन और neurodegenerative रोगों या फोटोरिसेप्टर सेल के विकास के अध्ययन के लिए आदर्श है.

Abstract

ड्रोसोफिला आँख व्यापक रूप से विकास और neuronal अध: पतन के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है. शक्तिशाली mitotic पुनर्संयोजन तकनीक के साथ, प्रतिरूप विश्लेषण पर आधारित सुरुचिपूर्ण आनुवंशिक स्क्रीन आँख विकास और लार्वा चरणों में फोटोरिसेप्टर (पीआर) भेदभाव में शामिल संकेत दे रास्ते की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है. हम यहाँ वयस्क ड्रोसोफिला रहने वाले की आंख में तेजी प्रतिरूप विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि का वर्णन है. फ्लोरिसेंट फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं flipase की मध्यस्थता पुनर्संयोजन द्वारा उत्पन्न मोज़ेक क्लोन के साथ रेटिना पर, कॉर्निया निराकरण तकनीक के साथ imaged हैं. इस विधि रेटिना के शास्त्रीय ऊतकीय सेक्शनिंग पर कई प्रमुख फायदे हैं: यह उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और पीआर अस्तित्व और समारोह को विनियमित करने वाले कारकों की पहचान करने के लिए एक प्रभावी तरीका साबित कर दिया है. यह वही रहने anim में पीआर अध: पतन की गतिज विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैअल कई सप्ताहों में, वयस्क मक्खी में पीआर अस्तित्व या समारोह के लिए विशेष जीन के लिए आवश्यकता प्रदर्शित करने के लिए. इस विधि को भी इस तरह के तलीय सेल polarity की स्थापना प्रभावित है, जिसमें उन लोगों के रूप में विकास म्यूटेंट, में सेल स्वायत्तता मुद्दों को संबोधित करने के लिए उपयोगी है.

Introduction

ड्रोसोफिला रेटिना polarity के एक स्पष्ट रूप से परिभाषित अक्ष (चित्रा 1 बी) के साथ ठीक आयोजित कर रहे हैं जो लगभग 800 ommatidial इकाइयों (चित्रा 1 ए), से बना है. आठ फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं (पीआरएस) और शंकु कोशिकाओं, वर्णक कोशिकाओं और कोशिकाओं 1,2 बाल खड़े सहित 12 सहायक कोशिकाओं,: प्रत्येक इकाई में 20 कक्ष हैं. पीआर के दो वर्गों वे व्यक्त rhodopsin के प्रकार (आरएच) के आधार पर प्रतिष्ठित हैं. छह बाहरी पीआरएस (R1-6) RH1 एक्सप्रेस और एक trapezoid पैटर्न (चित्रा 1C) में व्यवस्थित कर रहे हैं. चतुर्भुज के केंद्र में, दो भीतरी पीआरएस (R7/R8) rhodopsin की चार संभव प्रकार (Rh3, RH4, Rh5 या RH6) एक्सप्रेस और R7 R8 3 के शीर्ष पर है कि इस तरह के आयोजन कर रहे हैं.

2,500 से ज्यादा जीन आँख विकास के उद्देश्यों सहित प्रक्रियाओं की एक व्यापक पैनल, के अध्ययन के लिए एक बहुत शक्तिशाली मॉडल साबित कर दिया है जो ड्रोसोफिला आँख 4, के morphogenesis में शामिल कर रहे हैंlopment, पीआर भर्ती, भेदभाव, तलीय सेल polarity, morphogenesis, अस्तित्व, apoptosis और दृश्य पारगमन 5-9.

ड्रोसोफिला आंख पर काम कर रहे शोधकर्ताओं ने कई वर्षों से, रेटिना इमेजिंग और व्यवस्थित आनुवंशिक स्क्रीन से बाहर ले जाने के लिए तकनीक विकसित की है. छवि के लिए सबसे आसान तरीका वयस्क रेटिना एक स्थिर जानवर (चित्रा 1 ए) में कॉर्निया पर लग रहा है. कॉर्निया की संरचना स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा ठीक से देखे जा सकते हैं और URCFG संघ द्वारा एक बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन में इस्तेमाल किया गया था ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. इस बार विकास या सेल व्यवहार्यता में प्रारंभिक कदम को नियंत्रित करने के जीन में उत्परिवर्तन से प्रेरित इस तरह के नेत्र खुरदरापन या चमक के रूप में कार्निया संरचना में वैश्विक morphological परिवर्तन, दृश्यमान करने के लिए एक बहुत प्रभावी तरीका है. हालांकि, कॉर्निया की वैश्विक दृश्य सु नहीं हैपीआर rhabdomere morphogenesis या वयस्क पीआर व्यवहार्यता और समारोह को विनियमित करने वाले कारकों की पहचान करने के लिए fficient. इस तरह के विश्लेषण रेटिना 11-13 की स्पर्शरेखा अर्द्ध पतली राल वर्गों के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी पर आधारित पीआर अखंडता का एक और अधिक गहन जांच की आवश्यकता होती है. इस तकनीक उत्परिवर्ती पीआरएस लाल रंग 14,15 की कमी से पहचाना जा सकता है जिसमें मोज़ेक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है.

मोजाइक उत्परिवर्ती क्लोन भी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 16,17 पर हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के संकेत की कमी के आधार पर, पोटा संबंधी या वयस्क रेटिना के पूरे माउंट dissections में देखे जा सकते हैं. इन दोनों तकनीक बहुत उपयोगी होते हैं, लेकिन दोनों श्रम और समय लेने वाली होती हैं और इसलिए बड़े पैमाने पर प्रदर्शन के लिए उपयुक्त नहीं हैं. हम और दूसरों को तेजी से जनसंपर्क का विश्लेषण करती है सुविधाजनक बनाने के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन 18,19 उत्पादन पीआरएस की इमेजिंग के लिए कॉर्निया निराकरण तकनीकों के उपयोग के लिए विकसित किया है. इस तकनीक, उत्परिवर्ती के साथक्लोन मोज़ेक वयस्क ड्रोसोफिला क्लोन में लाल (डब्ल्यू) वर्णक के autofluorescence के आधार पर पहचाना जा सकता है. हालांकि, इस विधि सेल स्वायत्तता का समाधान आवश्यक एकल कोशिका संकल्प 19 issues प्रदान नहीं करता है. हम mitotic पुनर्संयोजन 20 के साथ कॉर्निया निराकरण द्वारा फ्लोरोसेंट प्रोटीन की इमेजिंग जोड़ती है जो टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि, विकास के द्वारा इस समस्या overcame. इस विधि एकल कोशिका प्रस्ताव पर उच्च throughput, मोज़ेक क्लोन में उत्परिवर्ती पीआरएस का तेजी से और सटीक पहचान, (अनुमति देता http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). यह ड्रोसोफिला में रहने वाले हफ्तों की अवधि में व्यक्तिगत पीआरएस निम्नलिखित के लिए, गतिज विश्लेषण में इस्तेमाल के लिए उपयुक्त है. हम मोज़ेक आंखों की सरल, गतिज विश्लेषण में इसके उपयोग के लिए यहां टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि और सुझावों का वर्णन.

Protocol

1. टमाटर / GFP-FLP / FRT लाइंस साथ पार

उत्परिवर्ती क्लोन ले जाने मक्खियों की पीढ़ी एक FRT ले जाने उत्परिवर्ती लाइन और इसी टमाटर / GFP-FLP / FRT लाइन उड़ान भरने के बीच एक क्रॉस की आवश्यकता है.

इस काम FRT-recombined परिवर्तन के BruinFly संग्रह (उपभुक्त http://www.bruinfly.ucla.edu ). चार टमाटर / GFP-FLP / FRT लाइनों flipase का स्रोत (ey-FLP) और सभी बाहरी पीआरएस (RH1-Gal4 यूएएस में GFP की अभिव्यक्ति के साथ संयुक्त प्रत्येक 2 के हथियार और 3 गुणसूत्रों पर FRT RH1-tdtomatoninaC ले जाने में इस्तेमाल किया जा सकता है GFP) 20:

- 2L हाथ: लाइन # 43345, पी {RY [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, पी {RY [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, डब्ल्यू [*], पी {w [+ एम सी] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2L पी {RY [+ t7.2] = neoFRT} 40A, पी {w [+ एम सी] = यूएएस GFP-ninaC} 3

- 2R हाथ: लाइन # 43346, पी {RY [+ t7.2] = RH1-GAL4} [*] डब्ल्यू 1, पी {RY [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2,, पी {RY [+ t7.2] = neoFRT} 42D पी{W [+ एम सी] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2R, पी {w [+ एम सी] = यूएएस GFP-ninaC} 3

- 3L हाथ: लाइन # 43347, पी {RY [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, पी {RY [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, डब्ल्यू [*], पी {w [+ एम सी] = यूएएस GFP-ninaC} 2, पी {w [+ एम सी] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3L पी {RY [+ t7.2] = neoFRT} 80B/TM6B, टीबी [1]

- 3R हाथ: लाइन # 43348, पी {RY [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, पी {RY [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, डब्ल्यू [*], पी {w [+ एम सी] = यूएएस GFP-ninaC} 2, पी {RY [+ t7.2] = neoFRT} 82B पी {w [+ एम सी] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B, टीबी [1]

इन चार लाइनों ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र पर उपलब्ध हैं. वे mitotic क्लोन 21 की पीढ़ी के लिए विकासशील आंख में FLP के एक स्रोत प्रदान की. जंगली प्रकार के गुणसूत्र एक FRT अनुक्रम किया जाता है और एक RH1-tdTomato ninaC जंगली प्रकार और विषमयुग्मजी बाहरी पीआरएस के लिए एक मार्कर के रूप में, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन tdTomato एन्कोडिंग का निर्माण. इस निर्माण में, ninaC की p174 isoform की पिछले 41 अमीनो एसिड (निष्क्रियता और न ही सक्रियण न तो सी) जीन एपी थामें फ्रेम tdTomato अनुक्रम की सी टर्मिनस तक pended. P174 ninaC isoform के सी टर्मिनल पूंछ rhabdomeral प्रोटीन 22 का स्थानीयकरण और परमिट कॉर्निया निराकरण तकनीक का उपयोग कर लाल फ्लोरोसेंट पीआरएस के बेहतर रहने दृश्य के लिए जिम्मेदार है. RH1 प्रमोटर न्यूनतम 234 बीपी (-152 +82) RH1 प्रमोटर है. हरी फ्लोरोसेंट मार्कर GFP कारण RH1-Gal4 (3kb प्रमोटर) और यूएएस GFP ninaC constructs की उपस्थिति के लिए, सभी बाहरी पीआरएस द्वारा व्यक्त की है. RH1-Gal4, ey-FLP: FRT गुणसूत्र (FRT-X) और टमाटर / GFP-FLP / FRT तर्ज पर एक उत्परिवर्तन एक्स ले जाने के एक मक्खी स्टॉक के बीच क्रॉस निम्नलिखित जीनोटाइप (2L पर उत्परिवर्तन के उदाहरण) के साथ एक संतान पैदावार ; FRT40A, RH1-tdTomato ninaC / FRT40A-X, यूएएस GFP ninaC. इन मक्खियों में, homozygous उत्परिवर्ती कोशिकाओं के विकास आंख डिस्क में mitotic पुनर्संयोजन द्वारा उत्पन्न और homozygous उत्परिवर्ती पीआरएस का क्लोन (2A चित्रा) उत्पन्न करने के लिए विभाजित कर रहे हैं. होमोसेक्सुअलआसपास के जंगली प्रकार और विषमयुग्मजी कोशिकाओं tdTomato और GFP (आंकड़े 2 बी और बी ") दोनों व्यक्त जबकि वे केवल हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त क्योंकि zygous उत्परिवर्ती कोशिकाओं की पहचान की जा सकती है.

2. फोटोरिसेप्टर दृश्य के लिए ड्रोसोफिला तैयारी

कॉर्निया निराकरण तकनीक द्वारा पीआर दृश्य के लिए, agarose प्लेटों पर मक्खियों स्थिर करना.

  1. 4 डिग्री सेल्सियस आसुत जल से भरा एक धोने बोतल तैयार है और बर्फ पर जगह है.
  2. एक माइक्रोवेव में गर्म करने से पानी में नियमित agarose (पानी की 100 मिलीलीटर में 1.2-1.5% agarose) भंग. 55 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में कुप्पी प्लेस और agarose समाधान इस तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. उपयोग तक 55 डिग्री सेल्सियस पर agarose रखें.
  3. कम से कम 1 मिनट के लिए सीओ 2 के साथ मक्खियों anesthetize.
  4. एक पेट्री डिश (35 x 10 मिमी, में 1.37 X 0.39) में (55 डिग्री सेल्सियस) गर्म agarose समाधान डालो और तुरंत जगहately agarose पर ड्रोसोफिला anesthetized. शुरुआती के लिए, पेट्री डिश प्रति 10 मक्खियों की शुरुआत के साथ ही उचित है. बड़ा पेट्री डिश (60 x 15 मिमी, में 2.362 x 0.59) का भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, संदंश के साथ अपने पक्ष पर ड्रोसोफिला पूरबी agarose में एक दक्षिणपंथी धक्का, शरीर के पंख और आधा agarose (आंकड़े 3 ए -3 ए "") में एम्बेडेड रहे हैं कि इस तरह के. Agarose की सतह पर अन्य विंग रहो. नोट: मक्खियों agarose में गहरा पर्याप्त एम्बेडेड नहीं कर रहे हैं, मक्खी पीआर की इमेजिंग के दौरान अपने सिर को स्थानांतरित करने के लिए मुक्त हो जाएगा, और इस फजी छवियों में परिणाम होगा. आंख के उन्मुखीकरण भी परेशान किया जाएगा. यह कारण agarose की एकाग्रता या अपने तापमान या तो, agarose में ड्रोसोफिला डुबकी के लिए मुश्किल हो सकता है. यह अधिक ध्यान केंद्रित किया agarose में मक्खियों एम्बेड करने के लिए आसान है, लेकिन agarose भी ध्यान केंद्रित किया है, तो मक्खी डूब सकता है. Agarose भी शांत है, तो यह Di हो सकता हैमक्खी एम्बेड करने fficult, लेकिन बहुत अधिक एक तापमान कॉर्निया को नुकसान पहुंचा सकता है.
  6. बर्फ पर पेट्री डिश रखो और agarose दृढ़ करने की अनुमति देते हैं.
  7. संदंश के साथ, एक आंख विसर्जन उद्देश्य से अवगत कराया है कि इस तरह के सिर (चित्रा 3 ए 'और 3 ए "") पूरबी. आम तौर पर, एक आंख (एक काला टीका के रूप में कल्पना) pseudopupil आंख के बीच में है, जब अच्छी तरह विदारक खुर्दबीन के नीचे उन्मुख होने के लिए विचार किया जा सकता है. आंख की एक इष्टतम अभिविन्यास पीआरएस ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, जिसमें ommatidial क्षेत्र की चौड़ाई अधिकतम हो. उन्मुखीकरण कदम का उद्देश्य आमतौर पर आंख के केंद्र में, ध्यान केंद्रित पीआरएस के व्यापक क्षेत्र के साथ आंख के क्षेत्र को मिल रहा है. यह कदम भी किसी भी पैरों को हटाने के लिए या आंख को कवर और अपने दृश्य को रोकने aristae उपयोगी है.
  8. बर्फ के ठंडे पानी के साथ उड़ कवर और दृश्य तक बर्फ पर पेट्री डिश छोड़ दें. बर्फ के ठंडे पानी anesthetized मक्खियों रहता है.

3. Visualizingखुर्दबीन के नीचे photoreceptors

कॉर्निया के माध्यम से पीआरएस के दृश्य के लिए, इस प्रोटोकॉल एक लंबे समय तक काम दूरी (डब्ल्यू एन Achroplan 40X/0.75) के साथ एक पानी उद्देश्य से लैस एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है.

  1. खुर्दबीन के मंच पर एक गिलास स्लाइड पर बर्फ के ठंडे पानी के साथ कवर पेट्री डिश प्लेस (3 ईसा पूर्व के आंकड़े). पेट्री डिश यह संभव सुक्ष्ममापी शिकंजा के साथ के बारे में सुचारू रूप से इसे स्थानांतरित करने के लिए कर रही है, कांच स्लाइड से चिपके जा सकता है.
  2. पेट्री डिश (आंकड़े 3B' -3 सी ') के पानी में विसर्जन उद्देश्य डुबकी. (उदाहरण के लिए, GFP फिल्टर के साथ शुरू) उत्तेजना बीम के नीचे मक्खी के सिर की स्थिति. किरण आंख पर converges जब तक ऊपर और नीचे मंच हटो. आंख सही स्तर पर है, यह उत्तेजना प्रकाश को प्रतिबिंबित करने के लिए जाता है.
  3. प्रतिदीप्ति के लिए ऐपिस के माध्यम से देखो. आंखों को देखने के क्षेत्र के केंद्र में तैनात किया जाता है, नीचे ध्यान केंद्रितफ्लोरोसेंट फोटोरिसेप्टरों कल्पना करने के लिए कॉर्निया.

नोट 1: ऐपिस के माध्यम से देख रहे हैं, यह उदाहरण के लिए, मक्खी, विशेष रूप से पेट के बाहर का हिस्सा है और सिर के शरीर के अंगों भेद करने में असहज हो सकता है. ऐसे मामलों में, आप ड्रोसोफिला स्थान बदलने के लिए मंच पर सीधे देखना चाहिए.

नोट 2: शास्त्रीय प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी इस्तेमाल किया जा सकता है. Confocal माइक्रोस्कोपी शास्त्रीय माइक्रोस्कोपी से कम पृष्ठभूमि और ध्यान केंद्रित पीआरएस के एक व्यापक क्षेत्र के साथ छवियों को देता है. एक उदाहरण के सेट अप एक 40x पानी उद्देश्य के साथ एक LSM510 confocal खुर्दबीन (Zeiss) है. बेहतर परिणाम आम तौर पर उद्देश्य के लिए सिफारिश की है से अधिक व्यापक confocal खुर्दबीन के पिनहोल खोलने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, बल्कि पिनहोल के एपर्चर के लिए डिफ़ॉल्ट 98 से, 204 का एक मूल्य का उपयोग करें.

नोट 3: आंख के डब्ल्यू + रंजकता के उच्च स्तर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम. 4. फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के समय पाठ्यक्रम विज़ुअलाइज़ेशन

समय की अवधि में एक ही आंख के भीतर एक व्यक्ति पीआर के भाग्य का पालन जब केयर की आवश्यकता होती है.

  1. ड्रोसोफिला अस्तित्व को अधिकतम करने के लिए, 45 डिग्री सेल्सियस तक agarose के तापमान में कमी. agarose इस तापमान पर बहुत जल्दी solidifies. केवल एक ड्रोसोफिला मक्खियों टिप्पणियों के दौरान मिश्रित नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए, पेट्री डिश प्रति इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  2. योजनाबद्ध तरीके से एक ही आंख से देखने के लिए, एक ही पक्ष पर मक्खियों की स्थिति. यह एक विंग द्वारा अपने शीशी से anesthetized मक्खी लेने और agarose पर ड्रोसोफिला रखकर हासिल किया जा सकता है. हमेशा यह आसान से पहले देखा गया है कि पीआर क्लोन खोजने के लिए बना है, उसी तरह यदि संभव हो तो में आंख पूरबी.
  3. Confocal खुर्दबीन के नीचे उनके आकार के आधार पर क्लोन की पहचान. देखने के क्षेत्र अक्सर ब्याज के क्लोन के बगल में स्थित है. र मेंमामलों CH, आँख आँख के polarity (चित्रा 4) के आधार पर ब्याज का क्लोन पर देखने के क्षेत्र केंद्र के लिए, पानी के नीचे पुनर्भिविन्यासित किया जाना चाहिए.

5. विज़ुअलाइज़ेशन के बाद मक्खियों उबर

  1. पेट्री डिश से पानी निकाल दें.
  2. धीरे संदंश के साथ agarose के बाहर ड्रोसोफिला खींच.
  3. एक ऊतक पर ड्रोसोफिला सूखी.
  4. यह भोजन में अटक तो नहीं करता है, एक शीशी ड्रोसोफिला लौटें. मक्खी 25 डिग्री सेल्सियस दौर आने की अनुमति दी

Representative Results

टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि ड्रोसोफिला रेटिना में पीआरएस के विकास और अस्तित्व पर एक उत्परिवर्तन की या अस्थानिक अभिव्यक्ति के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह हाल ही में 20 के रूप में प्रदर्शन, स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए आदर्श बना रही है, तेजी से है. उत्परिवर्ती पीआरएस की उपस्थिति अगले एक ही आंख में जंगली प्रकार पीआरएस को उत्परिवर्ती पीआरएस के साथ जुड़े दोष का पता लगाने और सेल स्वायत्तता के मुद्दे के समाधान के लिए यह आसान बनाता है.

हमारे विश्लेषण में मनाया विकास दोष पीआर भर्ती, morphogenesis और तलीय सेल polarity (पीसीपी) स्थापना (चित्रा 5) सहित विभिन्न प्रक्रियाओं, प्रभावित. अनुपस्थिति में सात विशेष रूप R7 भीतरी जनसंपर्क में से एक के लिए, पीआर भर्ती के लिए आवश्यक है. भीतरी पीआर के नुकसान और कुछ बाहरी पीआरएस (चित्रा 5A) में अनुपस्थिति के परिणाम में सात की हानि. दानेदार सिर (GRH) पीसीपी स्थापना में शामिल है और कुछ ommatidia निवेश संबंधी निर्णय कर रहे हैंGRH उत्परिवर्ती क्लोन (चित्रा 5 ब) में erted. इस विधि यह संभव जीन पीसीपी की सही अधिग्रहण के लिए आवश्यक है जिसमें पीआरएस की पहचान की सुविधा, मोज़ेक ommatidia में उत्परिवर्ती पीआरएस की पहचान करने के लिए बनाता है. हम चाहते हैं कि GRH R3 व्यापारियों 20 में पीसीपी की सही अधिग्रहण के लिए आवश्यक है पता चला है. दरअसल, हम उल्टे ommatidia में, R3 अग्रदूत से असामान्य रूप से निकलती है जो R4,, हमेशा उत्परिवर्ती था, कि मनाया. टुकड़ों (Crbs) rhabdomere morphogenesis 23 के लिए आवश्यक एक शिखर झिल्ली प्रोटीन है. अनियमित, बड़े या छोटे पीआरएस (चित्रा 5C) में Crbs 11A22 उत्परिवर्ती परिणामों में Crbs की हानि.

यह विधि भी वयस्कता के दौरान एक पीआरएस के भाग्य (चित्रा 6) का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Homozygous उत्परिवर्ती पीआरएस का एक समूह देखा जा सकता है और एक ही समूह की एक ही आंख में पाया जा सकता है, क्योंकि यह neurodegeneration पढ़ाई के लिए आदर्श हैउसी दिन या सप्ताह की अवधि में उड़. प्रत्येक क्लोन आंख प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे तैनात है जब मान्यता प्राप्त किया जा सकता है कि एक अद्वितीय आकार की है, क्योंकि यह पीआरएस जीवित और मरने के लिए बर्बाद कर रहे हैं जो कि कौन कौन से इसलिए संभव है. रेटिना polarized है के रूप में, यह अपने आकार के आधार पर, फिर एक ही क्लोन खोजने के लिए रेटिना उन्मुख करने के लिए संभव है. हम fatp k10307 उत्परिवर्तन वयस्कता में प्रगतिशील पीआर अध: पतन (चित्रा 6, 24) को प्रेरित करता है कि दिखाने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया. इस दृश्य की विधि भी सेल स्वायत्तता का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Fatp k10307 मोज़ेक रेटिना में, पीआर नुकसान जंगली प्रकार पीआरएस अप्रभावित जा रहा है, उत्परिवर्ती पीआरएस fatp के लिए प्रतिबंधित किया गया था. पीआर व्यवहार्यता के लिए fatp की आवश्यकता इसलिए सेल स्वायत्त है. हम भी एक RH1-Gal4 ड्राइवर और एक यूएएस fatp निर्माण (चित्रा 7) के साथ जंगली प्रकार fatp reexpressing द्वारा fatp उत्परिवर्ती पीआर बचाव करने में सक्षम थे.इस तरह के बचाव प्रयोगों से बाहर ले जाने की संभावना राल एम्बेडेड रेटिना के ऊतकीय वर्गों पर आधारित प्रतिरूप विश्लेषण पर टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि के लाभ में से एक है. दरअसल, टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि के साथ प्रतिरूप का पता लगाने पी के उपयोग से प्रभावित नहीं है (यूएएस, w +) ट्रांसजेनिक निर्माणों, (+ W) मिनी सफेद जीन के साथ जुड़े लाल रंजकता लाल रंग के साथ आंख को शामिल किया गया है, जबकि , ऊतकीय वर्गों में मोज़ेक क्लोन मास्किंग.

चित्रा 1
चित्रा 1. ड्रोसोफिला आँख का संगठन. (ए) एक stereomicroscope के साथ लिया एक ड्रोसोफिला आँख की तस्वीर. ड्रोसोफिला आंख लगभग 800 ommatidia से बना है. आंख के बीच में 64 ommatidia के एक क्षेत्र के (बी) के योजनाबद्ध आरेख. प्रत्येक ommatidium के छह बाहरी फोटोरिसेप्टर न्यूरॉन्स (पीआरएस),हरे रंग में दिखाया गया है, आंख के पास खंभे को इंगित करता है जो एक टकसाली चतुर्भुज में व्यवस्थित होते हैं. वे फलस्वरूप भूमध्य रेखा कहा जाता है जो दो भागों के बीच सीमा के अनुसार दर्पण छवि उदर और आंख के पृष्ठीय भाग में विपरीत दिशाओं में इशारा करते हैं और कर रहे हैं. एक ommatidium (सी) योजनाबद्ध आरेख. प्रत्येक ommatidium आठ पीआरएस होता है. हरे रंग में दिखाया R6 को पीआरएस R1, बाहरी पीआरएस हैं. वे सहज अणु rhodopsin1 (RH1) एक्सप्रेस और स्तनधारी रॉड कोशिकाओं के बराबर हैं. भीतरी पीआरएस, R7 और R8, (R7 R8 के शीर्ष पर बैठता है) ग्रे में दिखाया गया. भीतरी पीआरएस rhodopsin 3, 4, 5 या 6 व्यक्त और स्तनधारी शंकु कोशिकाओं के बराबर हैं. सादगी के लिए, केवल rhabdomere, पीआर के प्रकाश के प्रति संवेदनशील हिस्से, प्रत्येक पीआर के लिए दिखाया गया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2. सृजन और टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि के साथ ड्रोसोफिला आंख में मोज़ेक पीआर क्लोन visualizing. टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि में मोज़ेक क्लोन की पीढ़ी की (ए) योजनाबद्ध आरेख. मोजाइक क्लोन कारण आंख विकास और FRT दृश्यों के दौरान (अंधा प्रमोटर के नियंत्रण के तहत) flipase की अभिव्यक्ति के लिए, mitotic पुनर्संयोजन द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. FRT अनुक्रम और कोशिका विभाजन, homozygous उत्परिवर्ती, homozygous जंगली प्रकार और विषमयुग्मजी कोशिकाओं के पुनर्संयोजन एक विषमयुग्मजी सेल से उत्पन्न हो सकती है. इन कोशिकाओं वयस्क आंख में पीआरएस की पच्चीकारी क्लोन के लिए फार्म फिर से विभाजित करते हैं. उत्परिवर्ती कोशिकाओं की पहचान जंगली प्रकार और विषमयुग्मजी कोशिकाओं लेबल जंगली प्रकार के गुणसूत्र में लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन tdTomato व्यक्त एक निर्माण डालने से मदद की है. टी के साथ मोज़ेक पीआर क्लोन (बी बी'') दृश्यवह टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि. टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि mitotic पुनर्संयोजन, कॉर्निया निराकरण और confocal माइक्रोस्कोपी को जोड़ती है. सभी पीआरएस कॉर्निया निराकरण और confocal माइक्रोस्कोपी (बी) का उपयोग पीआरएस के दृश्य की सुविधा है, जो हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP, व्यक्त करते हैं. पीआरएस एक एकल कोशिका के स्तर पर देखे जा सकते हैं. उत्परिवर्ती मोज़ेक क्लोन mitotic पुनर्संयोजन द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन tdTomato (बी ') के अभाव से पहचाना जा सकता है. जंगली प्रकार और विषमयुग्मजी पीआरएस (बी'') पीले हैं जबकि नतीजतन, मर्ज किए गए चित्र पर, समयुग्मक पीआरएस, हरे रंग में दिखाई देते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. Visualizat के लिए ड्रोसोफिला स्थापनाकॉर्निया निराकरण द्वारा आयन. Agarose से भरी थाली पर स्थिर एक ड्रोसोफिला (ए ए'''') फोटो. पैनल में'''' मक्खी युक्त agarose का एक टुकड़ा एक प्रोफ़ाइल तस्वीर लेने की कटौती की गई है. ड्रोसोफिला agarose भीतर दक्षिणपंथी साथ, agarose में आधा एम्बेडेड है और वामपंथी agarose सतह (ए, ए'', एक'''') पर अटक गया. ड्रोसोफिला agarose में एम्बेडेड है, उसके सिर अक्सर खराब आंख (ए, ए ') के दृश्य के लिए तैनात है. सिर इसलिए आंख के बीच (ए'', एक'' ') ऊपर की ओर इशारा कर रहा है कि इस तरह के संदंश के साथ reorientated किया जाना चाहिए. (बी बी) एक ड्रोसोफिला दिखा योजनाबद्ध आरेख एक agarose थाली और की स्थिति पर स्थिर माइक्रोस्कोप के उद्देश्य के तहत ड्रोसोफिला के मंच पर ड्रोसोफिला की स्थापना की. (सी सी ') फोटोअपने उद्देश्य के तहत खुर्दबीन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. समय पाठ्यक्रम के विश्लेषण के लिए आंख का उन्मुखीकरण. आंकड़ा योजनाबद्ध चित्र के रूप में प्रतिनिधित्व कॉर्निया निराकरण द्वारा देखा दो अलग झुकाव और ommatidia की इसी क्षेत्र में एक ड्रोसोफिला सिर की तस्वीरों से पता चलता है. पहली अवलोकन के दौरान (ए), आंख रखा गया है इस तरह के (पीले रंग में) विषमयुग्मजी या जंगली प्रकार पीआरएस का क्लोन भूमध्य रेखा (लाल रेखा) के स्तर पर, क्षेत्र के बीच में देखा जाता है कि. (बी) के दूसरे अवलोकन के दौरान, आंख बिल्कुल में अक्सर नहीं है एक ही उन्मुखीकरण. इस प्रकार, पीआरएस के एक ही समूह फिर से पाया जा सकता है, लेकिन यह देखने के लिए संभव नहीं है(बाईं ओर) में ठीक उसी क्षेत्र. आँख फिर से देखा जाना चाहिए एक ही क्षेत्र के लिए पुनर्भिविन्यासित किया जाना चाहिए. भूमध्य रेखा की स्थिति के लिए एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस उदाहरण में, हम मनाया क्षेत्र भी उदर और आंख इसलिए पहली टिप्पणी के रूप में, फिर से मनाया मैदान के बीच में भूमध्य रेखा के स्थान के लिए पेट के बल दिया जाना चाहिए कि वह जानते हैं.

चित्रा 5
चित्रा 5. टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि द्वारा पता लगाया पीआर विकास दोषों के उदाहरण हैं. भीतरी पीआरएस का नुकसान दिखा मोज़ेक सिना [BG02648] उत्परिवर्ती पीआरएस (ए) दृश्य,. उत्परिवर्ती ommatidia में, बाहरी पीआरएस कारण भीतरी पीआर R7 के अभाव के एक समूह है. दरअसल, सिना भीतरी पीआर भर्ती के लिए आवश्यक हो जाता है. मोज़ेक GRH (बी) दृश्य [s2140] ध्रुवता दोष दिखा उत्परिवर्ती पीआरएस. पच्चीकारी उत्परिवर्ती ommatidia, surrएक वृत्त द्वारा ounded, एक dorso-उदर उलटा संकेत है, जंगली प्रकार ommatidia से विपरीत दिशा में इशारा कर रहे हैं. टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि के साथ एक विस्तृत अध्ययन GRH ommatidium ध्रुवता 20 का सही अधिग्रहण के लिए R3 अग्रदूत में आवश्यक था कि पता चला है. मोज़ेक सीआरबी [j1B5] उत्परिवर्ती पीआरएस (सी) दृश्य, विकृत homozygous उत्परिवर्ती पीआरएस दिखा. सीआरबी rhabdomere morphogenesis के लिए आवश्यक हो जाता है.

चित्रा 6
चित्रा 6. पच्चीकारी fatp के समय पाठ्यक्रम विश्लेषण [k10307] टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि के साथ उत्परिवर्ती पीआरएस, 14 दिन से अधिक. एक मोज़ेक fatp [k10307] उत्परिवर्ती रेटिना दिन 1 (ए, ए ') को मनाया जाता है, दिन 4 ( बी, बी '), सुबह 8 (सी, सी') और अंडे सेने के बाद 14 दिन (डी, डी '). पच्चीकारी पीआरएस के एक ही समूह फाउंडेशन हो सकता हैहर समय बिंदु पर विकास, मनाया क्षेत्र में (सफेद आयत, ए, बी, सी, डी). विषमयुग्मजी और homozygous जंगली प्रकार पीआरएस पीला में चिह्नित कर रहे हैं जबकि पीआरएस (ए ',' बी ',' सी ', डी') के इस क्षेत्र में, homozygous उत्परिवर्ती पीआरएस, हरी में चिह्नित कर रहे हैं. सुबह 4 (बी) के बाद से, homozygous उत्परिवर्ती पीआरएस fatp [k10307] उत्परिवर्तन इन पीआरएस का एक प्रगतिशील अध: पतन लाती है यह दर्शाता है कि गायब शुरू. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 7
चित्रा 7. मोज़ेक नियंत्रण की एक मिनी सफेद ले जाने fatp व्यक्त निर्माण. मोज़ेक पीआरएस 15 दिन की उम्र में मक्खियों में टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि के साथ कल्पना कर रहे हैं. (ए) दृश्य के साथ fatp का बचाव [k10307] उत्परिवर्ती पीआरएस पीआरएस. (बी) वीउत्परिवर्ती पीआरएस के नुकसान पच्चीकारी की. (सी) दृश्य दिखा मोज़ेक fatp उत्परिवर्ती पीआरएस, के isualization fatp बाहरी पीआर (RH1> fatp) में एक मक्खी reexpressing fatp में उत्परिवर्ती पीआरएस. उत्परिवर्ती पीआरएस बचा लिया जाता है. एक मिनी सफेद जीन और RH1 में जुड़े लाल आँख रंजकता की उपस्थिति> fatp शर्तों टमाटर या GFP प्रतिदीप्ति या प्रतिरूप का पता लगाने में परिवर्तन नहीं करता.

Discussion

ड्रोसोफिला आँख व्यापक रूप से विकास, प्रसार और अस्तित्व को विनियमित संकेत दे रास्ते को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है. 1990 के दशक में, आनुवंशिक स्क्रीन की एक बड़ी संख्या पीआर विकास 25-27 के प्रारंभिक चरणों के दौरान आवश्यक रास्ते की पहचान करने के लिए किया जाता था. आनुवंशिक स्क्रीन की दक्षता यह संभव मोज़ेक क्लोन 21 में नुकसान के समारोह म्यूटेशनों परीक्षण करने के लिए बनाता है जो mitotic पुनर्संयोजन तकनीक, द्वारा काफी बढ़ गया था. इसलिए, भ्रूण घातक परिवर्तन की भूमिका को व्यवस्थित रूप अन्यथा विषमयुग्मजी थे कि मक्खियों की आंखों में homozygous उत्परिवर्ती क्लोन में परीक्षण किया जा सकता है. अधिकांश मोज़ेक चोकर जल्दी पीआर भर्ती, भेदभाव, axonal प्रक्षेपण या विकासशील लार्वा या pupae 10,25-31 में होने वाली morphogenesis पर ध्यान केंद्रित किया है. तिथि करने के लिए, केवल एक मोज़ेक स्क्रीन electroretin के माध्यम से दृश्य प्रतिक्रिया की निगरानी के द्वारा, वयस्क पीआर समारोह को विनियमित तंत्र की जांच की गई हैogram 32 रिकॉर्डिंग. टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि और उत्परिवर्ती रहने वाले जानवरों में समय जरूर विश्लेषण प्रदर्शन करने की संभावना के साथ, हम वयस्क पीआर व्यवहार्यता को विनियमित करने वाले कारकों की पहचान करने के लिए एक नई विधि तैयार की है और 20,24 समारोह है.

टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि राल एम्बेडेड आंखों की शास्त्रीय ऊतकीय सेक्शनिंग पर कई प्रमुख फायदे हैं. सबसे पहले, इस पद्धति बहुत तेजी से, सस्ता और ऊतकीय विधि से प्रदर्शन करने के लिए आसान, एक उपयुक्त पानी की सूई उद्देश्य से सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका देखें) उपलब्ध है बशर्ते कि है. दूसरा, टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि एक मिनी सफेद transgene ले जाने, इस तरह के (+ W यूएएस) पी की अभिव्यक्ति के रूप में, transgene अभिव्यक्ति के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. टमाटर / GFP-FLP / FRT प्रणाली, पी डब्ल्यू + प्रतिरूप का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसमें ऊतकीय वर्गों, के विपरीत (यूएएस, w +) प्रतिरूप डी के साथ हस्तक्षेप नहीं करता हैटमाटर फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर आधारित etection. पी का प्रयोग (यूएएस fatp, w +) ट्रांसजेनिक मक्खियों, हम fatp उत्परिवर्ती पीआरएस का बचाव (चित्रा 7) कल्पना करने में सक्षम थे. तीसरा, टमाटर / GFP-FLP / FRT पर आधारित, खो पीआरएस के जीनोटाइप की अस्पष्टता है कि सहित प्रतिरूप विश्लेषण के सभी प्रकार के एक प्रमुख ख़तरा. दरअसल, यह एक पीआर क्योंकि एक विशेष जीन समारोह की कमी की वजह से या विशेष रूप से उत्परिवर्ती क्लोन की सीमा पर एक सेल गैर स्वायत्त प्रभाव, के अनुपस्थित है स्पष्ट नहीं है कि हो सकता है. टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि यह संभव कई सप्ताह की अवधि में ही पशुओं में जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती पीआरएस का पालन करने बनाकर अध: पतन के लिए इस समस्या को हल हो जाता है. हम गतिज द्वारा व्यक्तिगत पीआरएस के भाग्य अलग fatp उत्परिवर्ती मक्खियों पर विश्लेषण (चित्रा 6) का पालन करने में सक्षम थे. एक ही क्लोन क्योंकि आसपास के जंगली प्रकार के क्लोन का सटीक आकार के, अलग अलग समय पर एक दिया पशु में पहचाना जा सकता है. हम स्पष्ट दिखाने के लिए सक्षम थेसभी लापता पीआरएस पीआरएस में fatp म्यूटेंट की भूमिका सेल स्वायत्त है यह दर्शाता है कि fatp के लिए उत्परिवर्ती थे कि ly. इस प्रकार, एक काइनेटिक विश्लेषण में पीआरएस के नुकसान की निगरानी के द्वारा, यह वयस्क शुरुआत अध: पतन के मॉडल में पीआरएस के जीनोटाइप निर्धारित करने के लिए संभव है. अंत में, टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि पीसीपी 20 की स्थापना को विनियमित करने वाले कारकों की पहचान के लिए बहुत शक्तिशाली साबित कर दिया है. वर्गों के लिए आवश्यकता के बिना एक ध्रुवता phenotype के लिए पच्चीकारी ommatidia की एक बड़ी संख्या में स्कोरिंग की संभावना, पीसीपी की स्थापना के लिए पीआर आवश्यकता के तेजी से दृढ़ संकल्प की सुविधा. फिर भी, पीआर अखंडता के महीन विश्लेषण चरण विपरीत या इलेक्ट्रॉनिक microscopies द्वारा पीछा पारंपरिक सेक्शनिंग की आवश्यकता होगी.

अंत में, टमाटर / GFP-FLP / FRT विधि इस तरह की तुलना के रूप में पीआर विकास की प्रक्रिया और वयस्क पीआर कार्यों को विनियमित करने वाले कारकों की पहचान करने के लिए कुशल मोज़ेक जांच के लिए नई संभावनाएं खुलतीयौन प्रतिक्रिया और व्यवहार्यता.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

फ्रांस UMS3444 बायोसाइंसेज, ल्योन की PLATIM और Droso-उपकरण की सुविधा. बी.एम. अनुसंधान Fondation से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया CNRS (ATIP) से ला Recherche médicale डालना और ANR-12-BSV1-0019-01. पीडी रेटिना फ्रांस एसोसिएशन और ल्योन के इकोले नॉर्मले Supérieure (फ्रांस) द्वारा समर्थित किया गया. सी.एल. ला लीग नेशनल contre Le कैंसर एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent
Agarose Euromedex D5-E Regular agarose is used to immobilize the flies
Petri dish BD Falcon 353001 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch
Cold-ice water To maintain the flies anesthetized
  Equipment
Dissecting microscope Dutcher SMZ645  
Water Bath Julabo 9550102 To keep the agarose solution at warm temperature
40X Water objective Zeiss 420967-9900-000 Water dipping objective for the confocal microscope

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