Summary
Tomat / GFP-FLP / FRT metoden innebærer å visualisere mosaikk fotoreseptorcellene i levende Drosophila. Den kan brukes til å følge individuelle fotoreseptor celle skjebner i netthinnen i dager eller uker. Denne metode er ideelt for studier av retinal degenerasjon og nevrodegenerative sykdommer eller fotoreseptoren celleutvikling.
Abstract
Drosophila øyet er mye brukt som en modell for studier av utvikling og nevronale degenerasjon. Med den kraftige mitotisk rekombinasjon teknikk, har elegante genetiske skjermer basert på klonal analyse førte til identifisering av signalveier involvert i øye utvikling og fotoreseptoren (PR) differensiering på larvestadiet. Vi beskriver her tomat / GFP-FLP / FRT metode, som kan brukes for hurtig klonal analyse i øyet av levende voksen Drosophila. Fluorescent fotoreseptorcellene er avbildes med hornhinnen nøytralisering teknikk, på netthinne med mosaikk kloner generert av flipase-mediert rekombinasjon. Denne metoden har flere viktige fordeler i forhold til klassiske histologisk seksjonering av netthinnen: den kan brukes for high-throughput screening, og har vist seg å være en effektiv metode for å identifisere faktorer som regulerer PR overlevelse og funksjon. Den kan brukes for kinetiske analyser av PR degenerasjon i samme levende Animal over flere uker, for å demonstrere kravet til spesifikke gener for PR overlevelse eller funksjon i voksen flue. Metoden er også nyttig for å ta opp celle autonomi problemer i utviklings mutanter, for eksempel de hvori etableringen av plane celle polaritet forandres.
Introduction
Den Drosophila retina er sammensatt av omtrent 800 ommatidial enheter (figur 1A), som er nøyaktig organisert, med et klart definert akse polaritet (figur 1B). Hver enhet inneholder 20 celler: åtte fotoreseptoren celler (PRS) og 12 tilbehørs celler, inkludert koniske celler, pigmentceller og bust celler 1,2. To klasser av PR utmerker seg på grunnlag av den type rhodopsin (Rh) de uttrykker. De seks ytre prs (R1-6) uttrykker RH1, og er anordnet i et trapes mønster (figur 1C). I sentrum av den trapes, de to indre PRS (R7/R8) uttrykker fire mulige typer rhodopsin (RH3, RH4, RH5 eller RH6) og er organisert slik at R7 ligger på toppen av R8 3..
Mer enn 2500 gener som er involvert i morfogenese av Drosophila øye 4, noe som har vist seg å være en svært kraftig modell for studier av et bredt panel av prosesser, inkludert øye utvikling, PR rekruttering, differensiering, planar celle polaritet, morphogenesis, overlevelse, apoptose og visuell transduksjon 5-9.
Forskere som arbeider på Drosophila øyet har, gjennom mange år utviklet teknikker for bildebehandling netthinnen og gjennomføre systematiske genetiske skjermer. Den enkleste måten å avbilde voksen netthinnen er å se på hornhinnen i en immobilisert dyr (figur 1A). Strukturen i hornhinnen kan visualiseres nettopp ved scanning elektronmikroskopi og ble brukt i en storstilt genetisk skjermen ved URCFG konsortium ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Dette er en svært effektiv metode for å visualisere globale morfologiske endringer i hornhinnen struktur, for eksempel øye ruhet eller glans, ofte forårsaket av mutasjoner i gener som styrer tidlige trinn i utvikling eller celle levedyktighet. Imidlertid er global visualisering av hornhinnen ikke sufficient å identifisere hvilke faktorer som regulerer PR rhabdomere morfogenese eller voksen PR levedyktighet og funksjon. Slike analyser krever en mer grundig undersøkelse av PR integritet, basert på fasekontrastmikroskopi av tangential semi-tynne harpiks deler av netthinnen 11-13. Denne teknikken er egnet for mosaikk analyser, der muterte PRS kan identifiseres av deres mangel på røde pigment 14,15.
Mosaikk mutant kloner kan også visualiseres i hel-mount disseksjoner av pupal eller voksen netthinnen, på grunnlag av deres mangel på grønt fluorescerende protein (GFP) signal på fluorescens mikros 16,17. Disse to teknikker er meget nyttig, men begge er arbeids-og tidkrevende, og er derfor ikke egnet for storskala-screening. Vi og andre har utviklet bruken av hornhinnen nøytraliseringstanker teknikker for avbildning av PRS produserer fluorescerende proteiner 18,19, for å legge til rette for rask PR-analyser. Med denne teknikken, mutantkloner kan identifiseres på grunnlag av autofluorescens av det røde (w +) pigment i mosaikk voksen Drosophila kloner. Men denne metoden ikke gir den encellede oppløsning som kreves for å ta celle autonomi utsteder 19. Vi overvant dette problemet ved å utvikle Tomato / GFP-FLP / FRT metode, som kombinerer bildebehandling av fluorescerende proteiner ved hornhinnen nøytralisering med mitotisk rekombinasjon 20. Denne metoden gjør at høy gjennomstrømning, rask og presis identifisering av muterte PRS i mosaikk kloner, på encellede oppløsning ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). Den er egnet for bruk i kinetiske analyser for å følge de enkelte PRS over en periode på uker i levende Drosophila. Vi beskriver her tomat / GFP-FLP / FRT metode og tips for bruk i enkle, kinetiske analyser av mosaikk øyne.
Protocol
En. Krysset med Tomato / GFP-FLP / FRT Lines
Den generasjonen av fluer bærer mutant klone krever én krysning mellom en FRT-bærer mutant linje og den tilsvarende tomat / GFP-FLP / FRT fluesnøre.
Dette arbeidet utnyttet BruinFly samling av FRT-saman mutasjoner ( http://www.bruinfly.ucla.edu ). Fire Tomato / GFP-FLP / FRT linjer kan brukes, bærer FRT RH1-tdtomatoninaC på hver armene på andre og tredje kromosomer kombinert med kilde flipase (ey-FLP) og uttrykk for GFP i alle ytre PRS (RH1-Gal4 UAS -GFP) 20:
- 2L arm: linje # 43345, P {ry [+ t7.2] = RH1-Gal4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ mC] = NinaE-tdTomato-ninaC} 2L P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 40A, P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 3
- 2R arm: linje # 43346, P {ry [+ t7.2] = RH1-Gal4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 42D P{W [+ mC] = NinaE-tdTomato-ninaC} 2R, P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 3
- 3L arm: linje # 43347, P {ry [+ t7.2] = RH1-Gal4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 2, P {w [+ mC] = NinaE-tdTomato-ninaC} 3L P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 80B/TM6B, Tb [1]
- 3R arm: linje # 43348, P {ry [+ t7.2] = RH1-Gal4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 2, P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 82B P {w [+ mC] = NinaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B, Tb [1]
Disse fire linjene er tilgjengelig på Bloomington Drosophila lager sentrum. De ga en kilde for FLP i den tredje øye for generering av mitotiske kloner 21. Den villtype kromosom bærer en FRT-sekvens og en RH1-tdTomato ninaC konstruere koder for røde fluorescerende protein tdTomato, som en markør for villtype-og heterozygot ytre PRS. I denne konstruksjonen, de siste 41 aminosyrer fra P174 isoformen av ninaC (hverken inaktivering eller aktivering C)-genet var apsuspendert i-ramme-til C-terminus av sekvensen tdTomato. Den C-terminale halen av P174 ninaC isoform er ansvarlig for den rhabdomeral lokaliseringen av proteinet 22 og tillater det bedre live visualisering av røde fluorescerende PRS ved hjelp av hornhinnen nøytralisering teknikk. Den RH1 arrangøren er minimal 234 bp (-152 82) RH1 promoter. Den grønne fluorescerende markør GFP er uttrykt ved alle de ytre PRS, på grunn av tilstedeværelsen av RH1-Gal4 (3KB promoter) og UAS-GFP ninaC konstruksjoner. Krysser mellom en flue lager bærer en mutasjon x på FRT kromosom (FRT-x) og tomat / GFP-FLP / FRT linjer gir et avkom med følgende genotype (eksempel på mutasjon på 2L): RH1-Gal4, ey-FLP ; FRT40A, RH1-tdTomato ninaC / FRT40A-x; UAS-GFP ninaC. I disse fluene, er homozygot mutant celler generert av mitotisk rekombinasjon i utviklings øye plate og dele for å skape en klone av homozygot mutant PRS (Figur 2A). Homozygous mutante celler kan identifiseres fordi de uttrykker bare grønt fluorescerende protein (GFP), mens den omliggende villtype og heterozygote celler uttrykker både tdTomato og GFP (figurene 2B og B ").
2. Forbereder Drosophila for Fotoreseptoren Visualisering
For PR visualisering av hornhinnen nøytralisering teknikk, immobilisere fluer på agarose plater.
- Forbered en vaskeflaske fylt med 4 ° C destillert vann og legg den på is.
- Oppløs faste agarose i vann (1,2 til 1,5% agarose i 100 ml vann) ved oppvarming i en mikrobølgeovn. Plasser flasken i et vannbad ved 55 ° C og lar agarose-løsning avkjøles til denne temperatur. Hold agarose ved 55 ° C før bruk.
- Anesthetize fluer med CO2 i minst 1 min.
- Hell den varme agarose-løsning (ved 55 ° C) inn i en petriskål (35 x 10 mm, 1,37 x 0,39 cm) og plassere umiddelbart den bedøvet Drosophila på agarose. For nybegynnere, starter med 10 fluer per petriskål er rimelig. Bigger petriskål (60 x 15 mm, 2,362 x 0,59 cm) kan også benyttes.
- Under en dissekere mikroskop, orientere Drosophila på sin side med tang, skyv den ene vingen inn i agarose, slik at vingen og halvparten av kroppen er innebygd i agarose (Tall 3A-3A ""). Hold den andre fløyen på overflaten av agarosen. Merk: Hvis fluene ikke er innebygd dypt nok i agarose, vil fly være fri til å bevege hodet sitt under avbildning av PR, og dette vil føre til uklare bilder. Orienteringen av øyet vil også bli forstyrret. Det kan være vanskelig å stupe Drosophila inn i agarose, på grunn av enten konsentrasjonen av agarose eller temperaturen. Det er lettere å bygge inn fluer i mer konsentrert agarose, men hvis agarose er for konsentrert, kan flua synke. Hvis agarose er for kjølig, kan det være difficult å bygge fly, men for høy temperatur kan skade hornhinnen.
- Sett petriskål på is og lar agarose å stivne.
- Med tang, orientere hodet slik at det ene øyet er eksponert for el objektiv (figur 3A 'og 3A ""). Vanligvis kan et øye anses å være godt orientert under disseksjonsmikroskop når pseudopupil (visualiseres som en svart flekk) er i midten av øyet. En optimal orientering av øyet maksimerer bredden på ommatidial felt der PRS er fokusert. Hensikten med retningen trinnet er å finne det område av øyet med det bredeste området fokusert PRS, vanligvis i midten av øyet. Dette trinn er også nyttig for å fjerne eventuelle ben eller aristae dekker øyet og hindre dens visualisering.
- Dekk fly med iskaldt vann og la petriskål på is inntil visualisering. Iskaldt vann holder fluene bedøvet.
Tre. VisualiseringFotoreseptorer under mikroskopet
For visualisering av PRS gjennom hornhinnen, bruker denne protokollen en oppreist mikroskop utstyrt med et objektiv vann med en lang arbeidsavstand (W N-Achroplan 40X/0.75).
- Plasser petriskål dekket med iskaldt vann på et glass lysbilde på scenen av mikroskopet (figur 3 BC). Petriskål kan limes til objektglass, noe som gjør det mulig å flytte det om jevnt med mikrometer skruer.
- Plunge nedsenking objektiv i vannet på petriskål (Tall 3B'-3C '). Plasser hodet på flua under eksitasjon bjelke (start med GFP filter, for eksempel). Beveg fasen opp og ned til bjelken konvergerer på øyet. Når øyet er på riktig nivå, er det en tendens til å reflektere eksiteringslys.
- Se gjennom okularet for fluorescens. Når øyet er posisjonert i sentrum av synsfeltet, fokus underhornhinnen for å visualisere fluorescerende fotoreseptorer.
Merknad 1: Når du ser gjennom okularet, kan det være urolig for å skille de kroppsdeler på flua, spesielt den distale del av magen og hodet, for eksempel. I slike tilfeller bør du se direkte på scenen for å flytte Drosophila.
Note 2: Klassisk fluorescens eller konfokal mikroskopi, kan anvendes. Konfokalmikroskopi gir bilder med mindre bakgrunn og et bredere felt av fokuserte PRS enn klassisk mikroskopi. Et eksempel set-up er en LSM510 confocal mikroskop (Zeiss) med en 40X vann objektiv. Bedre resultater kan oppnås ved å åpne pinhole av konfokalmikroskop bredere enn det som er anbefalt for det formål. For eksempel bruke en verdi av 204, i stedet for standard 98 for åpningen av pinhole.
Note 3: Høyere nivåer av w + pigmentering av øyet redusere bakgrunnsfluorescens. 4. Tid-retters Visualisering av fotoreseptorcellene
Care er nødvendig ved å følge skjebnen til et individ PR i samme øye i løpet av en tidsperiode.
- Reduser temperaturen av agarose til 45 ° C, for å maksimere overlevelsen Drosophila. Den agarose stivner meget hurtig ved denne temperatur. Bare én Drosophila bør brukes pr petriskål, slik at fluer ikke blir blandet sammen under observasjonene.
- Systematisk posisjonere fluene på samme side, for visning av det samme øyet. Dette kan oppnås ved å ta den bedøvede fly fra sin ampullen ved en kant og plassere Drosophila på agarose. Alltid orientere øyet på samme måte hvis det er mulig, noe som gjør det enkelt å finne PR kloner som har blitt vist før.
- Identifisere kloner på grunnlag av sin form under konfokal mikroskop. Synsfeltet er ofte plassert ved siden av klone av interesse. I such tilfeller bør øyet bli reorientert under vann, for å sentrere synsfelt på kloning av interesse, basert på polariteten av øyet (figur 4).
5. Gjenopprette Fluer etter Visualisering
- Fjern vannet fra petriskål.
- Trekk forsiktig Drosophila ut av agarose med pinsett.
- Tørk Drosophila på en vev.
- Returner Drosophila til et hetteglass, slik at det ikke setter seg fast i maten. Tillot fly for å komme rundt på 25 ° C.
Representative Results
Tomat / GFP-FLP / FRT metoden kan brukes til å studere effekten av en mutasjon eller ektopisk uttrykk på utvikling og overlevelse av PRS i Drosophila retina. Det er raskt, noe som gjør den ideell for screening formål, som nylig demonstrerte 20. Tilstedeværelsen av muterte PRs ved siden av villtype PRS i det samme øyet som gjør det lett å oppdage feil i forbindelse med mutant PRs og å ta celle autonomi problemet.
Det utviklingsmessige defekter i vår analyse påvirket av ulike prosesser, herunder PR rekruttering, morfogenese og plane celle polaritet (PCP) anlegget (figur 5). Seven i korrespondanse er nødvendig for PR rekruttering, særlig for R7 en av den indre PR. Tapet av Seven in absentia resulterer i tap av indre PR og noen ytre PRS (Figur 5A). Kornete hode (grh) er involvert i PCP etablering og noen ommatidia er inverted i GRH muterte kloner (Figur 5B). Denne metoden gjør det mulig å identifisere mutante PRS i mosaikk ommatidia, tilrettelegging for identifisering av PRS hvor genet er nødvendig for den korrekte kjøp av PCP. Vi har vist at grh er nødvendig for den korrekte kjøp av PCP i R3-forløpere 20. Faktisk ble det observert at i det inverterte ommatidia, R4, som stammer unormalt fra R3-forløperen, var alltid mutant. Crumbs (Crbs) er en apikale membran protein nødvendig for rhabdomere morphogenesis 23. Tapet av Crbs i Crbs 11A22 mutant resultater i uregelmessige, større eller mindre PRS (figur 5C).
Denne metoden kan også anvendes for å følge skjebnen til enkelt PRS i voksen alder (fig. 6). Det er ideelt for nevrodegenerasjon studier, for en gruppe av homozygote mutante PRS kan sees, og den samme gruppen kan finnes i det samme øye isamme fly over en periode på dager eller uker. Det er derfor mulig å bestemme hvilke PRs overleve og som er dømt til å dø, fordi hver klone har en unik form som kan gjenkjennes når øyet er plassert under fluorescens mikroskop. Som netthinnen er polarisert, er det mulig å orientere retina til å finne den samme klon igjen, på grunnlag av sin form. Vi brukte denne metoden for å vise at fatp k10307 mutasjon induserer progressiv PR degenerasjon i voksen alder (figur 6, 24). Denne visualiseringen metoden kan også brukes til å analysere celle autonomi. I fatp k10307 mosaikk netthinnen, ble PR tap begrenset til fatp mutant PRS, de villtype PRs være upåvirket. Kravet til fatp for PR levedyktighet er derfor celle autonomt. Vi var også i stand til å redde fatp mutant PR ved reexpressing villtype fatp med en RH1-Gal4 sjåfør og en UAS-fatp konstruere (figur 7). Denmuligheten for å gjennomføre en slik redningsforsøk er en av fordelene med tomat / GFP-FLP / FRT metode over klonal analyse basert på histologiske snitt av harpiks-embedded retina. Faktisk er klonal påvisning med tomat / GFP-FLP / FRT-metoden ikke påvirket av bruken av P (UAS, w +) transgene konstruksjoner, mens den røde pigmentering forbundet med mini-white genet (w +) dekker øyet med rødt pigment , maskering mosaikk kloner i histologiske snitt.
Figur 1. Organisering av Drosophila øyet. (A) Fotografi av en Drosophila øye tatt med et stereomikroskop. Den Drosophila øye består av omtrent 800 ommatidia. (B) Skjematisk diagram av et felt på 64 ommatidia i midten av øyet. De seks ytre fotoreseptorlidelser nevroner (PRS) av hver ommatidium,vist i grønt, er organisert i en stereotype trapes som peker til de nærmeste polene i øyet. De følgelig peker i motsatt retning i ventral og dorsal del av øyet og er speilbilde i henhold til grensen mellom de to delene, som kalles ekvator. (C) Prinsippskisse av en ommatidium. Hver ommatidium inneholder åtte PRS. PRS R1 til R6, som er vist i grønt, er de ytre PRS. De uttrykker den lysfølsomme molekylet rhodopsin1 (RH1) og er tilsvarende av pattedyrstavceller. De indre PRs, R7 og R8, er vist i grått (R7 sitter på toppen av R8). De indre PRS uttrykke rhodopsin 3, 4, 5 eller 6, og er tilsvarende pattedyr koniske celler. For enkelhets skyld er bare rhabdomere, lys-sensitive delen av PR, vist for hver PR. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Sette opp Drosophila for visualizatIon av hornhinne nøytralisering. (A-A'''') Fotografier av et Drosophila immobilisert på en plate som er fylt med agarose. I panel A'''', en del av agarose-inneholdende fluen har blitt kuttet for å ta en profil fotografi. Den Drosophila er halv innleiret i agarose, med den høyre vinge i agarose og venstre fast på agarose overflate (A, A'', A''''). Når Drosophila er innleiret i agarose, blir hodet ofte dårlig plassert for visualisering av øyet (A, A '). Hodet må derfor reorientated med tang slik at midten av øyet er peker oppover (A'', A'' '). (B-B') Skjematisk diagram som viser et Drosophila immobilisert på en agarose-plate og posisjonering av Drosophila under målet med mikroskop. (C-C ') Fotografier av innstillingen av Drosophila på scenen avmikroskop under sin målsetting. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Orientering av øyet for tiden-retters analyse. Figuren viser fotografier av et Drosophila hodet i to forskjellige retninger og de tilhørende feltene i ommatidia sett av hornhinnen nøytralisering, representert som skjematiske diagrammer. (A) I løpet av den første observasjonen, er øyet plasseres slik at en klon av heterozygot-eller villtype-prs (gul) er vist i midten av feltet, at nivået av ekvator (rød linje). (B) I andre observasjon, er øyet ofte ikke i egentlig samme retning. Således kan den samme gruppen av PRS finnes igjen, men det er ikke mulig å visenøyaktig samme feltet (til venstre). Øyet må være reorientert for samme felt som skal vises på nytt. Posisjonen for ekvator kan anvendes som en rettesnor. I dette eksemplet, vet vi at det observerte felt er for ventral og at øyet må derfor dreies ventralt for å plassere ekvator i midten av det observerte felt på nytt, slik som i den første observasjon.
Figur 5. Eksempler på PR utviklingsfeil oppdages av Tomato / GFP-FLP / FRT metoden. (A) Visualisering av mosaikk Sina [BG02648] mutant PRS, som viser tap av indre PRS. I mutant ommatidia, blir ytre PRS gruppert sammen på grunn av fravær av den indre PR R7. Faktisk er sina kjent for å være nødvendig for indre PR rekruttering. (B) Visualisering av mosaikk grh [s2140] mutant PRs viser polaritet defekter. Mosaikken mutant ommatidia, surrounded av en sirkel, som peker i den motsatte retning fra villtype ommatidia, som indikerer en dorso-ventral inversjon. En detaljert studie med tomat / GFP-FLP / FRT metoden viste at grh var nødvendig i R3 forløper for den riktige kjøpet av ommatidium polaritet 20. (C) Visualisering av mosaikk CRB [j1B5] mutant PRs, viser deformert homozygot mutant PRS. CRB er kjent for å være nødvendig for rhabdomere morphogenesis.
Figur 6. Tid-retters analyse av mosaikk fatp [k10307] mutant PRS med tomat / GFP-FLP / FRT metoden, over 14 dager. En mosaikk fatp [k10307] mutant netthinnen er observert på dag 1 (A, A '), dag 4 ( B, B '), dag 8 (C, C') og dag 14 (D, D ') etter klekking. Den samme gruppen av mosaikk PRS kan være løstd ved hvert tidspunkt, i det observerte felt (hvitt rektangel, A, B, C, D). I dette feltet av PRS (A ', B', C ', D'), er homozygot mutant PRs merket med grønt, mens heterozygote og homozygote vill type PRS er merket med gult. Fra dag 4 (B ') og utover, homozygot mutant PRS begynner å forsvinne, noe som indikerer at fatp [k10307] mutasjon induserer en progressiv degenerasjon av disse PRS. Klikk her for å se større figur .
Figur 7. Rednings av fatp [k10307] mutant PRS med en mini-hvitt-bærer fatp-uttrykke konstruere. Mosaikk PRS er visualisert med tomat / GFP-FLP / FRT metoden i 15 dager gamle fluer. (A) Visualisering av mosaikk kontroll PRS. (B) Visualization av mosaikk fatp mutant PRS, som viser tap av muterte PRS. (C) Visualisering av mosaikk fatp mutant PRS i en flue reexpressing fatp i ytre PR (RH1> fatp). De muterte PRS er reddet. Tilstedeværelsen av en mini-hvite genet og tilhørende røde øyne pigmentering i RH1> betyr fatp forholdene ikke endre Tomato eller GFP fluorescens eller klonal deteksjon.
Discussion
Drosophila øyet har vært mye brukt for å dechiffrere den signalveier som regulerer utvikling, spredning og overlevelse. På begynnelsen av 1990-tallet, ble et stort antall genetiske skjermer gjennomført for å identifisere trasé som kreves i de innledende fasene av PR utvikling 25-27. Effektiviteten av genetiske skjermene ble økt i stor grad av den mitotiske rekombinasjon teknikk, som gjør det mulig å teste tap-av-funksjon-mutasjoner i mosaikk kloner 21. Derfor kunne rollen som embryonale dødelige mutasjoner systematisk testet i homozygot mutant kloner i øynene av fluer som var ellers heterozygot. De fleste mosaikk screenings har fokusert på tidlig PR rekruttering, differensiering, axonal projeksjon eller morfogenese forekommer i utviklings larver eller pupper 10,25-31. Hittil har bare én mosaikk skjermen undersøkt de mekanismene som regulerer voksen PR-funksjon, ved å overvåke den visuelle respons via electroretinogram Recordings 32. Med tomat / GFP-FLP / FRT metode og muligheten for tidsforløpet analyse utfører i levende muterte dyr, har vi utviklet en ny metode for å identifisere hvilke faktorer som regulerer voksen PR levedyktighet og fungere 20,24.
Tomat / GFP-FLP / FRT metoden har flere store fordeler fremfor den klassiske histologisk seksjonering av harpiks-embedded øyne. Først, er denne metoden mye raskere, billigere og enklere å utføre enn den histologiske metode, forutsatt at en fluorescens mikroskop utstyrt med et passende vann dipping Målet er tilgjengelig (se tabell av reagenser og utstyr). For det andre kan den Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden bli brukt i forbindelse med transgene ekspresjon, så som ekspresjon av P (UAS, w +), som bærer en mini-white transgenet. I motsetning til histologiske snitt, der w + brukes for klonal deteksjon, i tomat / GFP-FLP / FRT system, P (UAS, w +) ikke forstyrrer klonal detection basert på Tomato fluorescerende protein. Ved hjelp av P (UAS-fatp, w +) transgene fluer, var vi i stand til å visualisere redning av fatp mutant PRS (figur 7). Tredje, en viktig fallgruve av alle typer klonal analyse, herunder at basert på tomat / GFP-FLP / FRT, er tvetydigheten i genotype av tapte PRS. Faktisk kan det være uklart hvorvidt en PR er fraværende på grunn av mangel på en spesifikk genfunksjon, eller på grunn av en celle ikke-autonomt effekt, spesielt ved grensen av mutant klon. Tomat / GFP-FLP / FRT metoden får rundt dette problemet for degenerasjon ved å gjøre det mulig å følge villtype og mutant PRS i samme dyr over perioder på flere uker. Vi var i stand til å følge skjebnen til enkelt PRs av kinetisk analyser på ulike fatp mutant fluer (figur 6). Den samme klon kan gjenkjennes i et gitt dyr på forskjellige tidspunkter, på grunn av den nøyaktige formen på de omliggende vill-type-kloner. Vi var i stand til å vise entydigly at alle de manglende PRs var mutant for fatp, noe som indikerer at rollen som fatp mutanter i PRS er celle-autonomt. Således, ved å overvåke tapet av PRS i en kinetisk analyse, er det mulig å bestemme genotypen til PRS i modeller av voksen alder degenerasjon. Endelig har Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden vist seg å være meget kraftig for identifisering av faktorer som regulerer etableringen av PCP 20. Muligheten for å utføre et stort antall mosaikk ommatidia for en polaritet fenotype uten behov for seksjonene, muliggjør hurtig bestemmelse av den PR-kravet for etablering av PCP. Likevel ville finere analyse av PR integritet krever tradisjonell seksjonering fulgt av fase-kontrast eller elektroniske microscopies.
I konklusjonen, åpner Tomato / GFP-FLP / FRT metoden opp nye muligheter for effektiv mosaikk screening for å identifisere faktorer som regulerer PR utviklingsprosesser og voksen PR-funksjoner, som for eksempel visUAL respons og levedyktighet.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
PLATIM og Droso-Tools fasilitetene på UMS3444 biovitenskap, Lyon, Frankrike. BM forskning ble støttet med tilskudd fra Fondation pour la Recherche MEDICALE fra CNRS (ATIP) og ANR-12-BSV1-0019-01. PD ble støttet av Retina Frankrike foreningen og Ecole Normale Supérieure i Lyon (Frankrike). CL ble støttet av La Ligue Nationale contre le Cancer Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
| Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
| Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
| Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
| 40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |
References
- Hardie, R. C. Sensory physiology 5. Ottoson, D. 5, 1-79 (1985).
- Wolff, T., Ready, D. F. Cell death in normal and rough eye mutants of Drosophila. Development. 113, 825-839 (1991).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Halder, G., Callaerts, P., Gehring, W. J. Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila. Science. 267, 1788-1792 (1995).
- Mollereau, B., Domingos, P. M. Photoreceptor differentiation in Drosophila: from immature neurons to functional photoreceptors. Dev Dyn. 232, 585-592 (2005).
- Mollereau, B. Cell death: what can we learn from flies? Editorial for the special review issue on Drosophila apoptosis. Apoptosis. 14, 929-934 (2009).
- Charlton-Perkins, M., Brown, N. L., Cook, T. A. The lens in focus: a comparison of lens development in Drosophila and vertebrates. Mol Genet Genomics. 286, 189-213 (2011).
- Jenny, A. Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye. Curr Top Dev Biol. 93, 189-227 (2010).
- Montell, C.
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59 (2005).
- Tomlinson, A., Ready, D. F.
- Mendes, C. S., et al. ER stress protects from retinal degeneration. Embo J. 28, 1296-1307 (2009).
- Jenny, A. Preparation of adult Drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis. J Vis Exp. , (2011).
- Mollereau, B., et al. Two-step process for photoreceptor formation in Drosophila. Nature. 412, 911-913 (2001).
- Domingos, P. M., et al. Spalt transcription factors are required for R3/R4 specification and establishment of planar cell polarity in the Drosophila eye. Development. 131, 5695-5702 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c-d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO Rep. 7, 933-939 (2006).
- Domingos, P. M., et al. Regulation of R7 and R8 differentiation by the spalt genes. Dev Biol. 273, 121-133 (2004).
- Mollereau, B., et al. A green fluorescent protein enhancer trap screen in Drosophila photoreceptor cells. Mech Dev. 93, 151-160 (2000).
- Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128, 815-826 (2001).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-134 (2011).
- Golic, K. G. Site-specific recombination between homologous chromosomes in Drosophila. Science. 252, 958-961 (1991).
- Porter, J. A., Hicks, J. L., Williams, D. S., Montell, C. Differential localizations of and requirements for the two Drosophila ninaC kinase/myosins in photoreceptor cells. J Cell Biol. 116, 683-693 (1992).
- Johnson, K., Grawe, F., Grzeschik, N., Knust, E. Drosophila crumbs is required to inhibit light-induced photoreceptor degeneration. Curr Biol. 12, 1675-1680 (2002).
- Dourlen, P., et al. Drosophila fatty acid transport protein regulates rhodopsin-1 metabolism and is required for photoreceptor neuron survival. PLoS Genet. 8, e1002833 (2012).
- Mlodzik, M., Hiromi, Y., Weber, U., Goodman, C. S., Rubin, G. M. The Drosophila seven-up gene, a member of the steroid receptor gene superfamily, controls photoreceptor cell fates. Cell. 60, 211-224 (1990).
- Gaul, U., Chang, H., Choi, T., Karim, F., Rubin, G. M. Identification of ras targets using a genetic approach. Ciba Found Symp. 176, 85-92 (1993).
- Wassarman, D. A., Therrien, M., Rubin, G. M. The Ras signaling pathway in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 5, 44-50 (1995).
- Janody, F., et al. A mosaic genetic screen reveals distinct roles for trithorax and polycomb group genes in Drosophila eye development. Genetics. 166, 187-200 (2004).
- Legent, K., Steinhauer, J., Richard, M., Treisman, J. E. A screen for X-linked mutations affecting Drosophila photoreceptor differentiation identifies Casein kinase 1alpha as an essential negative regulator of wingless signaling. Genetics. 190, 601-616 (2012).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Berger, J., et al. Systematic identification of genes that regulate neuronal wiring in the Drosophila visual system. PLoS Genet. 4, e1000085 (2008).
- Bayat, V., et al. Mutations in the mitochondrial methionyl-tRNA synthetase cause a neurodegenerative phenotype in flies and a recessive ataxia (ARSAL) in humans. PLoS Biol. 10, e1001288 (2012).
