Summary
肌成纤维细胞是胃肠道，调节重要生理过程的正常和疾病状态的一个有影响力的基质细胞。我们描述了一种技术，它允许主肌纤维母细胞从小鼠和人结肠组织，它可以用于在体外实验的隔离。
Abstract
的肌成纤维细胞是胃肠（GI）道，已获得相当大的关注在许多胃肠功能的关键作用的基质细胞。虽然一些肌成纤维细胞的细胞系是可商购的，研究这些细胞在体外 ，离暴露实验的细胞培养条件的细胞系的研究成果具有因工作过于简单化的性质固有的局限性。使用初级肌纤维母细胞提供了在确认细胞系鉴定实验结果方面有很大的优势。从动物模型隔离初级肌纤维母细胞可为肌成纤维细胞的研究更紧密地模仿所研究的疾病状态条件下。从人结肠组织主要肌纤维母细胞的分离提供了可以说是最相关的实验数据，由于细胞直接来自患者的基础疾病。我们描述了一个行之有效的技术，可以为utilized从小鼠和人的结肠组织隔离初级肌成纤维细胞。这些分离的细胞已被鉴定为α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白阳性的，和结蛋白阴性的，与皮下肠肌成纤维细胞是一致的。初级肌成纤维细胞的细胞可以生长在细胞培养物和用作实验过通道的数量有限。
Introduction
胃肠道（GI）道功能的调节涉及粘膜层与下伏间质之间复杂的，动态的相互作用。这些相互作用通常用来维持内环境稳定，但也可能导致疾病状态的发展病理条件下，1。肌成纤维细胞是位于下方的所在，以旁分泌方式进行通信及邻近细胞亚群调节若干关键胃肠道工序，包括粘膜再生，修复和纤维化2的上皮细胞层基质细胞亚群。
的18 CO细胞株是已被广泛用于研究肌成纤维细胞功能的人结肠肌成纤维细胞系的一个例子，因为它有许多共同的初级原位成肌纤维细胞的特性。这些包括的α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达（α-SMA）和波形蛋白，以及一个数的表达式细胞表面受体如表皮生长因子受体，或受体的溶血磷脂酸3,4。因为这些共享超微结构特征，以及在生物功能5的相似性，则18 CO细胞系已被广泛用于研究肌成纤维细胞的功能在许多疾病状态如炎性肠疾病或结肠直肠癌3,6的范围内。但是，也有使用的细胞系时固有的局限性和关注。这些包括基因型不稳定随着时间的推移区别于原代细胞的细胞系，从而改变细胞的表型和生物学功能，包括生长速率，并与其他细胞群的相互作用。细胞系也缺乏GI微环境（上皮，基质和血管成分），这是一个主要的限制其使用的正常组成部分。因此，从实验细胞株的研究得出的结论需要进一步的验证，以降低RISK误解。
初级肌成纤维细胞可以从人类和小鼠的结肠组织得到证实在细胞系7识别的实验结果。该方法最初是由马希达， 等。8描述的，和我们的协议是可以被用来从小鼠和人结肠9隔离初级肌成纤维细胞的许多良好描述的技术之一。对于结肠疾病的任何小鼠模型，这种技术可以用来隔离初级肌成纤维细胞，研究它们与邻近的细胞是如何相互作用或促使正常或病理性的GI处理10,11。这种技术可以用来研究肌纤维母细胞如何促进黏膜愈合，纤维化和结直肠腺瘤和癌的发展。初级肌成纤维细胞还可以从已经在切除操作的时间为良性（炎性肠病，狭窄，憩室炎）或恶性Ç人结肠组织获得onditions。来自人类和小鼠的结肠组织分离的原代细胞可以生长在细胞培养物和利用多通道的数量有限。
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Protocol
1。获得结肠组织
鼠标
的协议进行动物实验，详细介绍了基本原理和研究的目的，已提交并经我们的机构动物研究监督处。
- 安乐死鼠标与吸入异氟醚后颈椎脱位。
- 使下腹正中切口，收回小肠路程，确定结肠。收回膀胱和子宫（如果存在的话）横向和识别耻骨，切细剪刀，露出直肠。
- 解剖直肠背侧肠系膜断结肠，动员结肠从肛门至盲肠，并横切到断开小肠结肠。
- 将样品在冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
- 填有10毫升注射器用冰冷的PBS冲洗和结肠腔数次以清除其内容，再切结肠氧化聚乙烯Ñ长度方向用剪刀。
- 将结肠在50ml锥形管中加入20ml冰冷的PBS。结肠并没有被放置在任何特定的方位。通过更换PBS洗结肠直至油液清晰，没有颗粒物。
人的
一个协议获得人体组织从外科病人，详细介绍了获得该组织以及潜在的风险和收益进行评估的重要性，已提交并经本机构的人类研究保护计划办公室。
- 与结直肠外科医生的研究合作是必要的，以便能够获得人体组织对你的研究。一个协议，以获得人类结肠组织应提交并批准您的机构审查委员会。
- 书面知情同意从患者得到的外科手术之前。
- 外科医生将在展台进行结肠切除术ARD时尚。一旦结肠已经从患者体内取出，将试样立即送往病理。中的不需要的病理评价结肠壁全层的截面A 0.5提供，并立即放置在冰冷的PBS。这个标本不应包括结肠肠系膜和网膜附属物应删除为好，因为脂肪的存在会影响消化过程。
2。剥夺上皮细胞
- 孵育整个小鼠结肠中在50ml锥形管中加入25ml 5mM EDTA的HBSS中（室温）。将锥形管在37℃下振荡空气浴（250 rpm）离心15分钟。 15分钟后，小心地倒出液体并重新填充该管，用25ml的5毫摩尔EDTA，重复，共5次洗涤。对于人类结肠癌，获得的结肠壁一个半英寸带从病理学家后，用剪刀剪结肠分成四个相等大小的块。放置两片到一个50ml锥形管中，并将其余两块结肠组织到一个独立的50ml锥形管中。然后孵化用25ml 5mM EDTA的HBSS中，并执行清洗，如上所述。
- 在20ml的冰冷的PBS漂洗两次结肠。
- 将小鼠结肠组织中一个新的50毫升锥形管含有20ml的RPMI-5，10单位分散酶，及2000ü胶原酶的D（室温）。对于人类结肠组织，用中性蛋白酶和胶原酶的两倍（20 U分散酶，4000ü胶原酶D）。
- 将管在37℃下振荡空气浴垂直取向（如果水平放置，有太多的曝气和细胞的损伤）。摇在250转长达60分钟。暴露在分散酶和胶原酶后D，结肠组织将开始消化和结肠组织将开始寻找粘性。这通常需要大约30分钟。当结肠有这个样子，从酶去除结肠。
- 摇各管上下2-4次，打破了组织。 P埃利特组织在200×g离心在台式离心机（4℃）5分钟。小心倒出上清液并丢弃。
3。肌成纤维细胞的分离与培养
- 通过加入10ml的ACK裂解缓冲液（47℃）重悬每个粒料。再次离心200×g离心5分钟（4℃），倒出并丢弃上清液。
- 通过加入10ml的RPMI-5用移液管重悬浮每个粒料。
- 通过用10毫升吸管成100毫米TC-处理的培养皿一个70微米的筛网过滤器传递一半的细胞悬浮液（5毫升）。然后添加一个额外的15毫升RPMI-5。用其余的5 ml细胞悬液重复插入不同百毫米TC-处理的培养皿中。因此，人们小鼠结肠将产生两根100 mm TC处理的菜肴。人结肠癌组织中的一个半英寸长条将产生共4 100毫米TC-处理的培养皿。
- 放置在组织培养皿中在10％CO 2培养箱中在37℃下培养条件是相同的f或小鼠和人原代细胞。
- 3小时后，轻轻洗掉非贴壁细胞用HBSS的两种变化。碎片漂浮应该轻轻洗掉。贴壁细胞组成的上皮细胞，巨噬细胞和成肌纤维细胞。一周后播种，只有隔膜肌成纤维细胞，巨噬细胞和上皮细胞中的第一通道后衰老。加入新鲜RPMI-5和成长的细胞在细胞培养。
- 细胞通过胰蛋白酶消化传代5分钟，被分割为2:1。
缩略语
HBSS：汉克平衡盐溶液，RPMI-5：罗斯韦尔公园纪念研究所媒体，ACK：氯化铵，钾，FCS：胎牛血清，TC处理：组织培养处理
解决方案
ACK裂解缓冲液- （4.15克氯化铵 0.5克KHCO 3，18.6毫克的Na 2 EDTA，加入400ml H 2 O，调节pH值至7.2〜7.4，用1N HCl）。过滤器sterilize到0.2微米的过滤器，并储存于4℃ 的RPMI-5 - （使500毫升：454.5毫升RPMI，将25ml的FCS，加入5ml 200mM的L-谷氨酰胺，将5ml 1M的HEPES，pH为7.4，加入5ml 100 1mM丙酮酸钠，5毫升100X青霉素 - 链霉素，加入500ml的50mM乙-ME的PBS中）。
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Representative Results
一旦分离，原代人成肌纤维细胞可以生长在细胞培养物和使用过的通道的一个有限数量（最多通道4）。这些细胞的特征在α- 平滑肌肌动蛋白和波形蛋白阳性，结蛋白阴性的（ 图1A），与肠上皮下成肌纤维细胞5,7一致。他们也有一个特点星状形态（ 图1B）。初级成肌纤维细胞随后可以用来确认在细胞系中发现的实验结果。这种方法被用来证明促炎细胞因子TNF-α（10纳克/毫升）诱导的EGF受体表达的上调和在这些细胞中7信令。上调EGF受体表达和信号最初被发现，利用前面提到的人结肠肌成纤维细胞的细胞系18 CO（ 图2）。在图2A中，我们展示了18 CO细胞暴露于TNF-α45;导致时间依赖性增加，EGF受体的表达。此关联与增强EGF诱导的COX-2表达和p42/44 MAPK磷酸化在这些细胞中（ 图2B）。为了验证上述实验结果，利用原代人类肌纤维母细胞从大肠癌患者手术切除的结肠分离的反复实验。 如图2C和2D，初级人类肌纤维母细胞紧密地模仿实验结果中的18 CO细胞系7初步确定。
图1。初级肌成纤维细胞可以从人类结肠组织 7 来分离 。分离的原代细胞表现出肌成纤维细胞样表型是一致α-SMA和波形蛋白阳性（ 图1A），并展示一个星状形态（ 
图2。在细胞系的实验结果所使用的原代人成肌纤维细胞 7 成立 。在人结肠肌成纤维细胞的细胞系18 CO被用于证明TNF-α诱导的EGF受体的表达和信号在这些细胞中的表达上调（ 图2A）。表皮生长因子受体表达的上调这是具有增强的表皮生长因子受体信号转导相关联，在图2B中 ，在随后暴露于EGF导致增强的p42/44 MAPK磷酸化和COX-2的表达所示。这些效果完全与表皮生长因子受体抑制剂AG1478抑制。初级人类肌纤维母细胞从大肠癌患者手术切除的结肠分离证实了这些实验结果（ 图2C和2D）。肿瘤坏死因子-α= TNF-α，EGFR =表皮生长因子受体，AG = AG1478，COX-2 =环氧合酶2。 点击这里查看大图。 
图3。原发性肌纤维母细胞可从小鼠结肠组织中分离出来 。原代小鼠肌纤维母细胞的10倍视图。 点击这里查看大图。
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Discussion
无论是使用鼠标或结肠癌时，通用的技术是相似的。这种技术也可以用于从小肠分离成肌纤维细胞。具体细节，肌纤维母细胞从1隔离。小鼠和2。人结肠癌在下面讨论。
1。小鼠结肠癌
小鼠结肠灌溉是通过附加一个4，为16G波普尔钝头针头至结肠的一端提供便利。这也有助于纵向切割结肠时。您可以手风琴结肠组织到针，然后将剪一个尖与尖底起来，滑过剪刀边缘的结肠组织的同时，减少对纵向打开它。
在步骤2.1，但要明白，从死细胞的核物质可导致细胞聚集是很重要的。加入DNA酶（50毫克/毫升）的可被用来解决这个问题。
最关键的一步是一步2.4。保持约结肠组织天津恒瑞富手表。当结肠开始看起来弦，从酶去除结肠。不需要孵育结肠的整个60分钟。如果结肠组织暴露在分散酶和胶原酶D代表过长，细胞就会死亡。这是一个常见的错误，这将导致在低细胞产量。
细胞的污染是另一个常见的问题。仔细的技术，适当的洗涤和过滤将污染的风险最小化，随着用于细胞培养的工作标准无菌技术。
2。结肠癌
的时间为孵育酶的长度取决于正在被消化的样品的大小。我们通常会收到人类结肠壁的半英寸全层带。有隔离人类结肠组织肌纤维母细胞时，在步骤2.3的修改。对于步2.3，为人类结肠必须加倍分散酶量（20 U）和合作llagenase D（4000 U）的使用。结肠癌的一个更大的部分将需要较长的培养时间。另外，请记住，酶的比活性可以有很多变化，所以你可能要相应地调整培养时间。
对于初级小鼠和人的肌成纤维细胞，0nce在培养基中生长，所述分离的细胞进行评估，以评估对细胞的纯度和以确认该细胞是肌成纤维细胞样。这可以用各种技术，包括免疫组织化学染色（抗体，肌成纤维标记物包括α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白进行;单克隆抗体对CD68是特异性巨噬细胞，CD31是特异性内皮细胞和CD45是特定的免疫细胞;抗体与E-cadherin和各种细胞角蛋白是特异于上皮细胞。mRNA的表达也可通过RT-PCR 12评估。流式细胞术也可以用于细胞分析13。
体外和共培养实验。原代细胞，也可以植入到小鼠来研究细胞-细胞相互作用14的皮下组织。未来的应用可能涉及重新植入原发性肌成纤维细胞成同基因小鼠，利用鼠标结肠镜检查下列遗传操作的结肠壁。
一些其他方法来从人类和小鼠结肠分离主肌成纤维细胞也已被描述。二载列如下：
- 马希达， 等人，Am。生理学杂志 273 G1341-1348，（1997）。
- 德WEVER， 等。诠释。中华肿瘤杂志，39，393-400（2011）。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由卫生部资助5KO8DK085136-02 JY国家机构的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
References
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