Isolation des myofibroblastes primaires de souris et de tissus du côlon humain

Summary

Le myofibroblastes est une cellule influent stromale du tractus gastro-intestinal qui régule les processus physiologiques importants dans les états normaux et pathologiques. Nous décrivons une technique qui permet l'isolement des myofibroblastes primaires à partir de la souris et le tissu du côlon humain, qui peut être utilisé pour l'expérimentation in vitro.

Abstract

Le myofibroblastes est une cellule stromale de l'appareil gastro-intestinal (GI) qui a gagné une attention considérable de son rôle essentiel dans de nombreuses fonctions gastro-intestinales. Bien que plusieurs lignées cellulaires myofibroblastes sont disponibles dans le commerce pour étudier ces cellules in vitro, les résultats de la recherche provenant d'une lignée de cellules exposées à des conditions de culture de cellules expérimentales ont des limites inhérentes dues à la nature trop réductrice de l'œuvre. L'utilisation de myofibroblastes primaires offre un grand avantage en termes de confirmer les résultats expérimentaux identifiés dans une lignée cellulaire. Isolement des myofibroblastes primaires à partir d'un modèle animal pour l'étude permet de myofibroblastes dans des conditions qui imitent plus près de l'état pathologique en cours d'étude. Isolation des myofibroblastes primaires de tissus du côlon humain fournit sans doute des données expérimentales les plus pertinentes, car les cellules viennent directement de patients atteints de la maladie sous-jacente. Nous décrivons une technique bien établie qui peut être utilized pour isoler myofibroblastes primaires à partir de la souris et le tissu du côlon humain. Ces cellules isolées ont été caractérisées pour être l'alpha-actine musculaire lisse et la vimentine positif, et la desmine négatif, compatible avec les myofibroblastes sous-épithéliaux intestinaux. Cellules de myofibroblastes primaires peuvent être cultivées dans une culture cellulaire et utilisés à des fins expérimentales sur un nombre limité de passages.

Introduction

La régulation de la fonction gastro-intestinale (GI), implique des interactions complexes et dynamiques entre la couche de muqueuse et son mésenchyme sous-jacent. Ces interactions servent normalement à maintenir l'homéostasie, mais peuvent également conduire au développement d'états pathologiques dans des conditions pathologiques ^1. Les myofibroblastes sont une sous-population de cellules du stroma sous-jacent qui se trouvent à la couche epitheliale qui communiquent dans un mode paracrine environnante avec des sous-populations de cellules pour réguler un certain nombre de processus critiques tractus gastro-intestinal comprenant la régénération de la muqueuse, la réparation, la fibrose et ^2.

La lignée cellulaire 18Co est un exemple d'une lignée humaine du colon des myofibroblastes cellulaire qui a été largement utilisé pour étudier la fonction des myofibroblastes, car il partage un grand nombre des caractéristiques de primaire en myofibroblastes in situ. Il s'agit notamment de l'expression de la protéine d'a-actine du muscle lisse (α-SMA) et la vimentine, ainsi que l'expression d'un certain nombredes récepteurs de surface cellulaire tels que le récepteur épidermique de facteur de croissance, ou des récepteurs pour ^3,4 de l'acide lysophosphatidique. En raison de ces caractéristiques ultrastructurales communes, ainsi que des similitudes dans la fonction biologique ^5, la lignée cellulaire 18Co a été largement utilisée pour étudier la fonction des myofibroblastes dans le cadre de nombreux états pathologiques comme la maladie inflammatoire de l'intestin ou ^3,6 du cancer colorectal. Cependant, il ya des limites et des préoccupations inhérentes lors de l'utilisation d'une lignée cellulaire. Il s'agit notamment de l'instabilité génotypique au cours du temps qui se différencie des lignées cellulaires à partir de cellules primaires, en modifiant le phénotype et la fonction biologique de la cellule, y compris les taux et les interactions avec d'autres populations cellulaires croissance. Les lignées cellulaires n'ont pas non plus les composantes normales du micro-environnement de GI (épithéliales, stromales, et des composants vasculaires), ce qui est un obstacle majeur à leur utilisation. Par conséquent, les conclusions tirées de la recherche en ligne de cellule expérimentale nécessite une validation supplémentaire pour réduire la risk de mauvaise interprétation.

Myofibroblastes primaires peuvent être obtenus à partir de tissus de côlon humain et la souris pour confirmer les résultats expérimentaux identifiés dans une lignée cellulaire ^7. La méthode a été décrite à l'origine par Mahida et al. ^Huit, et notre protocole est une des nombreuses techniques bien décrits qui peuvent être utilisés pour isoler des myofibroblastes primaires à partir de la souris et du côlon humain ^9. Pour tout modèle de souris de la maladie du côlon, cette technique peut être utilisée pour isoler les myofibroblastes primaires pour étudier la façon dont ils interagissent avec les cellules voisines ou contribuer à la fois normal ou pathologique GI traite ^10,11. Cette technique peut être utilisée pour étudier comment les myofibroblastes contribuent à la cicatrisation des muqueuses, de la fibrose, et le développement d'adénomes et de carcinomes colorectaux. Myofibroblastes primaires peuvent également être obtenus à partir de tissu de colon humain qui a été réséqué au moment de l'opération de bénigne (maladie inflammatoire de l'intestin, les sténoses, la diverticulite) ou c malinonditions. Les cellules primaires isolées à partir de tissu de côlon humain et de souris peuvent être cultivées dans une culture de cellules et utilisées sur un nombre limité de passages.

Protocol

Une. Obtenir Colon tissus

Souris

Un protocole pour effectuer des expériences sur les animaux, en précisant les motifs et les objectifs de la recherche, a été soumis et approuvé par notre bureau institutionnel de la surveillance des animaux de recherche.

1. Euthanize la souris avec de l'isoflurane inhalation suivie par dislocation cervicale.
2. Faire une incision médiane ventrale, retirer l'intestin grêle loin et identifier le côlon. Rétracter la vessie et de l'utérus (si présent) latéralement et identifier l'os pubien et le couper avec des ciseaux fins pour exposer le rectum.
3. Disséquer le mésentère dorsal du rectum hors du côlon et de mobiliser le côlon par l'anus pour le caecum, et sectionner pour le débrancher du côlon de l'intestin grêle.
4. Placer l'échantillon dans de la glace-froid tampon phosphate salin (PBS).
5. Remplir une seringue de 10 ml avec du PBS glacé et vider le côlon lumière plusieurs fois pour effacer son contenu, puis couper le ope du côlonn utilisant la longueur sage-ciseaux.
6. Placer les deux points dans un tube conique de 50 ml contenant 20 ml de PBS glacé. Le côlon n'a pas à être placée dans une orientation particulière quelconque. Laver le côlon par le remplacement du PBS jusqu'à ce que le liquide est clair sans particules.

Humain

Un protocole d'obtenir les tissus humains de patients en chirurgie, en précisant l'importance de l'obtention de ce tissu ainsi que l'évaluation des risques et des avantages potentiels, a été soumis et approuvé par notre bureau institutionnel du Programme de Human Research Protection.

1. collaboration de recherche avec un chirurgien colorectal est nécessaire d'être en mesure d'obtenir les tissus humains pour votre recherche. Un protocole pour obtenir des tissus du côlon humain doit être soumis et approuvé par votre comité d'examen institutionnel.
2. Un consentement éclairé écrit est obtenu à partir du patient avant l'intervention chirurgicale.
3. Le chirurgien va effectuer une résection du côlon dans le standmode ard. Une fois que le côlon a été retiré du patient, l'échantillon est immédiatement retiré à la pathologie. 0,5 dans la section de pleine épaisseur de paroi du côlon n'est pas nécessaire pour l'évaluation pathologique est prévu et est immédiatement placé sur PBS glacé. Ce spécimen ne doit pas inclure le mésentère du côlon, et les appendices épiploïques doit être retiré aussi bien, puisque la présence de graisse aura une incidence sur le processus de digestion.

2. Dénuder cellules épithéliales

1. Incuber le côlon de souris entière dans 25 ml de 5 mM d'EDTA dans du HBSS (température ambiante) dans un tube conique de 50 ml. Placer le tube conique dans un bain d'air de C en secouant à 37 ° (250 rpm) pendant 15 min. Après 15 min, soigneusement verser le liquide et remplir le tube avec 25 ml d'EDTA 5 mM, répéter pour un total de 5 lavages. Pour côlon humain, après l'obtention d'une bande de ½ pouce de la paroi du côlon du pathologiste couper le côlon avec des ciseaux en quatre morceaux de taille égale. Placer deux des pièces en un seul tube de 50 ml conique, etplacer les deux morceaux restants de tissus du côlon dans 50 ml tube conique séparé. Puis incuber avec 25 ml d'EDTA 5 mM dans du HBSS et effectuer les lavages, comme décrit ci-dessus.
2. Rincer deux fois le côlon dans 20 ml de PBS glacé.
3. Placer le tissu de côlon de souris dans un nouveau tube conique de 50 ml contenant 20 ml de RPMI-10, 5 U de dispase, et 2000 U de collagénase D (température ambiante). Pour les tissus du côlon humain, utiliser deux fois le montant de la dispase et de la collagénase (20 U dispase, 4000 U collagénase D).
4. Placer le tube dans un bain d'air à 37 ° C en secouant orienté verticalement (S'il est placé horizontalement, il ya trop d'aération et des dommages aux cellules). Agiter à 250 tpm pour un maximum de 60 min. Après exposition à la dispase et de la collagénase D, le tissu du côlon va commencer à digérer et le tissu du côlon va commencer à regarder filandreuse. Cela prend habituellement environ 30 min. Lorsque le colon a cette apparence, enlever le côlon des enzymes.
5. Agiter chaque tube de haut en bas 2-4 fois pour briser le tissu. PEllet le tissu à 200 x g dans une centrifugeuse de paillasse (4 ° C) pendant 5 min. Versez délicatement le surnageant et le jeter.

3. Myofibroblastes Isolement et culture

1. Remettre en suspension chaque culot par addition de 10 ml de tampon de lyse ACK (47 ° C). Centrifuger à 200 g pendant 5 min (4 ° C), verser et jetez le surnageant.
2. Remettre en suspension chaque culot par addition de 10 ml de RPMI-5 avec une pipette.
3. Passer la moitié de la suspension de cellules (5 ml) à travers un tamis de maille 70 um en utilisant une pipette de 10 ml dans une boîte de TC-traité 100 mm. Puis ajouter un supplément de 15 ml de RPMI-5. Répéter l'opération avec les 5 ml restants de suspension cellulaire dans un plat de TC-traité 100 mm différente. Un colon de la souris va donc produire deux plats de TC traité 100 mm. Une bande de ½ pouce de tissu du côlon humain donnera un total de quatre plats de TC traité de 100 mm.
4. Placez les boîtes de culture de tissus dans un incubateur à CO ₂ de 10% à 37 ° C. Les conditions de culture sont les mêmes fou de la souris et les cellules humaines primaires.
5. Après 3 heures, lavez délicatement les cellules non adhérentes avec deux changements de HBSS. Le flottement de débris doit être lavé délicatement. Les cellules adhérentes sont composées de cellules épithéliales, les macrophages et les myofibroblastes. Une semaine après l'ensemencement, seulement myofibroblastes fracture, les macrophages et les cellules épithéliales sénescence après le premier passage. Ajouter frais RPMI-5 et cultiver les cellules dans la culture cellulaire.
6. Les cellules sont soumises à des passages par traitement à la trypsine pendant 5 minutes et sont divisées 2:1.

Abréviations

HBSS: solution saline équilibrée de Hank; RPMI-5: Roswell Park Memorial Institute médias; ACK: Ammonium-chlorure de potassium-; FCS: sérum de veau foetal, TC-traité: la culture de tissu traité

Solutions

Tampon de lyse ACK - (4,15 g de NH ₄ Cl, 0,5 g de _KHCO3, 18,6 mg Na ₂ EDTA, 400 ml H ₂ O, ajuster le pH à 7.2 à 7.4 avec HCl 1 N). Filtre stérilisablee à travers un filtre de 0,2 um et stocker à 4 ° C. RPMI-5 - (pour faire 500 ml: 454,5 ml de RPMI, 25 ml de FCS, 5 ml 200 mM de L-glutamine, 5 ml 1 M HEPES, pH 7,4, 5 ml pyruvate de sodium 100 mM, 5 ml 100x Pen-Strep, 500 ml 50 mM B-ME dans PBS).

Representative Results

Une fois isolées, les myofibroblastes humains primaires peuvent être cultivées dans une culture cellulaire et utilisés sur un nombre limité de passages (jusqu'à passage 4). Ces cellules sont caractérisées comme étant un actine musculaire lisse et la vimentine positif et négatif desmine (figure 1A), compatible avec les myofibroblastes sous-épithéliales intestinales ^5,7. Ils ont aussi une morphologie stellaire caractéristique (figure 1B). Myofibroblastes primaires peuvent alors être utilisés pour confirmer les résultats expérimentaux identifiés dans une lignée cellulaire. Cette approche a été utilisée pour démontrer que la cytokine TNF-α pro-inflammatoire (10 ng / ml) induit la régulation à la hausse de l'expression du récepteur de l'EGF et de signalisation dans ces cellules ^7. L'expression du récepteur EGF régulée à la hausse et la signalisation a été initialement trouvés en utilisant le côlon lignée cellulaire humaine de myofibroblastes mentionné précédemment 18Co (figure 2). Sur la figure 2A, on démontre que l'exposition des cellules au TNF-18Co45; conduit à une augmentation dépendant du temps de l'expression du récepteur de l'EGF. Cette corrélation avec une meilleure expression de la COX-2 induite par l'EGF et p42/44 MAPK phosphorylation dans ces cellules (figure 2B). Pour valider ces résultats expérimentaux, des expériences ont été répétées en utilisant myofibroblastes primaires humains isolés à partir du côlon subi une résection chirurgicale des patients atteints de cancer colorectal. Comme le montre la figure 2C et 2D, myofibroblastes primaires humains imitent de près les résultats expérimentaux initialement identifiés dans la lignée cellulaire 18Co ^7.

Figure 1. Myofibroblastes primaires peuvent être isolées à partir de tissu de colon humain ^7. Cellules primaires isolées montrent un phénotype de myofibroblastes-like qui sont toujours un SMA et vimentine positif (figure 1A) et montrent une morphologie stellaire (

Figure 2. Résultats expérimentaux dans une lignée de cellules sont étayées par des cellules humaines primaires myofibroblastes ^7. La lignée de cellules de côlon humain myofibroblastes 18Co a été utilisée pour démontrer que le TNF-α induit la régulation à la hausse de l'expression du récepteur de l'EGF et de la signalisation dans ces cellules (figure 2A). Cette régulation à la hausse de l'expression du récepteur de l'EGF a été associée à une meilleure signalisation du récepteur de l'EGF, représenté sur la figure 2B, où une exposition ultérieure à l'EGF a conduit à la phosphorylation de MAPK p42/44 améliorée et l'expression de COX-2. Ces effets ont été complètement inhibées par l'inhibiteur de récepteur à l'EGF AG1478. Myofibroblastes primaires humains isolés à partir du côlon subi une résection chirurgicale des patients atteints de cancer colorectal confirment ces résultats expérimentaux (figures 2Cet 2D). Facteur de nécrose tumorale alpha = TNF-α, EGFR = récepteur de l'EGF, AG = AG1478, COX-2 = la cyclo-oxygénase-2. Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 3. Myofibroblastes primaires peuvent être isolées à partir de tissu de côlon de souris. Une vue 10X de cellules de myofibroblastes primaires de souris. Cliquez ici pour agrandir la figure.

Discussion

La technique générale est similaire pour l'utilisation de la souris ou l'autre ou du côlon humain. Cette technique peut également être utilisée pour isoler des myofibroblastes par l'intestin grêle. Les détails spécifiques pour l'isolement des myofibroblastes de 1. souris et 2. côlon humain sont discutés ci-dessous.

Une. Colon souris

L'irrigation du colon de la souris est facilitée par la fixation d'un 4 à 16 G Popper aiguille à extrémité émoussée à une extrémité du côlon. Cela aide aussi lors de la coupe du côlon longueur. Vous pouvez accordéon le tissu du colon sur l'aiguille, puis placer un bout de ciseaux avec l'extrémité pointue et faites glisser le tissu du côlon sur le bord de ciseaux pendant la coupe pour ouvrir la longueur.

A l'étape 2.1, il est important de comprendre que les matières nucléaires des cellules mortes peut conduire à l'agglutination des cellules. L'addition de DNase (50 mg / ml) peut être utilisée pour résoudre ce problème.

L'étape la plus critique est l'étape 2.4. Gardez un caMontre Reful du tissu du côlon. Lorsque le côlon commence à regarder filandreuse, enlever le côlon des enzymes. Vous n'avez pas besoin d'incuber le côlon pour l'ensemble 60 min. Si le tissu de colon est exposé à de la collagénase et de la dispase D pendant trop longtemps, les cellules vont mourir. C'est une erreur commune qui se traduira par un rendement faible de cellules.

Contamination des cellules est un autre problème commun. Une technique soigneuse, le filtrage et le lavage appropriée permettra de minimiser le risque de contamination, ainsi que des techniques stériles standard utilisées pour les travaux de culture cellulaire.

2. Côlon humain

La durée de l'incubation avec les enzymes dépend de la taille de l'échantillon qui est digérée. Nous recevons généralement une bande de pleine épaisseur de ½ pouce de la paroi du côlon humain. Il s'agit d'une modification dans l'étape 2.3 lors de l'isolation myofibroblastes de tissus du côlon humain. Pour l'étape 2.3, du côlon humain, vous devez doubler le montant de dispase (20 U) et collagenase D (4000 U) utilisée. Un segment encore plus de deux points, il faudra un temps d'incubation plus longue. Aussi, gardez à l'esprit que l'activité spécifique des enzymes peut varier avec beaucoup, de sorte que vous pourriez avoir à ajuster le temps d'incubation en conséquence.

Pour les deux souris primaire et myofibroblastes humains, 0nce grandi dans la culture, les cellules isolées devraient être évalués afin d'évaluer la pureté des cellules et de confirmer que les cellules sont myofibroblastes-comme. Cela peut être fait avec une grande variété de techniques, y compris la coloration immunohistochimique (anticorps de myofibroblastes marqueurs comprennent les a-actine du muscle lisse et la vimentine, un anticorps monoclonal contre CD68 est spécifique aux macrophages, CD31 est spécifique aux cellules endothéliales, et CD45 est spécifique des cellules immunitaires; des anticorps dirigés contre la E-cadhérine et de divers cytokératines sont spécifiques pour des cellules épithéliales. expression de l'ARNm peut également être évaluée par RT-PCR ^12. cytométrie en flux peut également être utilisé pour l'analyse de cellules ^13.

in vitro et de co-culture expérimentation. Les cellules primaires peuvent également être implantés dans le tissu sous-cutané de souris pour étudier les interactions cellule-cellule ^14. Les applications futures peuvent impliquer réimplantation de myofibroblastes primaires dans la paroi du côlon d'une souris syngéniques en utilisant la coloscopie de souris après la manipulation génétique.

Un certain nombre de méthodes alternatives pour isoler myofibroblastes primaires de l'homme et du côlon de souris ont également été décrits. Deux sont énumérés ci-dessous:

1. Mahida, et al. Am. J. Physiol. 273 G1341-1348, (1997).
2. De Wever, et al. Int. J. Oncol. 39, 393-400, (2011).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Dispase I	Invitrogen/GIBCO	#17105-041
Collagenase D	Roche	#1 088 858
4 in, 16 G Popper blunt-end needle	Fisher	#14-825-16K