Summary
myofibroblast सामान्य और बीमारी दोनों राज्यों में महत्वपूर्ण शारीरिक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है कि जठरांत्र संबंधी मार्ग के एक प्रभावशाली stromal सेल है. हम माउस और इन विट्रो प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है, जो मानव पेट के ऊतक, दोनों से प्राथमिक myofibroblasts के अलगाव के लिए अनुमति देता है एक तकनीक का वर्णन.
Abstract
myofibroblast कई सैनिक कार्यों में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए काफी ध्यान प्राप्त किया गया है कि जठरांत्र (सैनिक) पथ का एक stromal सेल है. कई myofibroblast सेल लाइनों विट्रो में इन कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, प्रयोगात्मक सेल संस्कृति की स्थिति से अवगत कराया एक सेल लाइन से शोध के परिणामों काम की पीढ़ी न्यूनकारी प्रकृति के कारण अंतर्निहित सीमाएँ होती हैं. प्राथमिक myofibroblasts का प्रयोग एक सेल लाइन में पहचान की प्रयोगात्मक निष्कर्षों की पुष्टि के मामले में एक महान लाभ प्रदान करता है. एक पशु मॉडल से प्राथमिक myofibroblasts के अलगाव और अधिक बारीकी से रोग राज्य अध्ययन किया जा रहा है कि नकल की शर्तों के तहत myofibroblasts के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. कोशिकाओं अंतर्निहित रोग के साथ रोगियों से सीधे आने के बाद से मानव पेट के ऊतक से प्राथमिक myofibroblasts के अलगाव, यकीनन सबसे प्रासंगिक प्रयोगात्मक डेटा प्रदान करता है. हम यू हो सकता है कि एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक का वर्णनमाउस और मानव पेट के ऊतक दोनों से प्राथमिक myofibroblasts अलग करने के लिए tilized. ये अलग कक्षों subepithelial आंतों myofibroblasts साथ संगत अल्फा चिकनी पेशी actin और vimentin पॉजिटिव, और desmin नकारात्मक होने का लक्षण वर्णन किया गया है. प्राथमिक myofibroblast कोशिकाओं सेल संस्कृति में बड़े और मार्ग की एक सीमित संख्या में प्रायोगिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
जठरांत्र (सैनिक) पथ समारोह के नियमन mucosal परत और उसके अंतर्निहित mesenchyme के बीच जटिल, गतिशील बातचीत शामिल है. इन मुलाकातों सामान्य रूप से homeostasis को बनाए रखने के लिए की सेवा भी है लेकिन वैकृत शर्तों 1 के तहत रोग राज्यों के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. Myofibroblasts mucosal उत्थान, मरम्मत, और फाइब्रोसिस 2 शामिल है कि महत्वपूर्ण सैनिक पथ प्रक्रियाओं की एक संख्या को विनियमित करने के लिए सेल subpopulations आसपास के साथ एक पैराक्राइन फैशन में संवाद है कि उपकला परत को आधारस्थित स्थित stromal कोशिकाओं के एक subpopulation हैं.
यह सीटू myofibroblasts में प्राथमिक की विशेषताओं के कई शेयरों क्योंकि 18Co सेल लाइन व्यापक रूप से myofibroblast समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक मानव colonic myofibroblast सेल लाइन का एक उदाहरण है. ये प्रोटीन एक चिकनी पेशी actin की अभिव्यक्ति (α-SMA) और vimentin, साथ ही एक नंबर की अभिव्यक्ति में शामिलऐसे epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर, या lysophosphatidic एसिड 3,4 के लिए रिसेप्टर्स के रूप में कोशिका की सतह रिसेप्टर्स की. क्योंकि इन साझा ultrastructural विशेषताओं, साथ ही जीवविज्ञान कार्य 5 में समानता की, 18Co सेल लाइन सूजन आंत्र रोग या कोलोरेक्टल कैंसर 3,6 के रूप में कई रोग राज्यों के संदर्भ में myofibroblast समारोह का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, एक सेल लाइन का उपयोग करते समय निहित सीमाओं और चिंताएं हैं. ये विकास दर और अन्य सेल आबादी के साथ बातचीत सहित सेल के phenotype और जीवविज्ञान कार्य, फेरबदल, प्राथमिक कोशिकाओं से कोशिका लाइनों को अलग करता है कि समय के साथ genotypic अस्थिरता शामिल हैं. सेल लाइनों भी इसके उपयोग के लिए एक प्रमुख सीमा है जो सैनिक microenvironment (उपकला, stromal, और संवहनी घटक), के सामान्य घटकों की कमी है. इसलिए, प्रयोगात्मक सेल लाइन अनुसंधान से निष्कर्ष निकाला आरआई को कम करने के लिए आगे सत्यापन की आवश्यकताअशुद्ध अर्थ के एस.
प्राथमिक myofibroblasts एक सेल लाइन 7 में पहचान की प्रयोगात्मक निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए मानव और माउस पेट के ऊतकों से प्राप्त किया जा सकता है. विधि मूल रूप से महीदा, एट अल. 8 द्वारा वर्णित है, और हमारे प्रोटोकॉल माउस और मानव पेट के 9 से प्राथमिक myofibroblasts अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि बहुत अच्छी तरह से वर्णित तकनीकों में से एक है. Colonic रोग के किसी भी माउस मॉडल के लिए, इस तकनीक वे पड़ोसी कोशिकाओं के साथ बातचीत कैसे अध्ययन या सामान्य या नैदानिक सैनिक 10,11 प्रक्रियाओं दोनों में योगदान के लिए प्राथमिक myofibroblasts अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तकनीक myofibroblasts चिकित्सा, फाइब्रोसिस, और कोलोरेक्टल adenomas और कार्सिनोमा के विकास mucosal के लिए योगदान कैसे अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्राथमिक myofibroblasts भी सौम्य (सूजन आंत्र रोग, strictures, विपुटीप्रदाह) या घातक ग के लिए आपरेशन के समय में resected किया गया है कि मानव पेट के ऊतकों से प्राप्त किया जा सकता हैonditions. मानव और माउस पेट के ऊतकों से अलग प्राथमिक कोशिकाओं सेल संस्कृति में बड़े और मार्ग की एक सीमित संख्या में उपयोग किया जा सकता है.
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Protocol
1. पेट के ऊतक प्राप्त
माउस
तर्क और अनुसंधान के उद्देश्यों का ब्यौरा, पशु प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल, प्रस्तुत और पशु अनुसंधान पर्यवेक्षण के हमारे संस्थागत कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था.
- ग्रीवा अव्यवस्था के बाद साँस isoflurane के साथ माउस euthanize.
- एक उदर midline चीरा, दूर छोटी आंत वापस लेना और पेट की पहचान. Laterally मूत्राशय और गर्भाशय (अगर मौजूद है) वापस लेना और जघन हड्डी की पहचान और मलाशय को बेनकाब करने के लिए ठीक कैंची से काटा.
- पेट के बंद मलाशय के पृष्ठीय अन्त्रपेशी काटना और गुदा से cecum करने के लिए पेट के लामबंद, और छोटी आंत से पेट के काट के लिए यह आड़ा.
- ठंडा फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) में नमूना रखें.
- ठंडा पीबीएस के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें और पेट ope कटौती तो, इसकी सामग्री को खाली करने के लिए कई बार लुमेन बृहदान्त्र फ्लशn लंबाई के लिहाज से कैंची का उपयोग.
- ठंडा पीबीएस के 20 मिलीलीटर युक्त एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पेट रखें. पेट के किसी विशेष उन्मुखीकरण में रखा जाना जरूरी नहीं है. द्रव कोई बात कण के साथ स्पष्ट है जब तक पीबीएस जगह से पेट धो लें.
मानव
इस ऊतक के साथ ही संभावित जोखिम और लाभ का आकलन प्राप्त करने के महत्व का ब्यौरा, शल्य चिकित्सा रोगियों से मानव ऊतक प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल, प्रस्तुत और मानव अनुसंधान संरक्षण कार्यक्रम के बारे में हमारी संस्थागत कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था.
- एक कोलोरेक्टल सर्जन के साथ अनुसंधान सहयोग अपने अनुसंधान के लिए मानव ऊतक प्राप्त करने के लिए सक्षम होने के लिए आवश्यक है. मानव पेट के ऊतक प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत की और अपने संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए.
- लिखित सूचित सहमति से पहले शल्य प्रक्रिया से रोगी को प्राप्त किया जाता है.
- सर्जन स्टैंड में एक बृहदान्त्र लकीर प्रदर्शन करेंगेएआरडी फैशन. पेट के रोगी से हटा दिया गया है, नमूना तुरंत विकृति के लिए लिया जाता है. वैकृत मूल्यांकन के लिए आवश्यक नहीं बृहदान्त्र दीवार के पूर्ण मोटाई खंड में 0.5 प्रदान की जाती है और तुरंत ठंडा पीबीएस पर रखा गया है. यह नमूना पेट के अन्त्रपेशी शामिल नहीं होना चाहिए, और वसा की मौजूदगी पाचन प्रक्रिया को प्रभावित करेगा, क्योंकि आंत्रावरण सम्बन्धी उपांग, के रूप में अच्छी तरह से हटा दिया जाना चाहिए.
2. उपकला कोशिकाओं उघाड़ना
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में HBSS में 5 मिमी EDTA (कमरे के तापमान) के 25 एमएल में पूरे माउस पेट के सेते हैं. 15 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस मिलाते हुए हवा में स्नान (250 आरपीएम) में शंक्वाकार ट्यूब रखें. 15 मिनट के बाद, ध्यान से तरल पदार्थ डालना और 5 मिमी EDTA के 25 मिलीलीटर के साथ ट्यूब फिर से भरना, 5 washes के एक कुल के लिए दोहराएँ. मानव पेट के लिए, पैथोलॉजिस्ट से पेट के दीवार की एक आधा इंच पट्टी प्राप्त करने के बाद चार बराबर आकार के टुकड़ों में कैंची से पेट के काटा. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में टुकड़े की दो, जगह औरएक अलग 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पेट के ऊतकों के शेष दो टुकड़े जगह है. तो ऊपर वर्णित के रूप में, HBSS में 5 मिमी EDTA के 25 मिलीलीटर के साथ सेते हैं और washes प्रदर्शन करते हैं.
- ठंडा पीबीएस के 20 मिलीलीटर में दो बार पेट के कुल्ला.
- RPMI-5 की 20 मिलीलीटर, dispase की 10 यू, और collagenase डी के 2,000 यू (कमरे के तापमान) युक्त एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में माउस पेट के ऊतक रखें. मानव पेट के ऊतकों के लिए, dispase और collagenase के दो बार राशि (20 यू dispase, 4000 यू collagenase डी) का उपयोग करें.
- (क्षैतिज रखा, तो बहुत ज्यादा वेंटिलेशन और कोशिका क्षति है) खड़ी उन्मुख एक 37 डिग्री सेल्सियस मिलाते हुए हवा में स्नान में ट्यूब रखें. को 60 मिनट के लिए 250 rpm पर हिला. Dispase और collagenase विकास के लिए जोखिम के बाद, पेट के ऊतकों को पचाने में शुरू होगा और पेट के ऊतकों रेशेदार देखने के लिए शुरू हो जाएगा. यह आमतौर पर लगभग 30 मिनट लगते हैं. पेट के इस स्वरूप है, एंजाइमों से पेट के हटा दें.
- ऊतक को तोड़ने के लिए ऊपर और नीचे 2-4 बार प्रत्येक ट्यूब हिला. पी5 मिनट के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस) में 200 XG पर ऊतक Ellet. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला बंद डालना और त्यागें.
3. Myofibroblast अलगाव और संस्कृति
- 10 मिलीलीटर ACK lysis बफर (47 डिग्री सेल्सियस) जोड़कर प्रत्येक गोली Resuspend. अपकेंद्रित्र फिर 5 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 200 XG पर, टपकना और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- एक विंदुक के साथ 10 मिलीलीटर RPMI-5 जोड़कर प्रत्येक गोली Resuspend.
- एक 100 मिमी टीसी इलाज डिश में एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग कर एक 70 माइक्रोन जाल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन (5 एमएल) के आधे से गुजरती हैं. फिर RPMI-5 के एक अतिरिक्त 15 मिलीलीटर जोड़ें. एक अलग 100 मिमी टीसी इलाज डिश में सेल निलंबन के शेष 5 मिलीलीटर से दोहराएँ. एक माउस बृहदान्त्र इसलिए दो 100 मिमी टीसी इलाज व्यंजन निकलेगा. मानव पेट के ऊतकों में से एक आधा इंच पट्टी चार 100 एमएम तृकां का इलाज व्यंजनों की कुल निकलेगा.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 10% सीओ 2 इनक्यूबेटर में टिशू कल्चर व्यंजन रखें संस्कृति की स्थिति में एक ही रहे चया माउस और मानव प्राथमिक कोशिकाओं.
- 3 घंटा बाद, धीरे HBSS के दो परिवर्तन के साथ गैर पक्षपाती कोशिकाओं से धो लें. मलबे फ्लोटिंग धीरे से धोया जाना चाहिए. पक्षपाती कोशिकाओं उपकला कोशिकाओं, मैक्रोफेज और myofibroblasts से बना रहे हैं. एक सप्ताह के बाद बोने, केवल डिवाइड myofibroblasts, मैक्रोफेज और उपकला कोशिकाओं पहले पारित होने के बाद senesce. ताजा RPMI-5 जोड़ें और सेल संस्कृति में कोशिकाओं को विकसित.
- कोशिकाओं 5 मिनट के लिए trypsinization द्वारा passaged हैं और 2:1 विभाजित कर रहे हैं.
लघुरूप
HBSS: हांक संतुलित नमक समाधान, RPMI-5: Roswell पार्क मेमोरियल इंस्टिट्यूट ऑफ मीडिया, एसीके: अमोनियम क्लोराइड, पोटेशियम, एफसीएस: भ्रूण बछड़ा सीरम, टीसी का इलाज: टिशू कल्चर इलाज
समाधान
एसीके lysis बफर - (4.15 छ एनएच 4 सीएल, 0.5 ग्राम KHCO 3, 18.6 मिलीग्राम ना 2 EDTA, 400 मिलीलीटर एच 2 हे, 1 एन एचसीएल के साथ 7.2-7.4 पीएच को समायोजित). फ़िल्टर sterilizई में एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से 4 डिग्री सेल्सियस RPMI-5 - (500 मिलीलीटर बनाने के लिए: 454.5 मिलीलीटर RPMI, 25 एमएल FCS, 5 एमएल 200 मिमी एल glutamine, 5 एमएल 1 एम HEPES, 7.4 पीएच, 5 मिलीलीटर 100 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 5 एमएल 100x पेन Strep, पीबीएस में 500 मिलीलीटर 50 मिमी बी इ).
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Representative Results
एक बार अलग, प्राथमिक मानव myofibroblasts सेल संस्कृति में विकसित और (बीतने 4 तक) मार्ग की एक सीमित संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है. इन कोशिकाओं, आंतों subepithelial myofibroblasts 5,7 के साथ लगातार एक चिकनी पेशी actin और vimentin सकारात्मक जा रहा है के रूप में होती है, और desmin नकारात्मक (चित्रा 1 ए) कर रहे हैं. उन्होंने यह भी एक विशेषता तारामय आकारिकी (चित्रा 1 बी) है. प्राथमिक myofibroblasts तो एक सेल लाइन में पहचान की प्रयोगात्मक निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन TNF-α (10 एनजी / एमएल) EGF रिसेप्टर अभिव्यक्ति की upregulation प्रेरित और इन कोशिकाओं 7 में संकेत है कि प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया गया था. Upregulated EGF रिसेप्टर अभिव्यक्ति और संकेतन शुरू में पहले उल्लेख किया है मानव colonic myofibroblast सेल लाइन 18Co (चित्रा 2) का उपयोग पाया गया था. चित्रा 2A में, हम करने के लिए 18Co कोशिकाओं की है कि जोखिम को प्रदर्शित TNF-45, EGF रिसेप्टर अभिव्यक्ति में एक समय पर निर्भर वृद्धि हुई. यह इन कोशिकाओं में बढ़ाया EGF प्रेरित कॉक्स -2 अभिव्यक्ति और p42/44 MAPK phosphorylation (चित्रा 2 बी) के साथ सहसंबद्ध. इन प्रयोगात्मक निष्कर्षों को मान्य करने के लिए, प्रयोगों कोलोरेक्टल कैंसर के रोगियों की शल्य चिकित्सा resected बृहदान्त्र से अलग प्राथमिक मानव myofibroblasts प्रयोग दोहराया गया. चित्रा -2 और 2 डी में दिखाया गया है, प्राथमिक मानव myofibroblasts बारीकी से शुरू में 18Co सेल लाइन 7 में पहचान की प्रयोगात्मक निष्कर्ष नकल.
चित्रा 1. प्राथमिक myofibroblasts मानव पेट के ऊतक 7 से अलग किया जा सकता है. पृथक प्राथमिक कोशिकाओं (लगातार एक-SMA और vimentin सकारात्मक (चित्रा 1 ए) के हैं कि एक myofibroblast तरह फेनोटाइप का प्रदर्शन और एक तारामय आकारिकी का प्रदर्शन 
चित्रा 2. एक सेल लाइन में प्रयोगात्मक निष्कर्ष प्राथमिक मानव myofibroblast कोशिकाओं 7 का उपयोग कर पुष्टि कर रहे हैं. 18Co कि TNF-α प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था मानव colonic myofibroblast सेल लाइन इन कोशिकाओं में EGF रिसेप्टर अभिव्यक्ति और संकेतन की upregulation (2A चित्रा) को प्रेरित करता है. EGF रिसेप्टर अभिव्यक्ति के इस upregulation EGF के लिए बाद में जोखिम बढ़ाया p42/44 MAPK phosphorylation और कॉक्स -2 अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व किया जहां चित्रा 2B में दिखाया गया है, बढ़ाया EGF रिसेप्टर संकेतन के साथ जुड़े थे. इन प्रभावों को पूरी तरह से EGF रिसेप्टर अवरोध करनेवाला AG1478 साथ हिचकते थे. कोलोरेक्टल कैंसर के रोगियों की शल्य चिकित्सा resected बृहदान्त्र से अलग प्राथमिक मानव myofibroblasts इन प्रयोगात्मक निष्कर्षों की पुष्टि (आंकड़े -2 सीऔर 2 डी). ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा = TNF-α, EGFR = EGF रिसेप्टर, एजी = AG1478, कॉक्स -2 = cyclo-oxygenase-2. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें. 
चित्रा 3. प्राथमिक myofibroblasts माउस पेट के ऊतकों से अलग किया जा सकता है. प्राथमिक माउस myofibroblast कोशिकाओं की एक 10x देखें. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
माउस या मानव बृहदान्त्र या तो उपयोग करते समय सामान्य तकनीक के समान है. इस तकनीक को भी छोटी आंत से myofibroblasts अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 1 से myofibroblasts के अलगाव के लिए विशिष्ट विवरण. माउस और 2. मानव पेट के नीचे चर्चा कर रहे हैं.
1. माउस आंतों
माउस बृहदान्त्र की सिंचाई बृहदान्त्र के एक छोर से 16 जी पॉपर कुंद अंत सुई, में एक 4 संलग्न द्वारा मदद की है. लंबाई में पेट के काटने जब यह भी मदद करता है. आप सुई पर पेट के ऊतक accordion कर सकते हैं, तो तेज अंत के साथ कैंची से एक टिप जगह और लंबाई में इसे खोलने के लिए जबकि काटने कैंची बढ़त पर पेट के ऊतक स्लाइड.
2.1 चरण में, यह मृत कोशिकाओं से परमाणु सामग्री सेल clumping को जन्म दे सकता है समझने के लिए महत्वपूर्ण है. DNase (50 मिलीग्राम / एमएल) के अलावा इस समस्या का समाधान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
सबसे महत्वपूर्ण कदम 2.4 कदम है. एक सीए रखेंपेट के ऊतकों की reful देखो. पेट के रेशेदार देखने के लिए शुरू होता है, एंजाइमों से पेट के हटा दें. आप पूरे 60 मिनट के लिए पेट के सेते की जरूरत नहीं है. पेट के ऊतक भी लंबे समय के लिए dispase और collagenase डी के संपर्क में है, तो कोशिकाओं मर जाएगा. यह एक कम सेल उपज में परिणाम होगा कि एक आम गलती है.
कोशिकाओं के संक्रमण एक आम समस्या है. सावधान तकनीक, उचित धोने और फ़िल्टरिंग सेल संस्कृति काम के लिए इस्तेमाल मानक बाँझ तकनीक के साथ, संक्रमण के जोखिम को कम कर देंगे.
2. मानव बृहदान्त्र
एंजाइमों के साथ ऊष्मायन के लिए समय की लंबाई पचा जा रहा है कि नमूना के आकार पर निर्भर करता है. हम आम तौर पर मानव बृहदान्त्र दीवार का एक आधा इंच पूर्ण मोटाई पट्टी प्राप्त करते हैं. मानव पेट के ऊतकों से myofibroblasts अलग जब 2.3 कदम में एक संशोधन है. 2.3 कदम के लिए, मानव पेट के लिए आप dispase की राशि (20 यू) और सह डबल चाहिएllagenase डी (4000 यू) का इस्तेमाल किया. पेट के एक भी बड़ा खंड एक लंबी ऊष्मायन समय की आवश्यकता होगी. इसके अलावा, एंजाइमों की विशिष्ट गतिविधि के बहुत से भिन्न हो सकते हैं कि मन में रखना है, तो आप उसके अनुसार ऊष्मायन समय समायोजित करने के लिए हो सकता है.
प्राथमिक माउस और मानव myofibroblasts दोनों के लिए, अलग कक्षों कोशिकाओं की पवित्रता के लिए मूल्यांकन करने के लिए और कोशिकाओं myofibroblast की तरह कर रहे हैं कि इस बात की पुष्टि करने के लिए 0nce संस्कृति में विकसित मूल्यांकन किया जाना चाहिए. इस immunohistochemical धुंधला (मार्कर myofibroblast के लिए एंटीबॉडी एक चिकनी पेशी actin और vimentin शामिल सहित तकनीक की एक किस्म के साथ किया जा सकता है, CD68 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी मैक्रोफेज के लिए विशिष्ट है, CD31 endothelial कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है, और CD45 प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है; ई cadherin और विभिन्न cytokeratins के लिए एंटीबॉडी उपकला कोशिकाओं के लिए विशिष्ट हैं. mRNA अभिव्यक्ति भी आरटी पीसीआर 12 के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. प्रवाह cytometry भी सेल विश्लेषण 13 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इन विट्रो और सह संस्कृति प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्राथमिक कोशिकाओं को भी सेल सेल बातचीत 14 अध्ययन करने के लिए चूहों के चमड़े के नीचे ऊतक में प्रत्यारोपित किया जा सकता है. भविष्य अनुप्रयोगों आनुवंशिक हेरफेर निम्नलिखित माउस colonoscopy उपयोग एक syngeneic माउस के पेट के दीवार में प्राथमिक myofibroblasts के फिर से आरोपण शामिल हो सकता है.
मानव और माउस बृहदान्त्र से प्राथमिक myofibroblasts अलग करने के लिए वैकल्पिक तरीकों का एक नंबर भी वर्णन किया गया है. दो नीचे सूचीबद्ध हैं:
- महीदा, एट अल. हूँ. जे Physiol. 273 G1341-1348, (1997).
- डे वेवर, एट अल. इंट. जे Oncol. 39, 393-400, (2011).
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम के जे के लिए स्वास्थ्य अनुदान 5KO8DK085136-02 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
References
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