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Neuroscience

Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias

Published: August 7, 2013 doi: 10.3791/50708
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

Nós descrevemos um método analítico para estimar o tempo de vida de glutamato em membranas astrocitários de registros eletrofisiológicos de correntes transportador de glutamato em astrócitos.

Abstract

A maior densidade de transportadores de glutamato no cérebro é encontrada em astrócitos. O glutamato transportadores acoplar o movimento de glutamato através da membrana com o co-transporte de Na + e 3 1 de H + e a contra-transporte de K + 1. A corrente estequiométrica gerado pelo processo de transporte pode ser monitorizado com gravações de célula inteira de patch-clamp de astrócitos. O curso de tempo da corrente registada é moldada por o curso de tempo do perfil de concentração de glutamato que astrócitos são expostas, a cinética de transportadores de glutamato, e as propriedades das membranas passivas electrotonic astrocíticos. Aqui, descrevemos os métodos experimentais e analíticos que podem ser utilizados para registar as correntes do transportador de glutamato em astrócitos e isolar o curso de tempo de recarga glutamato de todos os outros factores que moldam a forma de onda das correntes de transportador astrocíticos. Os métodos descritos aqui podem ser usados ​​para estimar o tempo de vida of flash-uncaged e glutamato sinapticamente lançado em membranas astrocitários em qualquer região do sistema nervoso central durante a saúde ea doença.

Introduction

Os astrócitos são um dos tipos de célula mais abundante no cérebro com uma morfologia em forma de estrela e as saliências de membranas finas que se estendem ao longo do neuropil e alcançar vizinha contactos sinápticos 1,2. Membrana celular dos astrócitos é densamente embalado com moléculas transportador de glutamato 3. Sob condições fisiológicas, os transportadores de glutamato rapidamente ligar glutamato no lado extracelular da membrana e transferi-lo para o citoplasma da célula. Ao fazer isso, os transportadores mantêm a concentração basal baixa de glutamato no espaço extracelular 4. Transportadores de glutamato em finas processos astrocitários adjacentes sinapses excitatórias são idealmente posicionado para ligar glutamato liberado durante eventos sinápticos, pois difunde para longe da fenda sináptica. Ao fazer isso, os transportadores também limitar spillover glutamato para peri e regiões extra-sinápticos e em sinapses vizinhas, reduzindo a propagação espacial do sinal excitatórios no cérebro 5-7.

Transporte do glutamato é um processo eletrogênica estequiometricamente acoplado ao movimento de 3 Na + e H + 1 ao longo do seu gradiente electroquimico e ao contra-transporte de K + 1 8. Transporte de glutamato está associado (mas não estequiometricamente acoplado a) uma condutância aniônica permeável ao SCN - (tiocianato)> NO 3 - (nitrato) ≈ ClO 4 - (perclorato)> I -> Br -> Cl -> F -, não a CH 3 SO 3 - (metano-sulfonato), C 6 H 11 O 7 - (gluconato) 9-11. Ambas as correntes (estequiométrica e não-estequiométrico) podem ser gravados pela obtenção de gravações de patch-clamp de célula inteira de astrócitos, identificados visualmente sob iluminação Dodt ou infra-vermelho contraste de interferência diferencial (IR-DIC), em Agudode e fatias de cérebro 12. O componente estequiométrica da corrente associado com o transporte do glutamato através da membrana pode ser isolado utilizando CH 3 SO 3 - ou C 6 H 11 O 7 - soluções intracelulares base e pode ser evocada por glutamato flash uncaging em astrócitos 13,14, ou ativando a liberação de glutamato de sinapses vizinhas, tanto eletricamente 12 ou com um controle optogenetic alvo.

O decurso de tempo do componente estequiométrica do transportador de corrente é formada por toda a vida do perfil de concentração de glutamato na astrocíticos membranas (isto é, passe glutamato), a cinética de transportadores de glutamato, as propriedades de astrócitos membrana passiva, e durante estimulações sinápticos, pela sincronia de liberação de glutamato através das sinapses ativadas 13. Aqui vamos descrever em detalhes: (1) uma aprox experimentaloach para isolar o componente estequiométrica de correntes de transportador de glutamato a partir de células inteiras gravações de patch-clamp de astrócitos de rato utilizando fatias de hipocampo agudas como por exemplo a preparação experimental, (2) uma abordagem analítica para derivar o tempo de curso do apuramento glutamato destas gravações 13, 14. Estes métodos podem ser usados ​​para registar e analisar as correntes do transportador de glutamato a partir de astrócitos em qualquer região do sistema nervoso central.

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Protocol

1. Slice Preparação

  1. Prepare uma solução de 500 ml de corte / armazenamento contendo (em mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 de CaCl2, 1,3 MgSO4 · 7H 2 O, 4 MgCl2, 26,2 NaHCO3, 1 NaH 2 PO 4, e 22 de glucose, 320 mOsm, pH 7,4
  2. Usar um copo de 250 ml para preparar uma câmara de imersão para as fatias, encher com 200 ml de solução de cortar / armazenamento, aquecê-lo num banho de água a 34 ° C e borbulhar com 95% de O2, 5% de CO 2.
  3. Manter a solução remanescente que corta / armazenamento numa garrafa de vidro a 4 ° C.
  4. Utilização de um adesivo de cianoacrilato para anexar um pequeno bloco de agar (6%, preparado em ACSF) no suporte de amostras vibratome e armazená-lo a 4 ° C.
  5. 30 min antes de iniciar o corte, coloque o frasco de vidro contendo a solução de armazenamento / corte em um balde com gelo e borbulhar com 95% de O2, 5% de CO 2.

  1. Anestesiar o rato (P14-21, C57BL / 6) com halotano / isoflurano (isoflurano foi relatado para aumentar a captação de glutamato astrocítica 15), decapitá-lo e mergulhar a cabeça em um copo de 50 ml contendo solução oxigenado / storage, o frio de cortar.
  2. Realizar a dissecação do cérebro em um bloco de gelo envolto com toalhas de papel e armazenadas a -20 ° C.
  3. É um bisturi para fazer uma incisão na pele sagital médio no lado dorsal da cabeça, da extremidade frontal ao caudal, e expor o crânio.
  4. Coloque a lâmina de corte inferior de um pequeno par de tesouras cirúrgicas no buraco occipital e fazer dois cortes, para a esquerda e do lado direito (45 °).
  5. Cortar o crânio ao longo da linha média sagital, a partir da cauda para a extremidade dianteira.
  6. Remover o cérebro com uma espátula e mergulhá-lo em oxigenado, frio corte / storage solução quediante.
  7. Com um bisturi, fazer cinco cortes para: (1) remover os bulbos olfatórios e do córtex frontal, (2) retirar o cerebelo, (3) retirar a esquerda e (4) lobos temporais direito; (5) separar os dois hemisférios cerebrais com um corte sagital médio.
  8. Dab as duas partes do cérebro com toalhas de papel para remover qualquer solução em excesso.
  9. Cole a superfície lateral de cada secção do cérebro para a placa de base vibratome frio do lado dorsal do cérebro deve estar voltada para a lâmina vibratome, o lado ventral do cérebro deve estar em contacto com o bloco de agar, para longe da lâmina vibratome.
    Nota: para obter as fatias mais alta qualidade, é importante que as duas partes do cérebro estão firmemente colado à placa de base vibratome. Para fazer isso, o uso de um adesivo de cianoacrilato que não é demasiado líquido e que não seque demasiado depressa.
  10. Fixe a placa de base vibratome para a câmara de dissecação, definir o dia fatiaickness a 250 mM e ajustar a largura da lâmina de execução. Prossiga com a corte.
    Nota: se tudo está correctamente orientado, o vibratome deve ser cortando fatias a partir da parassagitais dorsal e ventral, para a partir da média para o lado lateral do cérebro.
  11. Uma vez que a lâmina tenha passado através do córtex e hipocampo, usar um bisturi para cortar o córtex / hipocampo do mesencéfalo e colocar cada fatia na câmara de imersão a 34 ° C.
  12. Descarte o primeiro par de fatias. Tipicamente, 12 fatias (250 um de espessura) pode ser obtido a partir de um cérebro de rato P14-21.
  13. Manter as fatias a 34 ° C durante 30 minutos e deixar arrefecer até à temperatura ambiente durante 30 min antes de as utilizar para as gravações electrofisiologia.

2. Identificação astrócitos e gravações

  1. Prepara-se uma solução interna contendo (em mM): 120 KCH 3 SO 3, 10 EGTA, 20 HEPES, 2 MgATP, 0,2 NaGTP,5 QX-314Br, e 5 de NaCl, 290 mOsm, pH 7,2.
  2. Prepara-se uma solução de gravação extracelular contendo (em mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 de CaCl2, 1,3 MgSO4 · 7H 2 O, 1 MgCl2, 26,2 NaHCO3, 1 NaHPO 4 e 22 de glucose, 300 mOsm, pH 7,4 , saturado com 95% O2, 5% de CO 2.
  3. Adicionar os seguintes fármacos para a solução de gravação extracelular, para bloquear a activação de GluA, Glun, mGluRII, mGluRIII, GABA A, o GABA B, e os receptores de adenosina A1 (em mM): 10 2,3-Dioxo-6-nitro-1, 2,3,4-tetra-hidrobenzo [ƒ] quinoxalina-7-sulfonamida sal dissódico (NBQX), 10 (RS) -3 - (2-carboxypiperazin-4-il)-propil-1-fosfónico (CPP), (2S )-2-amino-2-[(1S, 2S)-2-carboxycycloprop-1-il] -3 - (Xanth-9-il) propanóico sal dissódico do ácido (LY341495), 100 (R, S)-α- metilserina-O-fosfato (DIP), 100 picrotoxina, 5 3 - [[(3,4-diclorofenil) metil] amino] propil] dietoximetil) fosfínico (CGP52432), 18-ciclopentil-1 ,3-dipropilxantina (DPCPX).
  4. Ajustar a temperatura da solução extracelular na câmara de gravação, as temperaturas típicas situam-se entre 34-36 ° C.
  5. Prepare-se eletrodos de patch-clamp de borosilicato capilares de vidro (R ≈ 2,5 mohms) usando um dual-fase, vidro micro-pipeta extrator.
  6. Pegue uma das fatias e coloque-o na câmara de gravação. Segurá-lo com uma harpa de metal feito com fio de platina e cordas de nylon.
  7. Inspecione visualmente as fatias sob Dodt iluminação ou IR-DIC. Os astrócitos podem ser identificados pelo seu órgão de células pequenas (Ø = 10 mm) e núcleo proeminente (Figura 1).
  8. Para estímulos sinápticos, coloque um eletrodo de aço inoxidável bipolar, ~ 100 mm de distância do astrócitos que pretende corrigir.
  9. Corrigir o astrócitos e quebrar na configuração de célula inteira pela aplicação de uma sucção muito gentil.
    Nota: Os astrócitos normalmente têm baixa resistanc entradae (~ 10 M), o potencial de membrana em repouso hyperpolarized (~ -90 mV), e nenhuma atividade de fuzilamento. Os astrócitos são mantidos em seu potencial de membrana em repouso durante todo o experimento em modo de tensão-clamp (ou seja, a corrente de retenção deve ler 0 aa). Antes de cada estimulação, um passo de 10 ms hiperpolarizante tensão (-3 mV) é usado para monitorizar a resistência em série e de entrada do astrócito.
  10. Descartar as gravações se as alterações da resistência da série> 20% ou, se o potencial de membrana se torna despolarizada astrócitos. O potencial da membrana de astrócitos pode ser medido diretamente, passando de tensão-clamp para o modo atual-clamp. Como alternativa, enquanto em modo voltage-clamp, o potencial de membrana pode ser controlada pela leitura do valor do potencial de realização que resulta em 0 pA corrente de retenção.
  11. Se forem empregados estímulos sinápticos, os estímulos alternados individuais e pares (por exemplo, 100 ms de intervalo), a cada 10-20 seg.
  12. Para UV experim fotóliseentos, ligar uma lâmpada de Xe uncaging à porta do microscópio de epifluorescência, e adicionar o composto enjaulados à solução extracelular. Transportador de corrente de 100 pA ~ amplitude pode ser obtido quando flash uncaging 100 uM MNI-L-glutamato em todo o campo de visão (Ø = 662,5 mM quando utilizando uma objectiva de 40X 14). Estímulos alternados com o caminho da luz aberta e bloqueada, cada 10-20 seg.
  13. Evocar transientes glutamato e correntes transportador de registo, em condições de controlo e na presença de uma concentração sub-saturante do glutamato transportador antagonista de D, L-treo-β-Benzyloxyaspartic ácido de amplo espectro (TBOA, 10 uM), para reduzir a amplitude da corrente transportador para, pelo menos, 30% do seu valor de controlo (ver secções 4, 5), ou na presença de uma elevada concentração de TBOA (50-100 uM), para bloquear as correntes do transportador completamente e isolar o sustentada K +-corrente (ver secção 3) .

3. PharmacIsolamento ological do sustentado K +-corrente

  1. Grave astrocíticos correntes em condições de controlo e na presença de um nível elevado, a concentração saturante de TBOA (50-100 uM).
  2. Média de pelo menos 20 varrimentos em TBOA (50-100 uM).
  3. Coloque os traços médios obtidos em 3.2 com a função:
    Equação 1
    Nota: o componente TBOA insensível (isto é, aquele que é registada na presença de TBOA (50 - 100 um)) representa a constante K +-corrente. O decurso de tempo é aproximada pela função monoexponencial descrito acima.
  4. Repita este ajuste em diferentes astrócitos e obter um valor médio de Τ origem (ou seja, o tempo médio de aumento sustentado do K +-corrente (ver seção 5)).

4. Eusolation da Parcela Facilitado das correntes Transporter sinapticamente-ativada (fSTCs)

  1. Média de pelo menos 20 varrimentos obtidos com estímulos emparelhados, em condições de controlo e em TBOA (10 mM) (Figura 2a esquerda).
  2. Média de um número idêntico de varrimentos obtidos com correntes individuais, em condições de controlo e em TBOA (10 mM) (Figura 2a meio).
  3. Compare a amplitude da resposta média atual para o degrau de tensão mV -3 nos quatro traços médios (controle de pulso único, controle pareado-leguminosas, TBOA pulso único, TBOA emparelhado-pulsos).
  4. Se a amplitude da resposta de corrente é a mesma em todos os quatro traços, prosseguir para o passo 4.7.
  5. Se a amplitude da resposta média de corrente é diferente em qualquer uma das quatro traços, verificar que todos os traços individuais eram adequadas para serem incluídas em média.
  6. Se a amplitude da corrente média é diferente em qualquer uma das quatro traços, mas todos emvestígios dividual são apropriados para serem incluídos na média, verificar que, em cada traço do tamanho das escalas FSTC linearmente com o tamanho da resposta da corrente do passo de teste de tensão. Se este for o caso, dimensionar todos os vestígios com relação um ao outro de modo que as respostas actuais para o passo de tensão do teste são todos iguais em amplitude.
    Nota: as condições de gravação descrito aqui (ie intracelular CH 3 SO 3 - ou C 6 H 11 O 7 -), estímulos sinápticas de axônios excitatórios geram correntes astrocitárias formas de onda complexas constituídas por uma corrente rápida elevação transitória estequiométrica interior e uma lenta -crescente, sustentada dentro K +-K + atual refletindo re-equilíbrio no espaço extracelular seguindo propagação do potencial de ação ao longo de axônios vizinhos. É fundamental remover esta sustentada K +-corrente, como qualquer corrente residual conduziria a umsuperestimar de vida glutamato.
  7. Subtrair o traço médio obtido com estímulos individuais do traço médio obtido com estímulos emparelhados (Figura 2a direita). Este passo permite que a estequiométrica e isolando o sustentada K +-corrente evocada pelo segundo estímulo.
  8. Deslocar o rastreio média obtida com estímulos por um único intervalo de tempo que coincide com o intervalo inter-pulso utilizada para entregar-pulsos emparelhados (isto é, 100 ms) (Figura 2b).
  9. Subtrair o tempo mudou resposta média obtida com estímulos individuais a partir da resposta média para o segundo estímulo obtido em 4.7 (Figura 2c). Este passo facilitado isola a porção da corrente evocada pelo transportador segundo estímulo (o FSTC).
  10. Na maioria dos casos, o passo anterior o remove inteiramente sustentado K +-corrente. Se for este o caso, o isolamento da FSTC está completa e pode proceed com a análise de deconvolução e tirar o curso de tempo de desembaraço glutamato de astrócitos. Em alguns casos, no entanto, uma pequena sustentado K +-corrente ainda está presente (Figura 2d), e é necessária uma análise mais aprofundada (ver seção 5).
    Nota: lembre-se que a análise descrita em 4,7-4,10 deve ser realizada sobre os traços médios obtidos em condições de controle e em TBOA (10 mM).

5. Subtração do zdustained K Residual + corrente de fSTCs

  1. Medir a amplitude do sustentado K +-corrente remanescente após realizar a análise descrita na seção 4.
  2. Escala da amplitude da função monoexponencial descrito no ponto 3.3, a amplitude do K +-sustentada residual corrente medida no ponto 5.1 (Figura 2d esquerda e do meio). Para fazer isso, na equação 3.3, definir o termo A é igual à amplitude do sustentada K +-me actualasured em 5,1 e o termo Τ elevação é igual ao valor médio de Τ aumento estimado em 3.4.
  3. Subtrair a função monoexponencial resultante da K + FSTC e sustentada de corrente obtidos em 4,10 (Figura 2d direita). Este passo completa o isolamento do FSTC.

6. Isolamento de Currents Transporter Flash-ativadas (FTCs)

  1. Média de pelo menos 20 varrimentos obtidos com o percurso da luz aberta, em condições de controlo e em TBOA (10 uM).
  2. Média de um número idêntico de varrimentos obtido com o percurso da luz fechado, em condições de controlo e em TBOA (10 uM).
  3. Compare a amplitude da resposta atual para o degrau de tensão mV -3 nos quatro traços médios (controle de pulso único, controle pareado-leguminosas, TBOA pulso único, TBOA emparelhado-pulsos).
  4. Se a amplitude da resposta de corrente é a mesma em todos os quatro traços, prosseguir para o passo 6.7.
  5. Se a amplitude da corrente média é diferente em qualquer uma das quatro traços, mas todos os traços individuais são adequados para serem incluídos na média, verificar que, em cada traço com o percurso da luz abrir o tamanho da escala da FTC linearmente com o tamanho a resposta actual para o passo de tensão do teste. Se este for o caso, dimensionar todos os vestígios com relação um ao outro de modo que as respostas actuais para o passo de tensão do teste são todos iguais em amplitude.
    Nota: nas condições de gravação descrito aqui (ie intracelular CH 3 SO 3 - ou C 6 H 11 O 7 -), os estímulos de flash gerar correntes astrocitários consistindo apenas da rápida elevação transitória corrente interna estequiométrica.
  6. Subtrair o traço média obtida com a luz path bloqueado a partir da média de rastreio obtidos com o percurso da luz aberta. Este passo permite a remoção o artefacto de estímulo e isolando os FTCs.
    Nota: a análise descrita em 6.7, deve ser realizada sobre os vestígios médios obtidos em condições de controlo e em TBOA (10 uM).

7. Análise Deconvolution

  1. Ajustar a corrente transportador (FSTC ou FTC) registrados em condições de controle (Figura 3A, à esquerda) e em TBOA (10 mM) (Figura 3a direita) e isolado como descrito nas seções 4-6, com a função multi-exponencial:
    Equação 2
  2. Criar uma função instantaneamente crescente que decai mono-exponencial de acordo com a função:
    Equação 3
    eque descreve melhor a fase de decaimento da corrente registada na TBOA transportador (10 mM) (Figura 3b).
    Nota: a função descrita no ponto 7.2 (isto é, H (t)) representa o curso de tempo de recarga glutamato de astrócitos na presença de TBOA (10 uM).
  3. Deconvolve a função monoexponencial obtido no ponto 7.2 (Figura 3b e 3c do meio) a partir do ajuste da corrente registada na TBOA transportador (10 uM), obtido no ponto 7.1 (Figura 3a direita c esquerda).
    Nota: deconvolução é uma operação matemática incluída em muitos pacotes de software de análise, como (por exemplo, Matlab, Python). Em IgorPro, o código de programação que tipicamente utilizada para executar este tipo de análise, a operação de desconvolução, podem ser eficazmente calculadas como descrito abaixo, usando transformações rápida de Fourier discreta. Em primeiro lugar, utilizar a operação de FFT para calcular o discrete transformada rápida de Fourier da função monoexponencial obtidos em 7.2 e do ajuste da corrente registada no transportador TBOA obtido em 7.1. Em seguida, utilizar a operação de IFFT para calcular a discreta inversa transformada de Fourier rápida do rácio das duas funções de FFT. A função resultante I (t) pode ser descrito como se segue:
    Equação 4
    O passo descrito em 7.3 permite a derivação do filtro do transportador de corrente em TBOA (10 mM) (Figura 3c direita). O filtro representa os factores de distorção que convertem o tempo de vida de glutamato em membranas astrocíticos na corrente transportador isolado nos pontos 4-6 (ou seja, o FSTC ou FTC).
  4. Deconvolve o filtro (Figura 3c direita, a Figura 3d meio) a partir do ajuste da corrente de transportador, em condições de controlo (Figura 3a Figura 3d esquerda).
    Nota: Esta etapa permite derivar o curso do tempo de desembaraço glutamato de astrócitos em condições de controle (Figura 3d direita). A hipótese subjacente a este passo de desconvolução é que o perfil temporal do filtro permanece inalterada em condições de controlo e em TBOA (10 uM).
  5. Para obter uma estimativa quantitativa do curso do tempo global de apuramento glutamato, calcular o baricentro (<t>) da forma de onda obtida na etapa 7.4. Isto é feito por meio do cálculo <t> como:
    Equação 5
    onde G (t) é a forma de onda obtida na etapa 7.1. Na equação acima descrita, o termo t corresponde à janela de tempo durante o qual é calculado o integral.
    Nota: quando o método foi estabelecida pela primeira vez,<t> foi calculado sobre as janelas de tempo que ficaram sem restrições 13. Esta abordagem pode ser usada, desde que a janela de integração é definido para ser maior do que a duração do alívio do glutamato e os decaimentos de forma de onda de apuramento completamente volta à linha de base. Se este não for o caso, no entanto, este método de estimativa <t> encontra algumas limitações. Por exemplo, se a forma de onda de recarga não decai exactamente volta à linha de base, em seguida, <t> aumenta com a largura da janela de integração. Para evitar qualquer fonte potencial de imprecisão na estimativa de <t>, agora calcular-lo sobre uma janela de tempo correspondente a 10% do pico da corrente de transportador, antes e após o seu início 14. A última abordagem melhora a consistência com que <t> é medido através de células. Isto vem a calhar, especialmente quando se analisa pequenos efeitos dos tratamentos farmacológicos no curso do tempo de folga.

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Representative Results

O êxito da abordagem analítica descrita aqui criticamente dependente da obtenção de registos electrofisiolicos de alta qualidade a partir de correntes de transportador astrócitos em qualquer região do sistema nervoso central. Em fatias do hipocampo do rato agudas, os astrócitos podem ser prontamente identificados em Dodt iluminação ou IR-DIC, pois o corpo de célula pequena (Ø = 10 mm) e núcleo proeminente (Figura 1). A sua morfologia distinta em forma de estrela podem ser apreciados com epifluorescência, confocal ou microscopia de laser de dois fotões, quando a adição de um fluoróforo como Alexa 594 (50 uM) à solução intracelular (Figura 1). No nível de eletrofisiologia, os astrócitos são caracterizados pela resistência de entrada baixa, o potencial de membrana hyperpolarized (~ -90 mV) e incapacidade de gerar potenciais de ação. Astrócitos geram correntes em resposta à estimulação elétrica ou optogenetic de neurônios vizinhos e fotólise UV de cacompostos ged como MNI-L-glutamato.

Correntes transportadoras astrocitárias podem ser gravados utilizando soluções internas baseadas em C + ou K +. Note-se que Cs +, K + um popular substituto, suporta o transporte de glutamato, mas diminui a taxa de ciclismo transportador de glutamato 16,17 (porque transportadores de glutamato ligam e / ou translocação Cs + através da membrana mais lentamente do que K +). Se Cs + reduz significativamente o número de transportadores de glutamato disponíveis para ligação, ele também leva a correntes transportadoras menores / mais lento do que os gravados com K + soluções internas baseadas 16,17.

Quando utilizando CH 3 SO 3 - ou C 6 H 11 O 7 - como o principal anião intracelular, a corrente gerada por transportadores de glutamato em astrócitos é devido ao movimento estequiometricamente acoplada de um glutamato, 3 NA + e K + através de uma membrana. Esta corrente estequiométrico é o único gravado a partir de astrócitos em experimentos de fotólise e nos referimos a ele como o FTC. Ao realizar experiências de fotólise, recomenda-se a estímulos alternados UV obtidos com o percurso da luz aberto e bloqueado. Os traços obtidos com o percurso da luz bloqueados são úteis para isolar o artefacto de estímulo gerado pela lâmpada de flash e podem ser subtraídos dos valores obtidos com o percurso da luz aberta para isolar perfeitamente a FTC.

A corrente registada em astrócitos quando evocando libertação sináptica do glutamato tem uma forma de onda mais complexa. É composto por um componente interno transitório rápido aumento devido à estequiometricamente acoplado glutamato atual transportador descrito acima. Além disso, ele é composto por uma lenta com fermento, sustentada dentro de K +-corrente, devido ao influxo de K + acumulado no espaço extracelular após potencial de acçãopropagação ao longo dos axônios vizinhos. Uma abordagem farmacológica pode ser utilizado para isolar a corrente do sustentada K +-corrente transportador e requer a utilização de concentrações elevadas do largo espectro antagonista TBOA transportador de glutamato (100 ^ M) no final da experiência 12. O método descrito aqui utiliza uma abordagem puramente analítico para isolar a corrente do sustentada K +-corrente e, por conseguinte, permite a experiências mais curtos (Figura 2) do transportador de glutamato.

Como um primeiro passo, que intercalam estímulos individuais e pulso emparelhado sinápticas (100 ms de intervalo), a cada 10-20 segundos e média igual número de varreduras obtidas com estímulos individuais e pulso pareado. A amplitude da primeira corrente evocada pelos estímulos emparelhados deve coincidir com a amplitude da corrente evocada pelo único estímulo. Começamos esta análise subtraindo-se o atual evocada pelo único estímulo de que evocada poros estímulos emparelhados. Esta subtracção permite isolar a resposta ao segundo estímulo, o qual é também composto por um rápido aumento, transiente glutamato e um transportador de corrente lenta com fermento, sustentada K +-corrente (Figura 2a direita). Em seguida, passamos a resposta ao estímulo por um único intervalo de tempo que corresponde ao intervalo inter-pulso dos estímulos emparelhados, de modo que o tempo de aparecimento da resposta única coincide com o tempo de início da segunda resposta isolado acima (Figura 2b ). Subtraindo estas duas correntes, que isolar a parte facilitada da corrente transportadora, que aqui chamamos FSTC (Figura 2c). A cinética da FSTC são semelhantes à cinética do transportador sinapticamente activado corrente (CCT) isolado farmacologicamente com concentrações elevadas do transportador de glutamato TBOA antagonista (100 uM) 13. Por este motivo e pela simplicidade, no trabalho anterior, referiu-se ao FSTCcomo STC 13,14. Apesar de ser correntes com propriedades semelhantes, e fSTCs STCs não são a mesma corrente. Por esta razão e para a exatidão, neste trabalho, vamos nos referir a eles explicitamente como fSTCs e STCs. O método de subtracção descrito aqui permite o isolamento do precisas de fSTCs na maioria gravações. No entanto, em alguns casos, um resíduo sustentada K + actual ainda está presente. Neste caso, é necessário isolar a sustentada K +-corrente em experiências separadas utilizando elevadas concentrações de TBOA (50-100 uM). O curso de tempo da farmacologicamente isolado sustentada +-K-corrente pode ser descrita por uma função mono-exponencial na forma:

Equação 6

Ao gravar correntes astrocíticos em diferentes células, estima-se o valor médio de Τ ascensão. A seguir, createA função monoexponencial como o descrito acima, em que Τ subida corresponde ao valor médio de Τ aumento medido experimentalmente em diferentes astrócitos e A corresponde à amplitude do K +-sustentada residual actual que pretende remover (Figura 2d ).

O método que acabamos de descrever para isolar fSTCs funciona muito bem quando evocando a liberação de glutamato de facilitar as sinapses e também pode ser usado para estudar a liberação de glutamato de sinapses que sofrem depressão pulso pareado. No entanto, é de pouca utilidade quando as sinapses glutamatérgicos em estudo não apresentam qualquer forma clara de facilitação ou depressão a curto prazo. Neste caso, o isolamento farmacológica de transportadores de correntes com elevadas concentrações de TBOA (100 uM) continua a ser a solução mais viável para isolar o transportador glutamato acoplado estequiometricamente, sinapticamente evocado actual.

(ou seja, sem bloquear a totalmente). O objetivo aqui é diminuir significativamente o curso do tempo da corrente transportadora, sem perder a capacidade de distingui-lo do ruído das gravações. O pressuposto é que, na presença de uma pequena concentração de TBOA, quando a capacidade de absorção dos astrócitos é diminuída, o principal factor de moldar a decadência do transportador de corrente é a diminuição gradual da concentração de glutamato na membrana astrocitário 12,18. Nós caber o atual transporte em condições de controle e em TBOA (10 mM) com a função multi-exponencial:

"Equação

(Figura 3A). Nós aproximado a folga no TBOA glutamato (10 uM) com a função de levantar-se instantaneamente com decaimento mono-exponencial (Figura 3b) e deconvolve-lo a partir da função de multi-exponencial descrevendo o transportador de corrente em TBOA (10 uM; Figura 3c). A forma de onda resultante é o "filtro" e representa a combinação de factores que distorça (isto filtro) o perfil de concentração de glutamato na corrente transportadora (Figura 3c). Deconvolving o filtro do ajuste multi-exponencial da corrente de transportador, em condições de controlo permite estimar o decurso de tempo do perfil de concentração de glutamato na astrócitos registada em condições de controlo (Figura 3d). Para esta análise deconvolution, assumimos que a cinéticado filtro permanecem inalterados na ausência e na presença de TBOA (10 uM). Isto é um pressuposto razoável, porque todos os factores que contribuem para o filtro (ou seja, a cinética de transportadores, filtragem electrotonic, e durante estimulações sinápticos, a libertação de glutamato através assíncrona sinapses) são susceptíveis de ser influenciada pela presença de TBOA, um composto que reduz o número de transportadores disponíveis para glutamato vinculativo.

Usamos o baricentro (<t>) como uma medida do tempo de vida de glutamato em membranas astrocíticos em diferentes células. <t> Representa o "centro de massa" da forma de onda de recarga, e é sensível a alterações em ambos tempo de subida e decaimento de a forma de onda de apuramento glutamato. O centróide é expresso como:

Equação 5

class = "jove_content"> Há duas maneiras de decidir o intervalo de tempo durante o qual pode-se calcular as integrais no numerador eo denominador desta expressão. Por causa da onda de apuramento sobe e decai a zero, quando o método foi estabelecida pela primeira vez, não havia especificação feita sobre como definir a janela de integração, e de fato isso foi feito de maneira pouco rigorosa 13. Uma maneira de contornar este problema é limitar a janela de integração para o tempo que leva para chegar a uma proporção arbitrária da FTC / FSTC pico, por exemplo, 10% 14. Este critério permite que simples ser consistente ao realizar esta análise em diferentes células, aumenta a precisão das estimativas de <t> quando a forma de onda de desobstrução não perfeitamente decair para zero, e melhora a sensibilidade da análise de pequenas diferenças na depuração de onda que pode ocorrer em diferentes grupos de células.

e 1 "fo: content-width =" 3 pol "fo: src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1.jpg "/>
Figura 1. Identificação de astrócitos em fatias de hipocampo agudas. (Ab) Imagens Dodt de astrócitos do hipocampo em CA1 estrato radiatum. Sob Dodt iluminação e IR-DIC, os astrócitos podem ser identificados pelo seu corpo celular pequeno núcleo e proeminente. As setas vermelhas apontar para vários astrócitos que podem ser identificadas na preparação fatias. A seta mostra a astrócitos amarelo que foi corrigido e enchido com um corante fluorescente (ver abaixo). (Cd) imagem Dodt Overlaid das fatias de hipocampo e dois fótons dos astrócitos remendado, destacada com uma seta amarela (ab). Para este experimento, os astrócitos foram corrigidos e preenchidos com uma KCH 3 SO 3 - solução interna acrescentado baseados com Alexa 594 (50 mM). Os processos astrocíticos estender algumas dezenas de mM de distância a partir de tcorpo ele celular. As anotações da esquerda identificar os três principais camadas celulares da formação do hipocampo CA1, que pode ser reconhecida nos cortes.

Figura 2
Figura 2. Isolamento de fSTCs de correntes transportadoras sinapticamente ativados registrados em astrócitos. (Ac) Esquema das etapas de análise necessários para isolar os fSTCs das correntes transportadoras sinapticamente ativados registrados em astrócitos. (D) abordagem analítica utilizada para remover o K +-sustentado residual atual dos fSTCs (ver seção 5). Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 3 ent-width = "6.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3.jpg" />
Figura 3. Análise Desconvolução utilizado para derivar o curso de tempo de recarga glutamato de astrócitos (a) em forma mono-exponencial do FSTC / FTC isolado em condições de controlo (esquerda) e na presença de TBOA (10 fiM, para a direita).. (B) O tempo de liberação de glutamato em TBOA (10 mM) é aproximada por uma função instantaneamente, levantando-se com decaimento mono-exponencial. (C) Deconvolving o curso de tempo de recarga em TBOA glutamato (10 uM) a partir do ajuste multi-exponencial do transportador de corrente em TBOA (10 uM) permite estimar o filtro. (D) Deconvolving o filtro do ajuste multi-exponencial da corrente de transportador, em condições de controlo permite estimar o tempo de curso do apuramento glutamato de astrócitos em condições de controlo.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver a figura maior.

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Discussion

Descrevemos aqui uma abordagem experimental para obter registos electrofisiolicos de astrócitos, um protocolo de análise para isolar as correntes do transportador de glutamato em astrócitos e um método matemático para derivar o curso de tempo de depuração a partir das correntes do transportador de glutamato astrocíticos.

O sucesso da análise baseia-se na capacidade de obter alta qualidade gravações de patch clamp de astrócitos e na precisão dos algoritmos de montagem utilizadas para descrever as correntes do transportador. A análise de desconvolução baseia em duas hipóteses seguintes. (1) Os vários processos que distorcem o curso de tempo de recarga glutamato na corrente transportador experimentalmente-gravada pode ser representado como um sistema linear. Embora em termos absolutos, muitos dos fatores que as correntes transportadoras forma são sistemas não-lineares (na ligação do glutamato princípio e transporte tanto pode sofrer saturação), evidência experimental indicates que seu regime linear é amplo. Assim, o curso de tempo de correntes de transportador e de apuramento de glutamato permanece o mesmo ao longo de uma ampla gama de forças de estímulo, a probabilidade de libertação e as concentrações de glutamato 13,14,18. Embora esta aproximação parece ser legítimo para as nossas condições experimentais, devem ser validados antes de repetir esta análise em diferentes preparações experimentais. (2) As características dos filtros não são afetados pela presença de TBOA (10 mM). Esta suposição parece razoável, porque todos os factores que contribuem para o filtro (ou seja, a cinética de transportadores, filtragem electrotonic, e durante estimulações sinápticos, a libertação de glutamato através assíncrona sinapses) são susceptíveis de ser influenciada pela presença de TBOA.

Ao derivar da forma de onda a partir de glutamato de apuramento fSTCs e FTCS, obtemos dois diferentes tipos de informação. Ao analisar fSTCs, medimos o tempo que astrocytic membranas são expostas a glutamato libertado de sinapses. Evocando FTCs com iluminação UV full campo (ou seja, uncaging glutamato sobre toda a superfície astrocitária), medimos o tempo que as membranas astrocitários estão expostas a glutamato uncaged. Nestas experiências uncaging são libertadas todas as moléculas de glutamato (ou seja uncaged) ao mesmo tempo e todos os transportadores são activados ao mesmo tempo, a mesma concentração de glutamato. Portanto, analisando FTCs, podemos obter uma leitura indireta da capacidade de captação de glutamato astrocitária.

É importante notar que os métodos aqui descritos permitem estimar o tempo de curso do apuramento de glutamato, não o valor real da concentração de glutamato evocando as correntes do transportador. O decurso de tempo é uma medida de estimativa média do decurso de tempo de recarga glutamato em todas as áreas da membrana astrocitário a que têm acesso electrofisiológico: não ét sensível à heterogeneidade na captação de glutamato em locais diferentes dentro da membrana astrocítica 19. Esta informação é mais provável de ser obtida com microscopia de alta-resolução dos repórteres fluorescentes sensíveis ao glutamato 20. No entanto, os repórteres glutamato sensível actualmente disponíveis apresentam intervalos relativamente estreitos dinâmicos. Isto pode introduzir distorções não lineares entre o perfil de concentração de glutamato e o sinal de fluorescência, que limita a utilização destas sondas para extrair informação temporal da concentração de glutamato transiente. Por isso, é, provavelmente, através da combinação de todas estas diferentes abordagens que se pode obter a compreensão mais detalhada da dinâmica de sinais glutamatérgicos no membranas astrocíticos.

Em resumo, os métodos aqui apresentados podem ser usados ​​para estimar o curso-sináptica do glutamato libertado ou flash uncaged em membranas astrocíticos tempo de eliminação. Eles fornecem ferramentas valiosas que can ser utilizado para estimar o tempo de vida de glutamato no espaço extracelular em diferentes fases de desenvolvimento 13, numa variedade de espécies animais, 14 e regiões do cérebro, em condições fisiológicas e patológicas 21.

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Disclosures

Os autores declaram que não há conflito de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e programa de pesquisa intramuros Curso (NS002986). AS escreveu o manuscrito e implementada a análise de deconvolução. JSD desenvolveu a versão inicial da análise de deconvolução e comentou sobre o texto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CGP52432 Tocris 1246
(R,S)-CPP Tocris 173
DPCPX Tocris 439
LY341495 disodium salt Tocris 4062
MSOP Tocris 803
NBQX disodium salt Tocris 1044
D,L-TBOA Tocis 1223
Picrotoxin Sigma P1675
MNI-L-glutamate Tocris 1490
Alexa 594 Life Technologies A10438 Optional
Matrix electrodes Frederick Haer Company MX21AES(JD3)
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments PG10165-4
Dual-stage glass micro-pipette puller Narishige PC-10
Loctite 404 instant adhesive Ted Pella 46551
Xe lamp Rapp OptoElectronic FlashMic
Igor Pro 6 Wavemetrics

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References

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Neurobiologia Neuroscience Bioquímica Biologia Molecular Biologia Celular Anatomia Fisiologia Biofísica astrócitos as sinapses ácido glutâmico Proteínas de Membrana Transportadoras astrócitos transportadores de glutamato a captação a depuração hipocampo estrato radiatum CA1 gene cérebro fatia modelo animal
Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias
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Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving … More

Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents. J. Vis. Exp. (78), e50708, doi:10.3791/50708 (2013).

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