Härledning tidsförloppet för Glutamat Räkenskapsavslutning en Deconvolution Analys av astrocytisk Transporter Currents

Summary

Vi beskriver en analysmetod för att uppskatta livslängden för glutamat vid astrocytiska membran från elektrofysiologiska inspelningar av glutamat transportör strömmar i astrocyter.

Abstract

Den högsta tätheten av glutamat transportörer i hjärnan finns i astrocyter. Glutamat transportörer par rörelse glutamat över membranet med co-transport av 3 Na ⁺ och 1 H ⁺ och disk-transport av 1 K ^+. Den stökiometriska ström som genereras av transporter kan övervakas med hel-cell patch-clamp inspelningar från astrocyter. Tidsförloppet för den inspelade strömmen formas av tidsförloppet av glutamat koncentration profilen som astrocyter utsätts, kinetiken av glutamat transportörer, och de passiva electrotonic egenskaper astrocytic membran. Här beskriver vi de experimentella och analytiska metoder som kan användas för att spela in glutamat transportör strömmar i astrocyter och isolera tidsförloppet för glutamat godkännande från alla andra faktorer som formar vågformen av astrocytiska transportör strömmar. De metoder som beskrivs här kan användas för att uppskatta livstid of flash-uncaged och synaptically-utsläppt glutamat vid astrocytiska membran i varje region i centrala nervsystemet vid hälsa och sjukdom.

Introduction

Astrocytes är en av de mest förekommande celltyper i hjärnan med stjärnformade morfologi och fina utsprång membran som sträcker sig genom hela neuropil och nå angränsande synaptic kontakter ^1,2. De astrocyter 'cellmembranet är tätt packat med glutamat transportör molekyler ^3. Under fysiologiska förhållanden, glutamat transportörer binder snabbt glutamat på den extracellulära sidan av membranet och överföra den till cellens cytoplasma. Genom att göra så, transportörerna upprätthålla låg den basala koncentrationen av glutamat i det extracellulära rummet ^4. Glutamat transportörer i fina astrocytiska processer intill retande synapser är idealiskt positionerade för att binda glutamat frigörs under synaptiska händelser som den diffunderar bort från den synaptiska spalten. Genom att göra så, transportörerna begränsar också glutamat spillover mot peri-och extra-synaptiska regioner och på angränsande synapser, minskar den rumsliga spridningen av excitatoriska signalerer i hjärnan ^5-7.

Glutamat transporter är en electrogenic process stökiometriskt kopplad till rörelsen av 3 Na ⁺ och 1 H ⁺ längs sin elektrokemiska gradient och disk-transport av en K ^{+ 8.} Glutamat transporter förknippas med (men inte stökiometriskt kopplad till) en anjonisk konduktans genomsläpplig för SCN ^- (tiocyanat)> NO ₃ ^- (nitrat) ≈ CIO ₄ ^- (klorat)> I ^-> Br ^-> Cl ^-> F ^-, inte till CH ₃ SO ₃ ^- (metansulfonat) och C ₆ H ₁₁ O ₇ ^- (glukonat) ^9-11. Båda strömmar (stökiometrisk och icke-stökiometrisk) kan spelas in genom att erhålla hel-cell patch-clamp inspelningar från astrocyter, visuellt identifierats enligt Dodt belysning eller infrarött differential interferens kontrast (IR-DIC) i Acute hjärnsnitt ^12. Den stökiometriska komponenten i den nuvarande förknippas med glutamat transport över membranet kan isoleras med hjälp av CH ₃ SO ₃ ^- eller C ₆ H ₁₁ O ₇ ^- baserade intracellulära lösningar och kan framkallas av flash-uncaging glutamat på astrocyter ^13,14, eller genom att aktivera glutamatfrisättning från angränsande synapser, antingen elektriskt ¹² eller med en riktad optogenetic kontroll.

Tidsförloppet för den stökiometriska komponenten av transportören strömmen formas av livslängden för glutamat koncentrationsprofilen på astrocytiska membran (dvs. glutamat clearance), kinetik glutamat transportörer, de passiva membran egenskaper astrocyter, och under synaptiska stimulering, vid synchronicity av glutamatfrisättning över de aktiverade synapser ^13. Här beskriver vi i detalj: (1) en experimentell caoach att isolera den stökiometriska komponenten av glutamat transportör strömmar från hela-cell patch-clamp inspelningar från astrocyter med akut mus hippocampus skivor som exempel experimentell beredning, (2) ett analytiskt tillvägagångssätt att härleda tidsförloppet av glutamat clearance från dessa inspelningar ^{13 14.} Dessa metoder kan användas för att registrera och analysera glutamat transportör strömmar från astrocyter i varje region i det centrala nervsystemet.

Protocol

Ett. Slice Förberedelser

1. Bered 500 ml skivning / lagring lösning innehållande (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 _CaCl2, 1,3 MgSO ₄ · 7H ₂ O, 4 _MgCl2, 26,2 NaHCOs _3, en NaH ₂ PO _4, och 22 glukos, 320 mOsm, pH 7,4
2. Använd en 250 ml bägare för att förbereda en nedsänkning kammare för skivor, fyll det med 200 ml skivning / lagringslösning, värma den i ett vattenbad vid 34 ° C och bubbla det med 95% O _2, 5% CO _2.
3. Håll återstående skivning / lagringslösning i en glasflaska vid 4 ° C.
4. Använd en cyanoakrylatadhesiv att fästa en liten agar blocket (6%, framställd i ACSF) på vibratome provhållaren och förvara den vid 4 ° C.
5. 30 minuter innan skivning, placera glasflaska innehållande skivning / lagringslösning i en hink fylld med is och bubbla det med 95% O _2, 5% CO _2.

6. Bedöva musen (P14-21, C57BL / 6) med halotan / isofluran (isofluran har rapporterats öka astrocytisk glutamatupptaget ^15), halshugga den och doppa huvudet i en 50 ml bägare innehållande syresatt, kallt skivning / lagringslösning.
7. Utför dissektion av hjärnan på en kylklamp lindade med hushållspapper och förvarades vid -20 ° C.
8. Använd en skalpell för att göra en mid-sagittal hudsnitt på den dorsala sidan av huvudet, från den främre till den bakre änden, och exponera skallen.
9. Placera den nedre saxbett av ett litet par av kirurgiska saxar i occipital hålet och göra två snitt, mot den vänstra och på den högra sidan (45 ° vinkel).
10. Skär skallen längs mitten av sagittal linje, från svanskotan till den främre änden.
11. Ta bort hjärnan med en spatel och doppa den i syresatt, kallt skivning / förvaring solutividare.
12. Med en skalpell, gör fem snitt till: (1) ta bort lukt glödlampor och frontala cortex, (2) ta bort lillhjärnan, (3) ta till vänster och (4) höger tinninglober, (5) separera de två hjärnhalvorna med en mid-sagittal snitt.
13. Dab de två delarna av hjärnan med hushållspapper för att avlägsna överflödig lösning.
14. Limma den laterala ytan av varje hjärna avsnitt till den kalla vibratome basplatta: ryggsidan av hjärnan ska vara vända mot vibratome bladet, den ventrala sidan av hjärnan bör vara i kontakt med agar blocket, bort från vibratome bladet.
    Obs: För att få högsta kvalitet skivor, är det viktigt att de två delarna av hjärnan är fast limmat till vibratome bottenplattan. För att göra detta använder en cyanoakrylatlim som inte är alltför flytande och som inte torkar ut för snabbt.
15. Säkra vibratome bottenplattan till dissekera kammaren, ställa slice: eickness till 250 ^ m och justera bredden av bladet körningen. Fortsätt med skivning.
    Obs: om allt är rättvänt, bör vibratome att skära parasagittal skivor från rygg till ventrala och från den mediala mot laterala sidan av hjärnan.
16. När bladet har passerat genom cortex och hippocampus, använd en skalpell för att skära barken / hippocampus från mellanhjärnan och placera varje skiva i nedsänkning kammare vid 34 ° C.
17. Kasta den första par skivor. Normalt kan 12 skivor (250 um tjock) erhållas från en P14-21 mus hjärnan.
18. Håll skivorna vid 34 ° C under 30 minuter och låt dem svalna till rumstemperatur under 30 minuter innan de används för elektrofysiologi inspelningar.

2. Astrocyt Identifiering och Inspelningar

1. Bered en inre lösning innehållande (i mM): 120 KCH ₃ SO _3, 10 EGTA, 20 HEPES, 2 MgATP, 0,2 NaGTP,5 QX-314Br, och 5 NaCl, 290 mOsm, pH 7,2.
2. Förbered en extracellulär inspelning lösning innehållande (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 _CaCl2, 1,3 MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1 _MgCl2, 26,2 NaHCOs _3, en NaHPO _4, och 22 glukos, 300 mOsm, pH 7,4 , mättades med 95% _O2, 5% _CO2.
3. Lägg följande läkemedel till den extracellulära inspelning lösning, för att blockera aktivering av GLUa, Glun, mGluRII, mGluRIII, GABA _A, GABA _B och A1 adenosinreceptorer (i ^ M): 10 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2,3,4-tetrahydrobenso [ƒ] kinoxalin-7-sulfonamid dinatriumsalt (NBQX), 10 (RS) -3 - (2-carboxypiperazin-4-yl)-propyl-1-fosfonsyra (CPP), (2S )-2-amino-2-[(1S, 2S)-2-carboxycycloprop-1-yl] -3 - (xant-9-yl) propansyra-dinatriumsalt (LY341495), 100 (R, S)-α- metylserin-O-fosfat (SOIC), 100 pikrotoxin, 5 3 - [[(3,4-diklorfenyl) metyl] amino] propyl] dietoximetyl) fosfinsyra (CGP52432), en8-cyklopentyl-1 ,3-dipropylxantin (DPCPX).
4. Ställ in temperaturen av den extracellulära lösningen i inspelningen kammaren; typiska temperaturer är mellan 34 till 36 ° C.
5. Förbered patch-clamp elektroder från borosilikatglas kapillärer (R ≈ 2,5 Mohm) med en tvåstegs, glas mikro-pipett avdragare.
6. Ta en av de skivor och placera den i inspelningen kammaren. Håll ned den med en metall harpa gjord med platina tråd och strängar nylon.
7. Inspektera skivorna enligt Dodt belysning eller IR-DIC. Astrocyter kan identifieras genom sin småcellig kropp (Ø = 10 um) och framstående kärnan (figur 1).
8. För synaptiska stimuleringar, placera en bipolär rostfri elektrod, ~ 100 nm ifrån astrocyt som du planerar att lappa.
9. Patch den astrocyt och bryta i helcells-konfiguration genom att applicera en mycket mild sugning.
   Obs: Astrocytes normalt har låg input resistance (~ 10 MQ), hyperpolariserade vila membranpotential (~ -90 mV) och ingen bränning aktivitet. De astrocyter hålls vid sin vila membran potential under experimenten i spänning-clamp-läge (dvs. hållströmmen bör läsa 0 Pa). Före varje stimulering, är en 10 ms hyperpolarizing spänningssteg (-3 mV) används för att övervaka serien och ingångsresistans av astrocyt.
10. Kassera inspelningarna Om serien resistans ändras> 20% eller om membranet potential astrocyt blir depolarized. Membranet potential astrocyt kan mätas direkt genom att byta från spänning-clamp till ström-clamp läget. Alternativt under tiden i spänning-clamp läge kan membranpotentialen övervakas genom att avläsa värdet av hållpotential som resulterar i 0 pA hållström.
11. Om synaptiska stimuli används, alternerande enkel-och parade stimuli (t.ex. 100 ms mellanrum), var 10 - 20 sek.
12. För UV fotolys experimföräldrar, anslut en uncaging Xe lampa till epifluorescens porten av mikroskopet och tillsätt den inburade föreningen till den extracellulära lösningen. Transporter strömmar ~ 100 Pa amplitud kan erhållas när flash-uncaging 100 iM MNI-L-glutamat i hela synfältet (Ø = 662,5 nm vid användning av en 40X mål ^14). Alternativa stimuleringar med ljusstrålen öppna och blockerade, var 10 - 20 sek.
13. Evoke glutamat transienter och spela in strömmar transportör i kontrollrum förhållanden och i närvaro av en sub-mättande koncentration av det breda spektrum glutamat transportör antagonist D, L-treo-β-Benzyloxyaspartic syra (TBOA, 10 ^ M) för att minska transportören strömamplitud till minst 30% av sin kontroll värde (se avsnitt 4, 5) eller i närvaro av en hög koncentration av TBOA (50 - 100 um) för att blockera transportörer strömmar helt och isolera ihållande K ^+-ström (se avsnitt 3) .

Tre. Pharmacmiologiska Isolering av Sustained K ^+-ström

1. Spela astrocytiska strömmar under kontroll förhållanden och i närvaro av en hög, mättande koncentration av TBOA (50 - 100 um).
2. Genomsnitt minst 20 svep i TBOA (50 - 100 um).
3. Montera de genomsnittliga spår som erhållits i 3.2 med funktionen:
   
   Anmärkning: den TBOA-okänsliga komponenten (dvs. en som registreras i närvaro av TBOA (50-100 pM)) representerar den ihållande K ^+-ström. Tidsförloppet approximeras av mono-exponentiell funktion som beskrivs ovan.
4. Upprepa denna passform över olika astrocyter och härleda ett medelvärde av Τ _uppgång (dvs. den genomsnittliga stigtid ihållande K ^+-ström (se avsnitt 5)).

4. Jagtröst för förenklad Andel av synaptically-aktiverade Transporter Strömmar (fSTCs)

1. Genomsnitt minst 20 svep erhållits med parade stimuli, i kontroll förhållanden och i TBOA (10 M) (Figur 2a vänster).
2. Genomsnittligt ett identiskt antalet svep erhållna med enstaka stimuli, i kontrollbetingelser och i TBOA (10 pM) (figur 2a i mitten).
3. Jämför amplituden hos den genomsnittliga strömmen svar på -3 mV spänningssteg i de fyra medelvärdesbildade spår (kontroll enda puls, kontroll parade pulser, TBOA enda puls, TBOA parade pulser).
4. Om amplituden på det aktuella svaret är detsamma i alla fyra spår, gå till steg 4.7.
5. Om amplituden av den genomsnittliga aktuella svaret är annorlunda i någon av de fyra spåren, kontrollera att alla enskilda spår var lämpligt att ingå i genomsnitt.
6. Om amplituden av den genomsnittliga strömmen är olika i något av de fyra spår, men alla idividuell spår är lämpliga för att tas med i genomsnitt, kontrollera att i varje spår storleken på FSTC skalor linjärt med storleken på det aktuella svaret på prov spänningssteg. Om detta är fallet, skala alla spår i förhållande till varandra så att de aktuella svaren på testspänningen steget alla är lika i amplitud.
   Obs: I inspelningen förhållanden som beskrivs här (dvs. intracellulär CH ₃ SO ₃ ^- eller C ₆ H ₁₁ O ₇ ^-), synaptiska stimuleringar av excitatoriska axoner genererar astrocytiska strömmar med komplexa vågformer bestående av en snabbt stigande övergående inåt stökiometrisk ström och en långsam -stigande, ihållande inåt K ^+-ström reflekterande K ⁺ re-jämvikt i det extracellulära utrymmet efter aktionspotential utbredning längs angränsande axoner. Det är kritiskt att avlägsna denna långvariga K ^+-ström, som någon restström skulle leda till enöverskatta av glutamat livstid.
7. Subtrahera den genomsnittliga kurvan erhålls med enkla stimuli från den genomsnittliga kurvan erhålls med parade stimuli (Figur 2a till höger). Detta steg kan isolera den stökiometriska och ihållande K ^+-ström framkallad av den andra stimulanspaket.
8. Överföra den genomsnittliga kurvan erhålls med enkla stimuli med ett tidsintervall som matchar inter-pulsintervallet som används för att leverera parade-pulser (dvs 100 ms) (Figur 2b).
9. Subtrahera återuppspelat genomsnittlig respons erhålls med enkla stimuli från den genomsnittliga svaret på den andra stimulanspaket som erhölls i 4.7 (figur 2c). Detta steg isolerar underlättas delen av transportören ström framkallad av den andra stimulus (det FSTC).
10. I de flesta fall, tar bort det tidigare steget helt med fördröjd K ^+-ström. Om detta är fallet, är isolering av den FSTC klar och du kan förfaed med deconvolution analys och härleda tidsförloppet av glutamat clearance från astrocyter. I vissa fall är dock en liten varaktig K ^+-ström kvar (figur 2d) och ytterligare analys krävs (se avsnitt 5).
    Observera: Kom ihåg att analysen beskrivs i 4,7-4,10 måste utföras på den genomsnittliga spår erhållits i kontroll förhållanden och i TBOA (10 M).

Fem. Subtraktion av resterande zdustained K ^+-ström från fSTCs

1. Mät amplituden av ihållande K ^+-ström kvar efter att ha utfört den analys som beskrivs i avsnitt 4.
2. Scale amplituden hos den mono-exponentiell funktion som beskrivs i 3,3 till amplituden för den kvarvarande ihållande K ^+-ström mäts i 5,1 (figur 2d vänster och mitten). För att göra detta, i ekvation 3.3, som termen A är lika med amplituden av den ihållande K ^+-ström migasured i 5.1 och termen Τ _ökningen motsvarar det genomsnittliga värdet av Τ _ökning beräknades i 3.4.
3. Subtrahera den resulterande mono-exponentialfunktion från FSTC och ihållande K ^+-ström erhållen i 4,10 (figur 2d höger). Detta steg fullbordar isoleringen av FSTC.

6. Isolering av Flash-aktiverade Transporter Strömmar (FTCs)

1. Genomsnitt minst 20 svep erhållna med ljusvägen öppnas, under kontrollbetingelser och i TBOA (10 pM).
2. Genomsnittligt ett identiskt antalet svep erhölls med ljusvägen tillsluten, på kontrollbetingelser och i TBOA (10 | iM).
3. Jämför amplituden på det aktuella svaret till -3 mV spänningssteg i de fyra medelvärdesbildade spår (kontroll enda puls, kontroll parade pulser, TBOA enda puls, TBOA parade pulser).
4. Om amplituden på det aktuella svaret är detsamma i alla fyra spår, fortsätt till steg 6,7.
5. Om amplituden av den genomsnittliga strömmen är annorlunda i någon av de fyra spåren, men alla enskilda spår är lämpliga att ingå i genomsnitt, kontrollera att det i varje spår med ljusstrålen öppna storleken på FTC skalor linjärt med storleken på aktuellt svar på testet spänning steget. Om detta är fallet, skala alla spår i förhållande till varandra så att de aktuella svaren på testspänningen steget alla är lika i amplitud.
   Obs: i inspelningsförhållandena beskrivs här (dvs. intracellulär CH ₃ SO ₃ ^- eller C ₆ H ₁₁ O ₇ ^-), flash stimuli generera astrocytiska strömmar som endast består av den snabbt ökande transienta stökiometriska inåt ström.
6. Subtrahera den genomsnittliga kurvan erhålls med ljuset path spärrad från genomsnittet avbildning erhållen med strålgången öppen. Detta steg kan ta bort den stimulans artefakt och isolera FTCs.
   Obs: den analys som beskrivs i 6.7 måste utföras på den genomsnittliga spår erhållits i kontroll förhållanden och i TBOA (10 M).

7. Deconvolution analys

1. Montera transportören ström (FSTC eller FTC) inspelad under kontroll förhållanden (Figur 3a vänster) och i TBOA (10 M) (Figur 3a höger) och isolerade som beskrivs i avsnitt 4 - 6, med multi-exponentialfunktion:
   
2. Skapa ett momentant stigande funktion som sönderfaller mono-exponentiellt enligt funktionen:
   
   ochsom bäst beskriver den avklingande fasen av transportören ström som registreras i TBOA (10 ^ M) (figur 3b).
   Observera: den funktion som beskrivs i 7.2 (dvs. H (t)) representerar tidsförloppet av glutamat clearance från astrocyter i närvaro av TBOA (10 M).
3. Deconvolve mono-exponentialfunktion erhållen i 7,2 (figur 3b och 3c mitten) från passningen av transportören ström som registreras i TBOA (10 ^ M) som erhållits i 7,1 (figur 3a höger, vänster c).
   Obs: deconvolution är en matematisk operation som ingår i många paket analysprogram som (t.ex. Matlab, Python). I IgorPro, den programkod som vi normalt använder för att utföra denna typ av analys kan deconvolution verksamheten effektivt beräknas enligt nedan, med diskreta snabba Fouriertransformer. Först använder FFT operation för att beräkna discrete snabb Fourier transformen av mono-exponentialfunktion som erhölls i 7.2 och av passningen av transportören ström som registreras i TBOA erhållen i 7.1. Använd därefter IFFT operation för att beräkna den inversa diskreta snabba Fouriertransformen av förhållandet mellan de två FFT-funktionerna. Den resulterande funktionen I (t) kan beskrivas enligt följande:
   
   Det steg som beskrivs i 7.3 tillåter härledning av filtret för transportören gällande i TBOA (10 M) (Figur 3c höger). Filtret representerar snedvridning faktorer som omvandlar livstid glutamat vid astrocytiska membran till transportören strömmen isoleras i avsnitt 4 - 6 (dvs. FSTC eller FTC).
4. Deconvolve filtret (figur 3c höger, Figur 3d mitten) från passningen av transportören strömmen i kontrollbetingelser (Figur 3a figur 3d).
   OBS: Detta steg tillåter härledning tidsförloppet av glutamat clearance från astrocyter i kontroll förhållanden (Figur 3d höger). Antagandet bakom denna deconvolution steg är att den temporala profilen av filtret förblir oförändrat under kontroll förhållanden och i TBOA (10 M).
5. För att få en kvantitativ uppskattning av den totala tidsförloppet av glutamat clearance, beräkna tyngdpunkten (<t>) av vågformen som erhållits i steg 7.4. Detta görs genom att beräkna <t> som:
   
   där G (t) är vågformen som erhållits i steg 7.1. I ekvationen ovan beskrivna, motsvarar termen t till det tidsfönster över vilken integralen beräknas.
   Obs: När metoden först bildades,<t> beräknades över tidsfönster som fanns kvar otvungen ^13. Denna metod kan användas så länge integrationen fönstret är satt att vara större än längden av glutamat och avslutande sönderfaller vågform helt tillbaka till baslinjen. Om detta inte är fallet, emellertid, möter denna metod för uppskattning <t> vissa begränsningar. Till exempel, om avslut vågformen inte förfalla precis tillbaka till baslinjen, sedan <t> ökar med bredden på integration fönstret. För att undvika potentiell källa för brister för uppskattning av <t>, beräknar vi nu över ett tidsfönster som motsvarar 10% av toppen av transportören nuvarande, före och efter sin debut ^14. Den sistnämnda metoden förbättrar konsistensen som <t> mäts över cellerna. Detta är praktiskt särskilt när man analyserar små effekter av farmakologiska behandlingar på tidsförloppet för avslut.

Representative Results

Framgången för det analytiska tillvägagångssätt som här beskrivs kritiskt beroende erhålla högkvalitativa elektrofysiologiska inspelningar av transportörer strömmar från astrocyter i varje region i det centrala nervsystemet. I akuta mus hippocampus skivor, kan astrocyter lätt identifieras enligt Dodt belysning eller IR-DIC grund av deras småcellig kropp (Ø = 10 um) och framstående kärnan (figur 1). Deras utmärkande stjärnformade morfologi kan uppskattas med epifluorescence, konfokal, eller två-photon laser scanning mikroskopi, när du lägger till en fluorofor som Alexa 594 (50 ^ M) till den intracellulära lösningen, (figur 1). På elektrofysiologi nivå, astrocyter kännetecknas av låg ingång motstånd, hyperpolarized membran potential (~ -90 mV) och oförmåga att generera aktionspotentialer. Astrocytes genererar strömmar som svar på elektrisk eller optogenetic stimulering av angränsande nervceller och UV fotolys av caged föreningar som MNI-L-glutamat.

Astrocytiska transportör strömmar kan registreras med hjälp av Cs ⁺ eller K ⁺ baserade interna lösningar. Observera att Cs ^+, en populär K ⁺ substitut, stöder glutamat transporter men saktar glutamat transportör cykling ränta ^16,17 (eftersom glutamat transportörer binder och / eller translocate Cs ⁺ över membranet långsammare än K ^+). Om Cs ⁺ minskar signifikant antalet transportörer tillgängliga för bindning glutamat, det leder också till mindre / långsammare transportör strömmar än de som spelats in med K ⁺ baserade interna lösningar ^16,17.

Vid användning av CH ₃ SO ₃ ^- eller C ₆ H ₁₁ O ₇ ^- som den viktigaste intracellulära anjonen, är strömmen som genereras av glutamat transportörer i astrocyter på grund av den stökiometriskt-kopplade rörelse av ett glutamat, 3 Na + och 1 K ⁺ över membranet. Denna stökiometrisk strömmen är den enda inspelade från astrocyter i fotolys experiment och vi kallar det för FTC. När du utför fotolys experiment, är det rekommenderat att alternativa UV stimuli som erhållits med ljusstrålen öppen och blockeras. Spåren som erhölls med den blockerade ljusbanan är användbara för att isolera den stimulans artefakt genereras av blixtlampan och kan subtraheras från de som erhållits med ljusbanan öppen för perfekt isolera FTC.

Den ström som registreras i astrocyter när framkalla synaptisk frisättning av glutamat har en mer komplex vågform. Den består av en snabbt ökande, övergående inåt komponenten beror på stökiometriskt-kopplade glutamat transportör ström beskrivits ovan. Dessutom innefattar det en långsamt stigande, ihållande inåt K ^+-ström på grund av inflöde av K ⁺ ackumuleras i det extracellulära utrymmet efter aktionspotentialenförökning längs angränsande axoner. En farmakologisk metod kan användas för att isolera transportören ström från ihållande K ^+-ström och kräver användning av höga koncentrationer av det breda spektrum glutamat transportör antagonist TBOA (100 iM) vid slutet av experimentet ^12. Den metod som beskrivs här använder en rent analytisk metod för att isolera glutamat transportör ström från ihållande K ^+-ström och därmed möjliggör kortare experiment (figur 2).

Som ett första steg, interfoliera vi singel och parade-puls synaptiska stimuli (100 ms mellanrum), var 10 - 20 sek, och genomsnittet lika många svepen erhållits med singel och parade-puls stimuli. Amplituden hos den första ström framkallad av de parade stimuli bör matcha amplituden hos strömmen framkallad av den enda stimulus. Vi börjar denna analys genom att subtrahera ström framkallad av den enda stimulans från den framkallade avde parade stimuli. Denna subtraktion möjliggör isolering av svaret på den andra stimulanspaket, som också består av en snabbt ökande, övergående glutamat transportör ström och en långsamt stigande, ihållande K ^+-ström (Figur 2a till höger). Därefter flyttar vi svaret på den enda stimulans med ett tidsintervall som motsvarar den inter-pulsintervallet av de parade stimuli, så att tiden för starten av det gemensamma svaret stämmer tiden för starten av det andra svaret isolerats ovan (Figur 2b ). Genom att subtrahera dessa två strömningar, isolerar vi det lättare delen av transportören ström, som vi här kallar FSTC (figur 2c). Kinetiken för FSTC liknar kinetiken för synaptically-aktiverat transportör ström (Standardavtalsklausulerna) isolerad farmakologiskt med höga koncentrationer av glutamat transportör antagonisten TBOA (100 ^ M) ^13. Av detta skäl och för enkelhets skull, i tidigare arbete, som avses vi till FSTCsom STC ^13,14. Trots att strömmar med liknande egenskaper, fSTCs och Standardavtalsklausulerna är inte samma ström. Av denna anledning och för riktigheten i detta arbete kommer vi att hänvisa till dem explicit som fSTCs och standardavtalsklausuler. Subtraktionen här beskrivna metoden medger noggrann isolering av fSTCs i de flesta inspelningar. Men i vissa fall är en resterande ihållande K ^+-ström fortfarande närvarande. I detta fall är det nödvändigt att isolera den fördröjda K ^+-ström i olika experiment med höga koncentrationer av TBOA (50-100 pM). Tidsförloppet för farmakologiskt isolerade ihållande K ^+-ström kan beskrivas med ett mono-exponentiell funktion i form:

Genom att spela in astrocytiska strömmar i olika celler, uppskattar vi det genomsnittliga värdet av Τ _uppgång. Vi creat nästaea mono-exponentiell funktion som den som beskrivs ovan, vari Τ _upphov motsvarar det genomsnittliga värdet av Τ _upphov mätt experimentellt i olika astrocyter och A motsvarar amplituden för den kvarvarande ihållande K ^+-ström som vi vill ta bort (figur 2d ).

Den metod som vi just beskrivit att isolera fSTCs fungerar fint när frammana glutamatfrisättning från underlätta synapser och kan också användas för att studera glutamatfrisättning från synapser som genomgår parade-puls depression. Men det är till föga nytta när glutamaterga synapser under studie inte visar någon tydlig form av kortsiktig underlättande eller depression. I detta fall kvarstår den farmakologiska isolering av transportörer strömmar med höga koncentrationer av TBOA (100 M) den mest genomförbara lösningen att isolera stökiometriskt-kopplad, synaptically-framkallade glutamat transportör ström.

(dvs. utan att blockera den helt). Målet här är att sakta ned betydligt tidsförloppet för transportören strömmen utan att förlora förmågan att skilja det från buller från inspelningarna. Det underliggande antagandet är att i närvaro av en liten koncentration av TBOA, då upptaget kapacitet astrocyter har minskat, är den viktigaste faktorn forma sönderfallet av transportören gällande den gradvisa minskningen av glutamat koncentrationen vid astrocytisk membranet ^12,18. Vi passar transportören strömmen i kontroll förhållanden och i TBOA (10 M) med flera exponentialfunktion:

(Figur 3a). Vi ungefärliga glutamat clearance i TBOA (10 iM) med ett momentant-stigande funktion med mono-exponentiellt avtagande (Figur 3b) och vi deconvolve det från flera exponentialfunktion som beskriver transportören strömmen i TBOA (10 um; Figur 3c). Den resulterande vågformen är "filter", och representerar en kombination av faktorer som snedvrider (dvs. filter) glutamat koncentrationsprofilen till transportören ström (Figur 3c). Deconvolving filtret från multi-exponentiell anpassning av transportören strömmen i kontrollbetingelser tillåter uppskatta tidsförloppet för glutamat koncentrationsprofilen på inspelade astrocyt i kontrollbetingelser (figur 3d). För detta avfaltning analysen antar vi att kinetikav filtret förblir oförändrade i frånvaro och i närvaro av TBOA (10 | iM). Detta är ett rimligt antagande eftersom alla faktorer som bidrar till filtret (dvs. transportör kinetik, electrotonic filtrering och under synaptiska stimuli, asynkron frisättning av glutamat över synapser) sannolikt inte att påverkas av förekomsten av TBOA, en förening som minskar antalet av transportörer tillgängliga för bindning glutamat.

Vi använder tyngdpunkten (<t>) som ett mått på glutamat livslängd vid astrocytiska membran i olika celler. <t> Representerar "masscentrum" av clearance vågform, och är känsliga för förändringar i både stigtid och förfall glutamat clearance vågformen. Centroiden uttrycks som:

class = "jove_content"> Det finns två sätt att bestämma tidsintervallet under vilken vi kan beräkna integraler på täljare och nämnare i detta uttryck. Eftersom clearance vågformen stiger från och sönderfaller till noll, när metoden först bildades, fanns ingen specificering görs om hur man ställer integrationen fönstret, och i själva verket detta var gjort ganska löst ^13. En väg runt detta problem är att begränsa integrationen fönstret till den tid det tar att nå en godtycklig del av FTC / FSTC topp, till exempel 10% ^14. Denna enkla kriterium möjliggör konsekvent när du utför denna analys i olika celler, förbättrar noggrannheten i beräkningarna av <t> när clearance vågformen inte sönderfalla perfekt till noll, och förbättrar känsligheten av analysen till små skillnader i clearance vågformer som kanske förekommer i olika grupper av celler.

e 1 "fo: innehåll-width =" 3in "fo: src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1.jpg "/>
Figur 1. Identifiering av astrocyter i akut hippocampus skivor. (Ab) Dodt bilder av hippocampus astrocyter i CA1 stratum radiatum. Under Dodt belysning och IR-DIC kan astrocyter identifieras genom sin småcellig kropp och framstående kärna. De röda pilarna pekar på flera astrocyter som kan identifieras i skivor beredningen. Den gula pilen visar astrocyt som var lappat och fylld med ett fluorescerande färgämne (se nedan). (Cd) överdrad Dodt bild av hippocampus skivor och två-photon av de lappade astrocyter, markerat med en gul pil i (ab). För detta experiment var astrocyter korrigerad och fylld med en KCH ₃ SO ₃ - baserad intern lösning tillsattes med Alexa 594 (50 | iM). De astrocytiska processer förlänga några tiotals um borta från than cellkropp. De anteckningar från vänster identifiera de tre viktigaste cellulära skikten av hippocampus CA1 formation som kan redovisas i skivor.

Figur 2. Isolering av fSTCs från synaptically-aktiverade transportören strömmar registreras i astrocyter. (Ac) Scheme av de analytiska steg som krävs för att isolera fSTCs från synaptically-aktiverade transportören strömmar registreras i astrocyter. (D) Analytisk metod som används för att avlägsna kvarvarande ihållande K ^+-ström från fSTCs (se avsnitt 5). Klicka här för att visa en större bild .

ent-width = "6.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3.jpg" />
Figur 3. Deconvolution analys använts för att härleda tidsförloppet för glutamat clearance från astrocyter (a) Mono-exponentiell anpassning av FSTC / FTC isolerades i kontrollbetingelser (vänster) och i närvaro av TBOA (10 uM; höger).. (B) Tidsförloppet för glutamat clearance hos TBOA (10 | iM) approximeras med ett momentant-stigande funktion med mono-exponentiellt avtagande. (C) Deconvolving tidsförloppet för glutamat clearance hos TBOA (10 | iM) från den multi-exponentiell anpassning för transportören strömmen i TBOA (10 ^ M) tillåter uppskattning av filtret. (D) Deconvolving filtret från multi-exponentiell anpassning av transportören strömmen i kontrollbetingelser tillåter uppskatta tidsförloppet av glutamat clearance från astrocyter i styrvillkor.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Här beskriver vi en experimentell metod för att få elektrofysiologiska inspelningar från astrocyter, en analytisk protokoll för att isolera glutamat transportör strömmar i astrocyter och en matematisk metod för att härleda tidsförloppet av glutamat clearance från astrocytiska transportör strömmar.

Framgången av analysen bygger på förmågan att erhålla högkvalitativa inspelningar patch clamp från astrocyter och om riktigheten av de passande algoritmer som används för att beskriva transportören strömmarna. Den deconvolution Analysen bygger på följande två antaganden. (1) De multipla processer som snedvrider tidsförloppet av glutamat clearance i experimentellt inspelade transportör ström kan representeras som ett linjärt system. Även i absoluta tal många av de faktorer som formar transportör strömmar är icke-linjära system (i princip glutamat bindande och transport kan båda genomgå mättnad), experimentella bevis indicates att deras linjära regimen är bred. Följaktligen kvarstår tidsförloppet av transportmolekyler strömmar och av glutamat clearance densamma över ett brett spektrum av stimulans styrka, frisättning sannolikhet, och koncentrationer glutamat ^13,14,18. Även om denna approximation verkar vara legitimt för våra experimentella betingelser bör det valideras innan upprepning av denna analys i olika experimentella preparat. (2) Egenskaperna hos filtret är opåverkad av närvaron av TBOA (10 | iM). Detta antagande verkar rimligt eftersom alla faktorer som bidrar till filtret (dvs. transportör kinetik, electrotonic filtrering och under synaptiska stimuli, asynkron frisättning av glutamat över synapser) sannolikt inte att påverkas av förekomsten av TBOA.

Genom att härleda glutamat clearance vågformen från fSTCs och FTCs, får vi två olika typer av information. Genom att analysera fSTCs mäter vi tiden som astrocytic membran utsätts för glutamat frisätts från synapser. Genom att frammana FTCs med fullt fält UV-belysning (dvs. genom uncaging glutamat över hela astrocytisk ytan), mäter vi tiden att astrocytiska membran utsätts för uncaged glutamat. I dessa uncaging experiment all glutamat molekyler frigörs (dvs. uncaged) på samma gång och alla transportörer är aktiverade samtidigt, med samma glutamat koncentration. Därför, genom att analysera FTCs, kan vi få en indirekt avläsning av astrocytisk glutamatupptaget kapacitet.

Det är viktigt att notera att de metoder som beskrivs här tillåter uppskatta tidsförloppet av glutamat clearance, inte det verkliga värdet av glutamat koncentrationen frammana transportören strömmarna. Den beräknade tiden Kursen är en genomsnittlig mått av tidsförloppet av glutamat avslut på samtliga områden i astrocytisk membranet som vi har elektrofysiologiska tillgång: det är ingent känslig för heterogeniteter i glutamatupptaget på olika platser inom astrocytisk membranet ^19. Denna information är mer sannolikt att erhållas med högupplöst mikroskopi av glutamat-känsliga fluorescerande reportrar ^20. Emellertid de för närvarande tillgängliga glutamat-känsliga reportrar uppvisar relativt smala dynamiska intervall. Detta kan införa icke-linjära förvrängningar mellan glutamat koncentrationsprofilen och fluorescenssignalen, begränsa användningen av dessa sönder för att extrahera temporal information om glutamat koncentration övergående. Därför är det förmodligen genom att kombinera alla dessa olika metoder som man kan få den mest omfattande förståelse av dynamiken i glutamaterg signaler vid astrocytic membran.

Sammanfattningsvis kan de metoder som presenteras här kan användas för att beräkna kursen clearance tid synaptically-utsläppt eller flash-uncaged glutamat vid astrocytic membran. De ger värdefulla verktyg som can användas för att uppskatta livstiden för glutamat i det extracellulära utrymmet i olika stadier av utveckling ¹³ i en mängd olika djurarter ¹⁴ och områden i hjärnan under fysiologiska och patologiska tillstånd ^21.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
(R,S)-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 disodium salt	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX disodium salt	Tocris	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Picrotoxin	Sigma	P1675
MNI-L-glutamate	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	Optional
Matrix electrodes	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	PG10165-4
Dual-stage glass micro-pipette puller	Narishige	PC-10
Loctite 404 instant adhesive	Ted Pella	46551
Xe lamp	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics