Luminometric ושמרים Published: December 31, 2013 doi: 10.3791/50816

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Jinfeng Teng¹, Stephen Loukin¹, Xinliang Zhou¹, Ching Kung^1,2

¹Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, ²Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

Summary

כדי להשלים את השיטות נפוצות ללמוד TRPV4 של שתי שיטות מתוארות: mechanosensitivity ניתן ללמוד על ידי ² luminometry ^+-aequorin Ca בשמרים מהונדסים על אתגר היפו אוסמוטי. כמו כן, ניתן לבדוק בTRPV4-RNA מוזרק ביציות Xenopus ידי מהדק כל תא שתי אלקטרודות מתח או צמד תיקון בתאים או במצב נכרת.

Abstract

TRPV4 (חלוף קולטן פוטנציאלים, משפחת vanilloid, סוג 4) באו לידי הביטוי באופן נרחב ברקמות חוליות ומופעל על ידי מספר גירויים, ובכלל זה על ידי כוחות מכאניים. מוטציות TRPV4 מסוימות לגרום לעצם תורשתי מורכב או פתולוגיות עצביות בבני אדם. transgenes Wild-type או TRPV4 המוטציה באים לידי ביטוי בדרך כלל בתאי יונקים בתרבית ונבדק על ידי הפורע-2 fluorometry ועל ידי אלקטרודות. במונחים של המנגנון mechanosensitivity והבסיסים המולקולריים של המחלות, הספרות הנוכחית היא מבלבלת ושנויה במחלוקת. כדי להשלים את השיטות קיימות, אנו מתארים שתי שיטות נוספות כדי לבחון את המאפיינים המולקולריים של TRPV4. (1) החולדה TRPV4 וtransgene aequorin הופכים שמרי ניצנים. הלם היפו osmtic מאוכלוסיית transformant תשואות אות luminometric בשל שילוב של aequorin עם Ca ^{2 +,} שוחררה דרך ערוץ TRPV4. הנה TRPV4 מבודד מחלבונים היונקים הרגילים שלו השותףומגלה mechanosensitivity משלו. (2) קרנה של TRPV4 מוזרקת לתוך ביציות Xenopus. לאחר תקופה מתאימה של דגירה, הנוכחי TRPV4 מקרוסקופית נבחן עם מהדק מתח שתי אלקטרודות. העלייה הנוכחית עם הסרת osmoticum אינרטי מאמבטית הביצית מעידה על mechanosensitivity. זרמי microAmpere (10 ^-6 ל10 ^-4) מביציות הם הרבה יותר גדולים מאשר זרמי subnano לnanoAmpere (10 ^-10 ל10 ^-9) מהתאים בתרבית, מניב quantifications והערכות בטוחים יותר ברורים יותר. זרמים מיקרוסקופיים המשקפים את פעילותם של חלבוני ערוץ בודדים יכולים גם להיות רשומים ישירות תחת מהדק תיקון, בתאים או במצב נכרת. אותה הביצית מספקת דגימות תיקון מרובות, מאפשר שכפול נתונים טובים יותר. שאיבה להחיל תיקונים יכולה להפעיל TRPV4 להעריך mechanosensitivity ישירות. שיטות אלו צריכה להיות גם שימושיות בחקר סוגים אחרים של ערוצי TRP.

Introduction

TRPS (פוטנציאלי קולטן חולפים) מהווה שבעה subfamilies ערוצי קטיון המשרתים פונקציות חושיות ^1,2. ביונקים, TRPV, תת משפחת vanilloid של TRPS, יש שישה סוגים. TRPV4 (סוג 4) ^3,4 מגיב לחום, כימיקלים מסוימים, נפיחות האוסמוטי, או מאמץ גזירה. גן TRPV4 היה מבודד שוב ושוב על ידי מועמד גן ו / או ביטוי שיבוט ^5-8. השיטה השנייה ואחרי התגובה של מוצר הגן להיפו אוסמולריות. TRPV4 בא לידי ביטוי כמעט בכל איברים ופונקציות בפיתוח, הפיסיולוגיה, פתולוגיה או של סוגי תאים שונים רבים ^3,4.

בולט הם> 50 מוטציות TRPV4 אוטוזומלית דומיננטיות אנושי, גורם נוירופתיה היקפית ו / או dysplasias שלד (ליקויים בהתפתחות שלד) ^9-11. Dysplasias השלד נע בין סוג brachyomia קל 3 (סוג 3 גמדות), סוג קוזלובסקי דיספלזיה spondylometaphyseal, לseveמחדש dysplasias, חלקם בגרימת מוות בילוד או עוברי. למרות כל הנימוסים של מנגנונים נראים אפשריים, אף מסביר את הגיוון, את המורכבות, השתנות, ומדי פעם חפיפות של מחלות אלו ^4.

כמו ערוצים אחרים TRP ^1, TRPV4 הוא tetramer. בחולדה או TRPV4 אדם, כל מקטע הוא כלל 871 שאריות. האלמנט המרכזי שלה הוא הטרנסממברני שישה סלילים (S1-S6), שסביר להניח שמסודרים בצורה דומה ל-K ⁺ ערוצי מתח מגודרת. שם, S1 לS4 מהווה תחום היקפי וS5 S6 ויוצרים תחום הנקבובית חלחול. בין S5 ו S6 של TRPV4 הוא סליל נקבובית קצר אחרי LDLFKLTIGMGDL הרצף, ארבעה מהם להתכנס ככל הנראה כדי ליצור את מסנן קטיון. קטע cytoplasmic N-מסוף 470 השאריות מכיל 6 חזרות ankyrin, היודע להתקשר לחלבונים או ligands הקטן. קטע cytoplasmic 152 שאריות C-המסוף כולל רצף מחייב calmodulin בין אתרים אפשריים אחרים אשר נקלטות otהאלמנטים שלה ^3.

TRPV4 הוא ערוץ קטיון שלמעשה אינו כולל אניוני ^1. בעוד התפקוד הפיזיולוגי שלה הוא transduce גירויים לCa ^{2 +} זרם, הוא גם חדיר לקטיונים אחרים עם רצף חדירות אייזנמן IV, לטובת דו ערכית _בCa P: P _Na 7 ^~ 12V. מוליכות ערוץ יחיד מתקנת ב ~ 90 PS 40 PS כלפי חוץ וכלפי פנים ~ ^6,13,14. הביע Heterologously יכול להיות מופעל נוכחית (להלן) על ידי נפיחות היפו אוסמוטי, מאמץ גזירה, או חום ^15. כמו כן, מופעל על ידי חומצות שומן רבות בלתי רוויות שומן ^16,17 ואסתר phorbal הסינתטי 4αPDD ^18. בשלב נוכחי, אגוניסט החזק ביותר הוא GSK1016790A ¹⁹ ואנטגוניסט הוא GSK2193874, יעיל ב10 ^-9 ל10 ^-8 M ^20, שניהם התגלו על ידי תפוקה גבוהה, מסך קטן מולקולרי.

שני תחומים מרכזיים של מחקר TRPV4 יישארו מבלבל: (1) גם כTRPV4 נלמד במידה רבה לmechanosensitivity, הבסיס המולקולרי שלה הוא שנוי במחלוקת. מודל אחד מתאר היפו osmolarity איכשהו מפעיל פוספוליפאז A2 (PLA2) כדי לייצר את חומצת שומן רב בלתי רווי (PUFA) חומצה ארכידונית (AA), אשר מומרת epoxyeicosatrienoic חומצה (EET) על ידי epoxygenase, ואת הכריכה של EET מפעילה TRPV4 ^{16, 17.} ובכל זאת, TRPV4 עצמו הוכח להגיב ישירות לקרום למתוח ¹⁴ (להלן), ומספק הסבר פשוט יותר. (2) פתולוגיות המוטציה TRPV4 הם מבלבלים. בבסיס, צריך לדעת אם המחלות הן תוצאה של האובדן, הירידה, או העלייה של פעילות ערוץ. גם כאן, הספרות היא רחוק מלהיות ברור. בעוד אללים שלד-דיספלזיה מרובות דווחו ליש פעילות גבוהה יותר, (, GOF לזכות-of-פונקציה) ^4,21, כמה דווחו לצמצם פעילות (, LOF אובדן של פונקציה) ^10,22. לימוד שיטתי של 14 אללים מצא אותםכל המוטציות שGOF (להלן) ^23. נראית את הטענה כי חלקם LOFs לסתור את הפנוטיפ של trpV4-/ - עכבר בנוקאאוט, שהם ברי קיימא או פורה, עם פגמים קלים בלבד, למרות אובדן תפקוד TRPV4 מלא.

חלק מהמחלוקות אלה יש מוצא מתודולוגי. מעבדות להשתמש בשיטות שונות, או גרסאות של שיטה אחת, ומעסיקות תקני שיפוט שונים. הנפוץ ביותר, TRPV4 מתבטא transiently בתאי יונקים בתרבית (HEK, CHO, הלה) והעלייה פנימי [Ca ^{2 +]} על אגוניסט או גירוי hypotonic רשום עם Ca ^{2 +} צבע פלואורסצנטי רגיש, הפורע-2. הסתמכות היתר על assay fluorometric זה זכתה לביקורת ^1. רמת הביטוי באוכלוסיות שונות, ההפצה בו, כמו גם את ריכוז הצבע היעיל, צריכה להיות מבוקרת ומתועדת. יותר אמין הוא בדיקות אלקטרו הישירות. גם זה, כמו commonly התאמן, הוא גם לא בלי בעיות. מכיוון שרמות הביטוי בתאים בתרבית בודדות הן קשות לשליטה, יש לי כל תא זרמים וריאציות גדולות. יתר על כן, מכיוון שהזרמים קטנים, נתונים סטטיסטיים אמינים יצטרכו להסתמך על מדגמים גדולים, לעתים קרובות לא מעשיים. בדיקות תיקון מהדק רק לעתים נדירות כבר בוצעו. כמה הקלטות כאלה מראות אשכולות של פרצי פעילות שהופכים את ההערכה סטטיסטית מאתגרת ^16,17.

כדי להבין טוב יותר mechanosensitivity המולקולרי, פיתחנו שתי מערכות נוספות כדי לבחון TRPV4. (1) כדי לבודד TRPV4 מהשותפים של היונקים הרגילים שלו, יש לנו הביע TRPV4 עכברוש בשמרי ניצני ^24. ביטוי תפקודי של TRPV4 בהקשר אבולוציונית רחוק זה הראה שזה יכול עדיין להגיב לכוח האוסמוטי ללא שותפים הרגילים שלו. מכיוון ששמרים אינו PUFAs כגון AA או EET, ויש לו את הגנום שלו אין גנים PLA2 או epoxygenase, expre זהssion גם מראה כי הם אינם נדרשים לTRPV4 לחוש בכוח. לאחר TRPV4 באאוקריוטים ביולוגי נוחים ביותר המולקולריים גם מאפשר מניפולציות יעילים קדימה או לאחור גנטיות ^25. (2) עבור ניתוחי biophysical מעמיקים של TRPV4, הבענו TRPV4 ב ביציות Xenopus. שלא כמו תאים בתרבית, אשר יניבו תת Na Na ל( 10 ^-10 ל10 ^-9) זרמים, ביצית מבטאת זרמים בμA של (10 ^-6 ל10 ^-4). אות גדולה בהרבה מעל הרעש מאפשרת כימות והשוואה בטוחה יותר טובות יותר. TRPV4, כך באו לידי ביטוי, יכול גם להיבחן כמולקולות בודדות באמצעות מהדק תיקון. ביצית אחת מאפשרת דגימת תיקון חוזר ונשנה, מה שהופך שוב כימות אמין יותר. מחקרים כאלה הראו כי ערוץ TRPV4 עצמו יכול באופן ישיר להיות מופעל על ידי כוח מתיחת קרום ^14. ניתוח הראה גם כי 14 אללים שלד-דיספלזיה נציג כל מוטציות הרווח של הפונקציה. יתר על כן, degrEE של דליפה ⁺ זה מכונן Ca ² מקביל לחומרת המחלות שלד ^23.

בגלל החידוש והתועלת שלהם, הנהלים מפורטים של שתי שיטות אלה הם התאספו כאן כדי לאפשר משוכפלים במחקר עתידי על TRPV4 או ערוצים דומים.

Protocol

1. שיטות Luminometry השמרים

השתמש BYYT זן של שמר אפייה. זה yvc1-tok1 נגזר של BY4741 (מאטה, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). להפוך לתאים עם pEVP1/Aeq Leu לבחירה להביע aequorin פלסמיד והעכברוש-להביע TRPV4 פלסמיד ura לבחירת p416GPDV4, כפי שתואר בBatiza et al. ²⁶ וLoukin et al. ²⁴ שיטות סטנדרטיות שימוש בבניית פלסמיד ושינוי ²⁷ . זן שמרים ופלסמידים זמינים לפי בקשה.

1. תרבות 2 מיליליטר של שמרי תאי הלילה לשלב שלאחר לוגריתמים שייקרו 30 מעלות צלזיוס בLeu-ura-"DCD" בינוני נשירת ²⁸ (גרסה המדולדלת סולפט של מדיום CMD-Leu-ura ^29), בתוספת סורביטול 1M . לחסן 200 μl של תרבויות אלה לתוך 1.8 מיליליטר של מדיום טרי בתוספת 2 מיקרומטר של lucifericoelenterazine n. לגדול בחושך בטמפרטורת חדר למשך שעה 24 אחרת בלי ללחוץ.
2. מדוד את osmolarity של התרבות (בדרך כלל ב1,400 mOsM) ופתרונות אחרים (להלן) באמצעות osmometer לחץ אדים.
3. Aliquot 20 μl של תרבות הטרי לתוך צינור luminometer 12 מ"מ לluminometer צינור יחיד.
4. להלם hypotonic, להוסיף 200 μl של פתרון, המכיל 25 מ"מ NaEGTA (pH 7.2) או שמות (pH 7.2) ו500-100 mM NaCl, (osmolarity הכולל של 1,200-400 mOsM) בהתאם לרמה של ההלם הרצוי. ברציפות לפקח על הארה לפני ולפחות 120 שניות לאחר downshock האוסמוטי, שנקטע רק על ידי פעולת דילול הקצרה. הירשם פלט luminometer במחשב שולחני כיחידות יחסי הארה (רול).

אמנם לא ללימוד TRPV4 המהונדס, השתמשנו גרסה של הפרוטוקול הנ"ל במערכת אוטומטית לבחון את תגובותיהם של מספר גדול של זני שמרים. o מחקרf התגובות להיפו ³⁰ או ^{31 בגירויי} hyperosmotic של deletome השמרים (האוסף של deletants גן יחיד 4,906 שמרים) באמצעות luminometer microplate וניתחו עם תוכנה מקבילה היו מוצלחות.

2. ו -3. שיטות אלקטרופיזיולוגיה ביצית

אלקטרופיזיולוגיה משתמשת בשיטות בסיסיות ^32. PCR להגביר את המסגרת הפתוחה קריאה של wild-type או TRPV4 מוטציה באמצעות איכות גבוהה פולימראז PfuUtra והשתלב pGH19 ^33. זה כרוך בהחדרה מדויקת של ORF בין 5 'ו 3' UTRs של גן גלובין β Xenopus ומורד הזרם של אמרגן RNA-פולימראז T7. Linearize המבנה במורד הזרם של UTR '3 ומשמש כתבניות בתגובה במבחנה פולימראז T7-RNA. השתמש בטכניקות מולקולרית ביולוגיות סטנדרטיות ^34.

השתמש בביציות V-VI שלב מX. laevis. גידול בעלי חיים, ovariecto חלקישלי, הסרת מעטפת defolliculation, וvitelline בצע את הליכים סטנדרטיים ^32,33,35. הזרק 2-40 ננוגרם של פתרון קרן לביצית באמצעות microinjector האוטומטי דראמונד Nanoinject השני. הזרק ~ 30 ביציות עבור כל קבוצה של ניסויים. לאחר הזרקת TRPV4-קרן, דגירה הביציות במדיום ND96 עם גנטמיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) ורותניום 1 מיקרומטר אדום ^14.

2. שתי אלקטרודה מתח קלאמפ

1. משוך טפטפות הקלטת זכוכית ורוסיליקט מmicropipettes חד פעמי דיוק 100 μl בנפרד עם חולץ פיפטה.
2. משוך את שני מתח מדידה ואלקטרודות פיפטה הזרקה שוטפות נמשכים יש צמצם קצה ~ 1 מיקרומטר קוטר.
3. אלקטרודות למילוי עם 2 M KCl וכתוצאה מכך 0.1-0.2 התנגדות mΩ. לעלות אותם על headstages HS2A, אשר יחד עם מהדק מרחץ מקורקע וירטואלי VG-2Ax100, מחוברים לממשק מגבר GeneClamp 500 דרך digitizer Digidata 1440. לרכוש הנתונים באמצעות תוכנת pClamp10.
4. מניחים את הביצית להיבדק באמבט 1 מיליליטר בתא פלסטיק מפוברק רכוב על הבמה של מיקרוסקופ לנתח עם ההגדלה 20X. פתרון האמבטיה הוא על ידי גשר אגר 3 M KCl וחוט כסף כלור ממוקם קרוב לביצית ומחובר לבמת קרקע הווירטואלית VG-2A-מקורקע וירטואלי.
5. לבנות את החדר לזלוף רציף עם tubings פלסטיק כפתרון כניסה ויציאה. חבר את צינורות היניקה מחוברים למערכת זלוף מפוברקת, שהוא סעפת של שישה פגזים 50 מזרק מיליליטר, כל אחת מלאה בפתרון אחר. שיעורי עדכון כובד של פתרון מסוים הוא נשלט ל~ 2-3 מיליליטר / דקה באמצעות מהדק רמפה "קק" על tubings.
6. הר שני אלקטרודות עם headstages על micromanipulators. לבצע חדירות האלקטרודה של הביצית על ידי מיקרומניפולציה.

3. הצמד תיקון בחינת ישיר Mechanosensitivity

"> השיטות הבסיסיות של מהדק תיקון כולל הכנת פיפטה, היווצרות GΩ-חותם, והיווצרותם של תאים או במצבים נכרת הן אלה בהאמיל et al. ³⁶ ומחולית ^32.

1. מלא טפטפות זכוכית ורוסיליקט עם פתיחה ~ 1 מיקרומטר קוטר בקצה (מספר הבועה 5-6) עם 98 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl _2, ו10 מ"מ K ^+-HEPES, pH 7.2.
2. צרף את פיפטה מהדק תיקון באמצעות צינורות פלסטיק למזרק 5 מ"ל ובאמצעות T-משותף, גם מד לחץ. להשתמש במחשב כדי לטפל בשתי האלקטרודה ותפוקות מד הלחץ. רוכשת את הנתונים ב10 קילוהרץ, ולאחר מכן לנגן דרך מסנן שמונה מוט בסל בקילוהרץ 1 לניתוח.
3. ניתן נכרת מאותה הביצית תיקונים שונים שוב ושוב. נוהג זה הופך את הבדיקה של הפעילות המולקולרית של TRPV4 יותר יעילה ואמינה.

Representative Results

בניסוי luminometry טיפוסי, מגוון של זעזועי hypotonic למטה 400-1,200 mOsM מושגת על ידי הוספת 200 μl של פתרונות הלם osmolarity הנמוך שונה ל20 μl של התרבות ב1,400 mOsM. פעילות TRPV4 לידי ביטוי כאשר RLU של הניסוי הוא בהשוואה לזה של שני פקדים שליליים: תאי שמרים הפכו עם פלסמיד p416GPDV4 הריק או אחד המכיל את גן TRPV4 עם מוטציה במסנן יון (איור 1) ^24.

בניסוי המתח-clamp שתי אלקטרודות טיפוסיות, הביציות בתחילה רחצו בפתרון אמבטיה איזוטוני המכיל זורם (במ"מ) 66 ₄ KMeSO, 1.8 Ba (טווינה _{4) 2,} 5 K ^+-HEPES, (pH 7.2) ו 100 סורביטול. זרמי שיא מוערכים בסוף 100 דופקי בדיקה אלפיות שניים ל+20 mV מפוטנציאל החזקת mV -20 כל 10 שניות. הזרימה לעורר תגובת hypotonic משתנה לפתרון דומה חסר סורביטול. T תגובת hypotonic היא הפיכה עם שובו של סורביטול, כמו גם בלוק על ידי אדום TRP-ערוץ רותניום חוסם (איור 2 א).

בניסוי תיקון מהדק אופייני, משמש פתרון סימטרי, כלומר הפתרון רחץ את התיקון והפתרון למילוי פיפטה הוא אותו הדבר (98 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl _2, ו10 מ"מ K ^+-HEPES, pH 7.2). הנה, את התיקון מבפנים החוצה נכרת מן ביצית ביטוי עכברוש TRPV4 מתקיים ב+50 mV. פולסים של יניקה מופקים מהמזרק. שאיבה קצרה, מאות אלפיות השני בזמן, הוחלו בעשרות מ"מ כספית, לעורר ~ 40 האם של המוליכות אחידים PS קרום הביצית ³⁷ והמוליכות אחידים PS ~ 90 של TRPV4 הביע heterologously (איור 2) ^14.

"Width =" les/ftp_upload/50816/50816fig2.jpg "/> 600px
איור 1. עכברוש TRPV4 הביע בשמרים להגיב להלם hypotonic. (א) תרשים המציג את השיטות הניסיוניות. הלם 750 mOsM hypotonic (ראשי חץ) (ב) מעורר עליית הארה גדולה (ביחידות יחסי הארה, RLU) בtransformants TRPV4, אבל לא בtransformants של פלסמיד ריק, או פלסמיד נושאת TRPV4 עם מוטציה במסננה יון (M680K). (ג) ביחס מנת תגובה בין הלם hypotonic ותגובת השיא (ממוצע + SD, n = 3). מדידות מ2.4 x 10 ⁶ תאים כל ^24. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

0px "/>
איור 2. בדיקות אלקטרו פעילות TRPV4 heterologously הביעו ביציות Xenopus. () תגובות מקרוסקופית שוטפות Whole-ביצית לגירויי hypotonic בדקו עם מהדק מתח שתי אלקטרודות. זרמי שיא מביצית מביעים רמות גבוהות מאוד של TRPV4 wild-type (5 ימים לאחר ההזרקה של 40 ננוגרם של קרנה) על 100 צעדי msec מתח (מ-20 ל+20 mV כל 10 שניות) (הבלעה) בתגובה לפינוי 100 סורביטול מ"מ מפתרון 250 האמבטיה mOsM (ברים פתוחים) והתוספת של 3 אדום רותניום מיקרומטר (RUR; מילא שורה). מאליו הן עליות שיא הנוכחיים חזרו על גירויי hypotonic והירידות שלו על החזרה לתמיסה איזוטונית או התוספת של חוסם הערוץ (RUR). הפעלה ישירה של TRPV4 פראי מהסוג ידי מתיחת קרום ראתה תחת מהדק תיקון (ב '). מדגם של עקבות גלם באיכות ממוצעת מתיקון נכרת מן ביצית expreesssing-TRPV4, מראה activation ידי יניקת 60 מ"מ כספית (זכר נמוך יותר) יחול על תיקון מבפנים החוצה נכרת נערך ב+50 mV. העקבות העליונות מוצגת בבסיס זמן מהיר יותר כדי להראות את המעבר הנוכחי האחיד בין הסגור (C) ושתי רמות פתוחות (O ₁ ו-O ₂₎ ^14. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

כאמור במבוא, השיטות נפוצות ללמוד פונקציות TRPV4 לעתים הסתיימו בסתירות ומחלוקות. שתי קבוצות של שיטות שתוארו כאן מציעות כמה יתרונות והוא יכול להשלים את השיטות הקיימות. למרות שאנו רק לתאר מחקרים על TRPV4, השיטות ניתן להאריך ללמוד תעלות יונים אחרות גם כן.

1. שיטות Luminometry השמרים

יש שמרי ניצני Ca ^{2 +} תגובה-זרם יליד הלם היפו אוסמוטי, כי הוא רגיש על ידי מוטציות המשפיעות על הרכב שומנים ^30. אות זה יכול להימחק עם EGTA החיצוני. chelator זו, עם זאת, אינו מוחק את האות מTRPV4 הביע heterologously ^24, מצביע על כך שהערוץ בא לידי הביטוי בקרום פנימי, סביר להניח ששל reticulum endoplasmic, שממנו Ca ^{2 +} הוא שוחרר לתוך הציטופלסמה על האוסמוטי הלם. תנועה של ביטוי heterologouslyערוצים לא נחקרו בשמרים. יש בשיטה זו ניתנת להארכה לחקר ערוצי TRP אחרים או ערוצי mechanosensitive משוערים אחרים, מבחן קלאציה צריכה להתבצע ואת הנוכחות של המערכת המקורית לזכור.

2A. קלאמפ מתח שתי אלקטרודות

בניגוד לניסוי תיקון מהדק, ניסוי המתח-clamp שתי האלקטרודה מתבצע על ביצית שלמה, לפני הסרת מעטפת vitelline. גם בדיקה מיקרוסקופית וערכי קיבולת מצביעים על כך שקרום הפלזמה הוא לא אחיד כדורי אך invaginated גבוה מתחת לתחום יחסית הקשיח של מעטפת vitelline. לפיכך, הלחץ המכני שנגרם על ידי hyponicity הוא לא פשוט מתח אינפלציוני איזוטרופיים של קרום פלזמה כדורי מורחב. סביר להניח שתוצאות לחץ מהדוחקת של הקרום נגד מעטפת vitelline המגבילה ו / או מהקובץ המצורף cytoplasmic הוקם בשנת הפנים דואר של לחץ האוסמוטי מוגבר.

ביטוי של TRPV4, וערוצים אחרים סביר מסוימים, הוא רעיל לביצית, ככל הנראה עקב ^{2 +} דליפת Ca. לכן חשוב לדגירת הביצית לאחר הזרקת TRPV4-קרנה בנוכחותו של חוסם ערוץ, אדום רותניום ברציפות. מידת ביטוי TRPV4 מציגה השתנות, שהוא לא לגמרי בשליטה ניסיונית. "רווח של הפונקציה" ערוצי TRPV4 מוטציה, אלה שמראים פתיחה ספונטנית משמעותית, באופן שיטתי לידי ביטוי מוקדם יותר לאחר ההזרקה מאשר עמיתו הפראי מסוגם ^23.

2B. הצמד תיקון

ביצית Xenopus מבטאת ערוץ ילידי mechanosensitive, אשר מתקן בכיוון פנימה (~ 50 PS פנימה, ~ 10 PS החוצה). מחקר אחד מצביע על כך שזה הביטוי של TRPC1 ^37. ערוץ ילידים כל הזמן הביע זה מספק כיול עבור TRPV4, הטרוביטוי logous של אשר לא תמיד ניתן לצפות בהצלחה בתיקונים.

ההסתברות של מפגש TRPV4 נוטה להיות גבוהים יותר בביציות לאחר תקופה ארוכה של דגירה, בדרך כלל 3-4 ימים לאחר הזרקת קרנה. דרך יעילה כדי להמשיך היא ראשון לבצע הניסוי של שתי האלקטרודה-מתח-clamp (לעיל), ולוודא כי הביצית מביעה נוכחית מקרוסקופית TRPV4 הספונטני, ולאחר מכן להמשיך להסיר את מעטפת vitelline לפני נטילת תיקוני מדגם מאותו ביצית. ההסתברות של לכידת פעילויות TRPV4 גם יכולה להיות משופרת באמצעות "macropatches", רכוב על pipets עם נודניקים גדולים יותר (מספר בועת 6-7). נראית אש ליטוש טפטפות אלה ³² להיות מועילים בהשגת חותם GΩ. לאחר היווצרות החותם, את התיקון נכרת עשוי להראות התנגדות גבוהה מאוד, מעט מאוד רעש מזוהה בדרך כלל עם ממברנות ביולוגיות, ואין פעילות ילידי ערוצים. זה סיכוי הטוב ביותר בdicates במערך כפולה בממברנה. חשיפה לאוויר קצר, על ידי transiently הרמת פיפטה מעל המניסקוס ידי המיקרומניפולציה יכולה בדרך כלל לשבור את שכבה נוספת לא רצויה. לחלופין, השכבה החיצונית ניתן להסיר בעדינות על ידי נגיעה בנשאה פיפטה נגד חוט של חותם סיליקון הקשוח התלוי באמבטיה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vapor Pressure Osmometer	Wescor	Wescor 5500	Logan, UT, USA
Sirius Single Tube Luminometer	Titertek-Berhold	Sirius	Huntsville, LA, USA
Microplate luminometer	Titertek-Berthold	Mithras LB940	Huntsville, LA, USA
Luminometry software	Titertek-Berthold	MikroWin2000	Huntsville, LA, USA
Patch clamp and software	Axon Instrument	HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software	Union City, CA, USA
Manometer	Bio-Tec		Winooski, VT, USA
Pipette puller	Sutter Instrument Co	Model P-97	Novata, CA, USA
Microinjector	Drummond Scientific	Nanoinject II	Broomall, PA, USA
Luciferin coelenterazine	Invitrogen		Carlsbad, CA, USA
T7 RNA polymerase reaction	Ambion	mMessage mMachine	Austin, TX, USA
Gentamicin	Sigma
Ruthenium red	Sigma
Micropipettes	Drummond	100 microliter micropipets	Broomall, PA, USA
High-fidelity PfuUtra polymerase	Stratagene		La Jolla, CA, USA